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    基因編輯技術(shù):進展與挑戰(zhàn)

    2019-01-28 14:22:23盧俊南褚鑫潘燕平陳映羲溫欒戴俊彪
    中國學(xué)術(shù)期刊文摘 2019年6期
    關(guān)鍵詞:核酸酶堿基課題組

    盧俊南 褚鑫 潘燕平 陳映羲 溫欒 戴俊彪

    生命科學(xué)的迅速發(fā)展使得我們從生物遺傳信息的“讀取”階段進入到后基因組時代,基因組的“改寫”乃至“全新設(shè)計”正逐漸成為現(xiàn)實。以設(shè)計創(chuàng)造新生命體為目標(biāo)的合成生物學(xué)在此背景下迅速發(fā)展,并在醫(yī)藥、制造、能源等領(lǐng)域顯現(xiàn)了巨大的應(yīng)用前景?;蚪M的從頭合成和針對天然基因組的規(guī)模改造分屬合成基因組學(xué)和基因編輯領(lǐng)域,均為當(dāng)前合成生物學(xué)研究的熱點。合成基因組學(xué)涉及基因組的從頭設(shè)計、構(gòu)建和功能表征等,屬于自下而上的生物學(xué)研究策略;而基因編輯側(cè)重于通過對現(xiàn)有基因組進行刪除、替換、插入等分子操作,進而改寫遺傳信息,屬于自上而下的生物學(xué)研究策略。以上兩者的有機結(jié)合將極大地推動生物制造、疾病治療等領(lǐng)域的革新;同時二者也將為后基因組時代,功能基因組學(xué)的研究提供強有力的技術(shù)手段。新生命體系的從頭設(shè)計與合成不僅需要基因組序列的合成、拼接及轉(zhuǎn)移等技術(shù),也需要高效率、低脫靶率的編輯技術(shù)以實現(xiàn)在基因組上進行大規(guī)模的編輯改造。在不斷的探索研究中,基因編輯技術(shù)已經(jīng)從最初依賴細胞自然發(fā)生的同源重組,發(fā)展到幾乎可在任意位點進行的靶向切割,其操作的簡易和高效極大地推動了物種遺傳改造的發(fā)展?;蚓庉嬁蔀楹铣缮倪M一步改造提供手段,為新物種的創(chuàng)造提供更多的可能性。

    1 基因編輯的原理

    基因編輯技術(shù)是對生物體DNA斷裂的現(xiàn)象及其修復(fù)機制的應(yīng)用。作為一種常見的分子生物學(xué)事件,在分裂活躍的哺乳動物細胞中,DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks,DSBs)每天會發(fā)生。DSBs發(fā)生后細胞可以通過多種方式進行修復(fù),包括經(jīng)典的非同源末端修復(fù)(nonhomologous end joining,NHEJ),選擇性末端修復(fù)(alternative end joining,a-EJ),單鏈退火修復(fù)(single-strand annealing,SSA)和同源重組修復(fù)(homologous recombination,HR)。HR可以進行精確無誤的修復(fù),但是需要同源模板的存在;NHEJ則是將很大程度上沒有同源性的兩個DNA末端直接連接實現(xiàn)修復(fù),此過程中,兩個末端在大多數(shù)情況下都會發(fā)生若干核苷酸的缺失,是一種不精確的修復(fù)機制。而作為輔助性的修復(fù)機制,a-EJ和SSA均需要更大幅度的末端單鏈切除,這也會導(dǎo)致遺傳信息的丟失?;贒NA斷裂修復(fù)的原理,如果在細胞中人為提供特定的同源重組模板,待目標(biāo)DNA自然發(fā)生或者人為誘導(dǎo)產(chǎn)生DSBs,觸發(fā)同源重組修復(fù),就有機會把特定DNA序列進行刪除或者插入外源基因。在不提供同源模板的情況下,利用 NHEJ、a-EJ及 SSA的不精確修復(fù)機制可以實現(xiàn)基因的突變和敲除。傳統(tǒng)的基因編輯借助細胞內(nèi)自然發(fā)生的DSBs實現(xiàn)靶向整合,達到基因敲除、替換等目的。然而,在真核生物細胞里面,通過自發(fā)雙鏈斷裂實現(xiàn)目的基因編輯的概率通常低至百萬分之一。人為使用化學(xué)誘導(dǎo)劑或者輻射處理等方法,或者使用轉(zhuǎn)座子技術(shù)也可以實現(xiàn)基因的突變,但是這些突變是隨機的,需要后續(xù)進行大量的篩選工作來獲得所需的基因型。定點基因編輯技術(shù)是進行基因功能研究和物種定向改造的優(yōu)選策略。

    2 重組核酸酶介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)

    2.1 鋅指核酸酶技術(shù)

    人工核酸酶技術(shù)的發(fā)展使人為定點誘導(dǎo)DSBs成為現(xiàn)實,其中鋅指核酸酶技術(shù)(zinc finger nucleases,ZFNs)就是一個里程碑式的突破,也稱為第一代基因編輯技術(shù)。ZFN由鋅指蛋白(zinc finger protein,ZFP)和FokI內(nèi)切酶的核酸酶結(jié)構(gòu)域組成,前者負責(zé)識別,后者負責(zé)切割DNA。ZFP是自然存在的蛋白結(jié)構(gòu),其由鋅指結(jié)構(gòu)(zinc finger,ZF)組成,ZF能識別特定的3個連續(xù)堿基對,因此可通過串聯(lián)ZF的數(shù)量調(diào)整ZFN的識別特異性。FokI通過N端與ZFP連接,由于FokI以二聚體的形式發(fā)揮切割作用,ZFN使用時需要成對設(shè)計。作為新型基因編輯工具,ZFN從2001年開始被陸續(xù)用于不同物種的基因編輯。

    2.2 TALENs技術(shù)

    ZFN技術(shù)將基因編輯引領(lǐng)進了不再單純依賴自然發(fā)生 DSBs的時代,但其存在很大的局限性,如成本高、難以實現(xiàn)多靶點編輯等。而TALE(transcription activator like effector)基序的發(fā)現(xiàn)催生了第二代基因編輯技術(shù)——TALENs(TALE nucleases)。TALEN的構(gòu)造與ZFN類似,由 TALE基序串聯(lián)成決定靶向性的DNA識別模塊,與FokI結(jié)構(gòu)域連接而成。與ZF基序不同,一個 TALE基序識別一個堿基對,因此串聯(lián)的 TALE基序與所識別的堿基對是一一對應(yīng)的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn),對于相同的靶點TALENs有與ZFNs相同的切割效率,但是毒性通常比ZFNs的低,另外其構(gòu)建也比 ZFNs容易。然而,TALENs在尺寸上要比ZFNs大得多,而且有更多的重復(fù)序列,其編碼基因在大腸桿菌中組裝更加困難。

    3 RNA引導(dǎo)的基因編輯技術(shù)

    3.1 CRISPR/Cas9技術(shù)

    CRISPR/Cas系統(tǒng)原本是細菌和古菌進化出來用于抵御外來病毒及質(zhì)粒DNA的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。II型CRISPR/Cas系統(tǒng)依賴于外源DNA片段在規(guī)律成簇的短間隔回文重復(fù)(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)位點整合,其經(jīng)過轉(zhuǎn)錄及剪切后產(chǎn)生短的 CRISPR RNAs(crRNAs),crRNA與反式轉(zhuǎn)錄的crRNA(transactivating crRNA,tracrRNA)退火結(jié)合,然后引導(dǎo) Cas9(CRISPR associated protein 9,Cas9)蛋白介導(dǎo)序列特異性的外源DNA降解。Jinek等發(fā)現(xiàn)Cas9發(fā)揮靶向切割作用所依賴的crRNA和tracrRNA可以融合為一體,作為sgRNA(single guide RNA)。隨后,若干研究組陸續(xù)報道 CRISPR/Cas9系統(tǒng)可用于人類細胞的靶向基因編輯。與ZFNs和TALENs技術(shù)相比,CRISPR/Cas9的設(shè)計要簡單得多,而且成本很低,對于相同的靶點,CRISPR/Cas9有相當(dāng)甚至更好的靶向效率。

    3.2 CRISPR/Cas9衍生技術(shù)

    隨著 CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究不斷深入,Cas9核酸酶的催化機制也被揭示,并且可以通過特定位點氨基酸的突變獲得單鏈靶向剪切功能的Cas9切刻酶(Cas9 nickase,Cas9n)或者全失活的 Cas9(dead Cas9,dCas9),而這些不同的Cas9核酸酶,衍生出了適用范圍更為廣泛的基因編輯系統(tǒng)。

    (1) CRISPR/Cas9-nickase基因編輯技術(shù)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)使用的crRNA能容受一定程度的錯配導(dǎo)致脫靶效應(yīng)的產(chǎn)生,限制了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在高精度編輯中的應(yīng)用。為了提高Cas9編輯系統(tǒng)的精度,Ran等巧妙利用 Cas9 D10A突變體具備切刻酶活性的特性,設(shè)計了“一個位點,雙sgRNA靶向”的策略,即 CRISPR/Cas9-nickase基因編輯技術(shù)。其原理與ZFN和TALEN類似,兩個Cas9n/sgRNA復(fù)合物同時靶向一個位點,分別切割其中一條DNA鏈,實現(xiàn)雙鏈斷裂,誘導(dǎo)NHEJ或者HR修復(fù)。使用這種策略,細胞系中基因編輯的脫靶效率最高可以降低近4個數(shù)量級。

    (2)CRISPR/dCas9-FoKI基因編輯技術(shù)。同樣是為了解決CRISPR/Cas9技術(shù)的脫靶問題,Guilinger等采用了基于 dCas9的策略。理論上dCas9/sgRNA只能起到單純的靶向引導(dǎo)作用,無法誘導(dǎo)DNA的斷裂,類似于ZFN或者TALEN中的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。為了實現(xiàn) DNA的切割,其引入的FoKI核酸內(nèi)切酶的切割結(jié)構(gòu)域,與 dCas9連接做成融合蛋白fCas9,這與ZFN及TALEN的設(shè)計策略如出一轍。在人類細胞的基因編輯中,fCas9的特異性比野生型Cas9要高出140倍以上。而在高度類似的脫靶位點上,fCas9的特異性要比Cas9n至少高出4倍。fCas9的應(yīng)用將進一步豐富Cas9工具箱,提供更完善的基因編輯工具。

    (3)基于 CRISPR/dCas9的單堿基編輯技術(shù)。人類大多數(shù)的遺傳病與基因的點突變有關(guān),如果能通過精確的手段進行修復(fù),可能會帶來新的治療策略。在提供同源重組模板的情況下,定點突變可以通過CRISPR/Cas9來實現(xiàn),但是其誘導(dǎo)的 NHEJ修復(fù)可能帶來的堿基隨機插入、缺失是潛在的危險因素。Cas9的突變體Cas9n、dCas9無切割雙鏈DNA的功能,但可以發(fā)揮尋靶定位作用;如果有能催化特定堿基轉(zhuǎn)換的蛋白/結(jié)構(gòu)域可用,則可參考CRISPR/dCas9-FoKI蛋的設(shè)計,構(gòu)建CRISPR/Cas9n/dCas9導(dǎo)向的單堿基編輯技術(shù)。Liu課題組將源自大鼠的胞嘧啶脫氨酶(APOBEC1)與dCas9融合,發(fā)現(xiàn)其可以定點將C轉(zhuǎn)變?yōu)閁,然后在后續(xù)的DNA復(fù)制或者修復(fù)作用下實現(xiàn)C∶G堿基對到T∶A的轉(zhuǎn)變。隨后日本神戶大學(xué)的Kondo課題組及我國上海交通大學(xué)的常興課題組也報道了類似研究成果。為了實現(xiàn)A∶T到G∶C的轉(zhuǎn)換,Liu課題組采用蛋白質(zhì)進化工程手段對大腸桿菌的 tRNA腺苷脫氨酶(TadA)進行改造,他們獲得的第7代腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editors,ABEs)能高效介導(dǎo) A∶T堿基對到G∶C的轉(zhuǎn)變。即,C到T以及G到A堿基之間的自由轉(zhuǎn)換已經(jīng)實現(xiàn),將來有可能做到4種堿基的任意轉(zhuǎn)換。

    (4)基于 CRISPR/dCas9的基因表達調(diào)控技術(shù)。除了直接對DNA進行編輯,CRISPR/Cas系統(tǒng)在基因表達調(diào)控上也可發(fā)揮作用。例如,利用dCas9無核酸內(nèi)切酶活性但仍能與DNA結(jié)合的特點,可直接阻礙其結(jié)合DNA與其他因子的結(jié)合,影響基因的表達。如果將轉(zhuǎn)錄抑制因子或者激活因子與dCas9融合,則可以實現(xiàn)靶基因的抑制與激活,為基因功能研究提供靈活的操作手段。

    3.3 CRISPR/Cas12a基因編輯技術(shù)

    CRISPR/Cas9技術(shù)受富含G堿基的PAM序列限制,不能實現(xiàn)任意序列的靶向。同時Cas9蛋白分子量過大,某些情況下不便使用。實際上幾乎所有的古細菌和眾多的細菌都采用 CRISPR/Cas機制進行免疫防御,其中包含多種CRISPR/Cas系統(tǒng)。已經(jīng)表征過的Ⅱ類 CRISPR/Cas系統(tǒng),均屬于采用Cas9家族核酸酶作為效應(yīng)因子的Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng),而在普氏菌和弗朗西斯氏菌屬(Prevotella和Francisella1)中存在另一個Ⅱ類CRISPR/Cas系統(tǒng),其被歸為Ⅴ型CRISPR/Cas系統(tǒng)。2015年,張鋒團隊報道 V型系統(tǒng)中的Cpf1(CRISPR from Prevotella and Francisella 1)(現(xiàn)稱“Cas12a”)是有功能的細菌免疫機制并能在人類細胞中介導(dǎo)有效的基因編輯。CRISPR/Cas12a具有CRISPR/Cas9沒有的優(yōu)點,其中之一就是Cas12a需要的是富含T堿基的PAM序列,有助于其在基因組富含A/T堿基的物種中使用。上海科技大學(xué)的陳佳課題組將無 DNA切割活性的dCas12a與大鼠源的胞嘧啶脫氨酶(APOBEC1)融合,發(fā)現(xiàn)其與基于Cas9的堿基編輯器類似,能有效地催化人類細胞中C到T堿基的轉(zhuǎn)換。由于識別的是富含T堿基的PAM序列,基于Cas12a的堿基編輯系統(tǒng)能與基于Cas9的堿基編輯系統(tǒng)互補,為相關(guān)基礎(chǔ)研究及將來的臨床應(yīng)用提供更全面的技術(shù)條件。

    3.4 基于 CRISPR/Cas系統(tǒng)的RNA編輯技術(shù)

    除了對DNA進行編輯,張鋒課題組發(fā)現(xiàn)CRISPR蛋白家族的C2c2(現(xiàn)稱Cas13a)可以靶向切割RNA,隨后他們證實Cas13a可在哺乳動物細胞中靶向降低RNA的水平。利用Cas13a的RNA靶向功能,CRISPR/Cas13a系統(tǒng)被開發(fā)為RNA檢測器用于疾病診斷。張鋒團隊后續(xù)又發(fā)現(xiàn)了Cas13b,其同樣具有RNA靶向和編輯功能。另外,Cas13c和Cas13d也具有類似功能。RNA編輯技術(shù)的建立,進一步拓展了CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)的應(yīng)用范圍。

    4 DNA介導(dǎo)的基因編輯工具

    根據(jù)堿基互補配對原則,及引物設(shè)計原理,Oligo DNA理論上也可以用于引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶靶向切割雙鏈DNA。類似于ZFN和TALEN,可用Oligo DNA替代其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,關(guān)鍵是需要找到Oligo DNA與切割結(jié)構(gòu)域FoKI的合適連接方式?;蛘呤菍ふ翌愃朴贑as9的天然蛋白,本身具備核酸內(nèi)切酶功能,同時能結(jié)合一定長度的引導(dǎo) Oligo DNA。由于DNA本身有更好的穩(wěn)定性,Oligo DNA制備成本低,可以簡化基因編輯的操作程序,Oligo DNA引導(dǎo)的基因編輯工具有其他編輯工具不可比擬的優(yōu)點,值得深入研究開發(fā)。特別是當(dāng)前主流基因編輯工具全為國外專利,對今后國內(nèi)基因編輯相關(guān)產(chǎn)品的上市不利,具備自主知識產(chǎn)權(quán)的基因編輯技術(shù)亟待開發(fā)。

    2016年9月,Genome Biology刊登了我國南京大學(xué)研究團隊研發(fā)的新型基因編輯工具:結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶(structure-guided endonuclease,SGN)。SGN是典型的Oligo DNA引導(dǎo)基因編輯工具,本質(zhì)上也是重組核酸酶的設(shè)計與應(yīng)用。其 N端是能識別 DNA 3′ 末端翹翼(3′ flap)的核酸內(nèi)切酶(flap endonuclease-1,F(xiàn)EN-1),C端則是FoKI核酸內(nèi)切酶的 DNA切割結(jié)構(gòu)域(Fn1)。SGN通過識別引導(dǎo)DNA(guide DNA,gDNA)與特點靶點結(jié)合產(chǎn)生的3′ flap進行定位切割。不同于CRISPR/Cas9及其系列衍生技術(shù),SGN沒有PAM限制,理論上可以靶向任何序列。實驗結(jié)果顯示SGN的切割活性不依賴于靶點的序列,其可用于斑馬魚基因編輯但是效率尚有很大的提升空間。SGN作為我國科學(xué)家的原創(chuàng)性研究結(jié)果,其優(yōu)點無疑顯著,如:gDNA非常容易獲得并且可根據(jù)需要精確控制其用量;可以通過調(diào)整 gDNA的長度將錯配的可能降到最低等。

    5 我國基因編輯技術(shù)發(fā)展面臨的挑戰(zhàn)與機遇

    近年來,我國在基因編輯技術(shù)方面取得了矚目的進展。但是我們要清醒地認識到,目前基因編輯,尤其是 CRISPR/Cas9相關(guān)的核心專利基本都是掌握在其他國家手中。未來基因編輯技術(shù)及基因編輯的細胞制品等走向臨床應(yīng)用,以及基因編輯農(nóng)作物走向市場所產(chǎn)生的巨大利潤都會因此而受到重大損失。開發(fā)具備自主知識產(chǎn)權(quán)的核心技術(shù)才有可能在這場生物技術(shù)革命中獲得發(fā)展,包括對現(xiàn)有基因編輯技術(shù)的缺陷進行修正,以及通過技術(shù)組合等,搶先獲得現(xiàn)有基因編輯技術(shù)的改進版本和增強版。同時也借助生物信息學(xué)手段挖掘潛在的CRISPR核酸酶和DNA引導(dǎo)的核酸酶等,開發(fā)新型基因編輯技術(shù)。此外,基因編輯技術(shù),尤其是CRISPR/Cas技術(shù)已經(jīng)廣泛用于各物種的基因編輯,除了常見的模式生物,如線蟲、果蠅、斑馬魚、小鼠等,還有豬、狗、猴等大型動物,以及水稻、小麥等常見農(nóng)作物。將現(xiàn)有基因編輯技術(shù)拓展到其他生物也是新的突破,尤其對于我國特有的生物資源,其過程往往涉及技術(shù)的調(diào)整和改進,一方面可以產(chǎn)生新的技術(shù),另一方面可為目標(biāo)生物的功能基因組研究以及遺傳改良提供有效手段。

    目前,CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)已經(jīng)顯示巨大的應(yīng)用價值,但是其在編輯效率、精確度及脫靶效應(yīng)等方面,以及其走向臨床應(yīng)用等尚有很多問題需要解決。病毒載體可應(yīng)用于人類基因治療,但是其裝載容量有限,常規(guī)的Cas9蛋白過大,不利于使用。一方面可以從自然界尋找更小的Cas9蛋白,另一方面可以通過基因工程手段進行適當(dāng)?shù)膭h減。而在減少脫靶效應(yīng)方面,除了上述提到的 CRISPR/Cas9-nickase和 CRISPR/dCas9-FoKI基因編輯技術(shù),還可以對Cas9蛋白本身進行定點突變等來增強其特異性。這些工作充滿著挑戰(zhàn)性,但也是我們發(fā)展的機遇和突破口。

    近年來,我國科學(xué)家在基因編輯領(lǐng)域取得了長足進展。上述提及常興課題組和陳佳課題組在堿基編輯技術(shù)上的突破,此外,哈爾濱工業(yè)大學(xué)黃志偉課題組和中國科學(xué)院生物物理研究所王艷麗課題組在Cas/sgRNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解釋上也作出了突出貢獻,可為基因編輯原理的理解提供重要參考。中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞課題組等則在植物基因編輯上取得重要進展。中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學(xué)課題組、昆明理工大學(xué)季維智課題組、中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所楊輝課題組等,利用基因編輯技術(shù)成功獲得多種疾病動物模型。我國在新型基因編輯技術(shù)開發(fā)上也取得了一定突破,DNA引導(dǎo)的基因編輯技術(shù)有著獨特的優(yōu)勢,值得加大投入以解決編輯效率低等問題。

    此外,合成生物學(xué)作為新近迅速發(fā)展的交叉學(xué)科,已在生物醫(yī)藥、能源、新材料等領(lǐng)域展現(xiàn)越來越廣泛的應(yīng)用潛力?;蚪M合成和基因編輯,涉及的操作廣度、深度不同,技術(shù)體系也不同。但其本質(zhì)上都是通過遺傳改造,獲得具有特定功能的生命體,服務(wù)科研與生產(chǎn),二者有機融合是水到渠成的趨勢。比如,在合成的基因組中可以引入基因編輯體系,為新生物體進一步改造及應(yīng)用提供更多的可能性。SCRaMbLE(synthetic chromosome rearrangement and modification byloxP-mediated evolution)是一種快速的染色體重排修飾技術(shù),可以加速生物體的進化,其本質(zhì)上是一種非定點的誘導(dǎo)型基因編輯技術(shù)。生物的進化往往需要漫長的歷史過程,難以快速獲得具備某類性狀的物種。合成生物學(xué)可以通過基因組設(shè)計,引入特定的功能模塊,以獲得目標(biāo)工程細胞;然而,基于目前的成本和技術(shù)限制,盡管可以有很多候選基因組設(shè)計,想要獲得一個大容量合成細胞庫并從中篩選獲得最優(yōu)設(shè)計的可能性不大。而SCRaMbLE是一種潛在的高性價比手段。Sc2.0計劃擬在合成的酵母基因組中插入約 5000個loxPysm位點。該計劃近期發(fā)表的系列成果表明,SCRaMbLE系統(tǒng)可以誘導(dǎo)獲得增強型工業(yè)用酵母菌株,提目標(biāo)代謝物的產(chǎn)量等。

    當(dāng)前,首個全人工合成的真核生物——Sc2.0已經(jīng)接近完成,更高等生物的全基因組合成也已經(jīng)提上日程。然而,超大基因組的合成尚有很多挑戰(zhàn)。通過基因編輯對現(xiàn)有物種進行局部基因組改造實際為傳統(tǒng)基因工程的升級,其不大可能實現(xiàn)全面的基因組改寫。就目前而言,基因組合成與基因組編輯的結(jié)合將是一個十分具有潛力的研究方向,可解決目前超大基因組從頭合成面臨的各項困難,為合成基因組學(xué)在超大基因組物種基礎(chǔ)研究及物種改造中的應(yīng)用提供可能。這也是我國在合成生物學(xué)領(lǐng)域及基因編輯領(lǐng)域可以把握的契機。

    (摘自《中國科學(xué)院院刊》2018年第11期)

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