不同精油的抑菌效果及協(xié)同作用研究

王康莉，張玲玲，袁火花， 李 慧， 楊彩梅,*

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 動物科技學(xué)院，浙江臨安311300；2.浙江萬方生物科技有限公司，浙江安吉313307）

精油是一種具有揮發(fā)性的帶有強烈芳香氣味的液體物質(zhì)，其根據(jù)植物的不同部位通過不同的提取方法（水蒸氣蒸餾、擠壓、冷浸、超臨界CO2萃取等）（胡位榮等，2014；張俊霞等，2013；余先純等，2010）提煉而成，其pH呈中性或者酸性。按照精油的化學(xué)組成，可以將精油分為四大類：萜烯類化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物、含氮和硫化合物。精油不溶于水，易溶于有機溶劑，如石油醚、乙醇等。精油作為一個潛在抗生素替代物，目前已受到廣泛關(guān)注，在畜牧業(yè)中常用的精油主要有肉桂醛、百里香酚和香蘭素。肉桂醛對金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）、 大腸桿菌（Escherichia coli）和鼠傷寒沙門氏菌 （Salmonella typhimu-rium）、產(chǎn)氣夾膜梭狀芽孢桿菌（Clostridium perfringens）有很強的抑菌作用。薛京昌等（2013）研究表明肉桂醛對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的生長均有較強的抑制能力，且存在劑量反應(yīng)，隨著其濃度的增大而增強。百里香酚對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌 （Salmonella typhimu-rium）（韓乾杰等，2017；王改琴等，2014；Bassol等，2012；劉猛，2011；Moon等，2006）、產(chǎn)氣夾膜梭狀芽孢桿菌（韓乾杰等，2017）有很強的抑菌作用。有研究表明，百里香酚能夠降低仔豬空腸梭菌和鏈球菌的數(shù)量，提高其空腸和盲腸乳酸桿菌的數(shù)量 （Michiels等，2009）。香蘭素對不同菌種的抑菌效果不同，尤其對大腸桿菌的抑菌效果更好（Moon等，2006）。目前，對于精油抑菌作用雖有一定的研究，但是對不同精油的抑菌作用的比較以及不同精油復(fù)合的協(xié)同作用方面研究較少，本試驗的主要目的是研究不同精油之間的協(xié)同作用，為精油的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 試驗材料 肉桂醛（淡黃色液體）、百里香酚（無色半透明結(jié)晶）、香蘭素（白色粉末）和試驗中涉及到的試劑及其器材均由浙江萬方科技有限公司提供。大腸桿菌K88（ATCC25922），金黃色葡萄球菌（ATCC25923），購自中國菌種保藏中心。沙門氏菌（CMCC50094），購自廣東省微生物菌種保藏中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 懸浮液的制備 分別將大腸桿菌K88、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌接種在營養(yǎng)瓊脂上，于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，挑取活化的細(xì)菌菌落，營養(yǎng)瓊脂劃線培養(yǎng)24 h，用無菌水將菌落洗脫下來，充分振蕩，采用平板培養(yǎng)計數(shù)法測定細(xì)菌數(shù)量，再制成106～107cfu/mL的懸浮液。

1.2.2 抑菌圈測定 采用牛津杯法測抑菌圈的直徑大小，將規(guī)格完全一致的滅菌牛津杯置于含菌的瓊脂平板上，在牛津杯中加入一定濃度的精油，培養(yǎng)一段時間后，會在牛津杯周圍出現(xiàn)透明的無菌生長區(qū)，稱抑菌圈。三種精油的濃度均為10mg/mL，復(fù)合精油的抑菌圈測定時分別加入不同混合比例的復(fù)合精油。采用95%乙醇作為對照。在單一精油測得的抑菌圈直徑，每個菌種做3個平行樣，放入37℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h。重復(fù)3次。根據(jù)抑菌圈直徑結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)（王改琴等，2014）：抑菌圈直徑大于20mm為極度敏感，直徑15～20mm為高度敏感；直徑10～15mm為中度敏感；直徑7～9 mm為低度敏感；抑菌圈直徑＜7 mm為不敏感；直徑越大，抗菌活性越強。

1.2.3 最小抑菌濃度 采用試管二倍稀釋法測定精油對不同菌的最小抑菌濃度（MIC），每個菌種做3組平行，重復(fù)3次。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，抑菌圈直徑表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”，MIC以平均數(shù)表示。

2 試驗結(jié)果及分析

2.1 不同精油的抑菌圈直徑及最小抑菌濃度

2.1.1 肉桂醛、百里香酚、香蘭素的抑菌圈直徑 表1結(jié)果表明，百里香酚和肉桂醛的濃度為10mg/mL時，其抑菌圈直徑均大于20mm，表現(xiàn)為高度敏感，表明百里香酚和肉桂醛再此濃度下對3種菌均有很強的抑制作用。大腸桿菌對于濃度為10mg/mL香蘭素為中度敏感，抑菌圈直徑為14.8 mm，沙門氏菌和金黃色葡萄球菌對此濃度下的香蘭素為高度敏感，抑菌圈直徑大于15mm。表明香蘭素濃度為10mg/mL時有一定的抑菌作用。

2.1.2 肉桂醛、百里香酚、香蘭素的最小抑菌濃度 表2的結(jié)果表明，百里香酚對大腸桿菌K88和金黃色葡萄球菌的MIC都是0.156 mg/mL，對沙門氏菌的MIC是0.313mg/mL。肉桂醛對大腸桿菌K88、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的MIC是0.156mg/mL。香蘭素對大腸桿菌K88、沙門氏菌的MIC都是0.625 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC是1.25 mg/mL。試驗結(jié)果表明：肉桂醛、百里香酚和香蘭素對3種菌均有抑制作用，百里香酚和肉桂醛的抑菌效果優(yōu)于香蘭素。肉桂醛對沙門氏菌的抑菌效果優(yōu)于百里香酚。

2.2 肉桂醛、百里香酚、香蘭素復(fù)配的抑菌效果

表1 三種精油對不同菌的抑菌圈直徑mm

表2 三種精油對不同菌的最小抑菌濃度（M IC）mg/mL

2.2.1 百里香酚與香蘭素復(fù)配的抑菌圈直徑及最小抑菌濃度

2.2.1.1 百里香酚與香蘭素復(fù)配的抑菌圈直徑由表3可知，百里香酚與香蘭素復(fù)配的抑菌直徑隨百里香酚所占比例而不同，兩種精油復(fù)配后的抑菌效果明顯優(yōu)于單獨使用香蘭素，百里香酚與香蘭素質(zhì)量比為4∶1時，其抑菌效果比單獨使用香蘭素時顯著增強，對3種致病菌都表現(xiàn)出極度敏感。表明香蘭素與百里香酚具有一定的協(xié)同作用。

表3 復(fù)合精油（百里：香蘭）抑菌圈直徑mm

2.2.1.2 百里香酚與香蘭素復(fù)配的最小抑菌濃度從表4結(jié)果表明，百里香酚和香蘭素復(fù)配中，MIC結(jié)果與抑菌直徑的結(jié)果基本一致，對3種致病菌抑制作用最強的質(zhì)量比是4∶1和6∶1。

2.2.2 百里香酚與肉桂醛復(fù)配后的抑菌圈直徑及最小抑菌濃度

2.2.2.1 百里香酚與肉桂醛復(fù)配的抑菌圈直徑由表5可知，兩者復(fù)配后對于大腸桿菌，沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用比單獨添加時無明顯提高，表明百里香酚與肉桂醛復(fù)配無明顯協(xié)同作用。對于沙門氏菌，百里香酚與肉桂醛復(fù)配的抑菌效果弱于單一精油。對于金黃色葡萄球菌，2種精油復(fù)合的抑菌效果無明顯增強，試驗結(jié)果表明百里香酚與肉桂醛復(fù)配對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌無明顯協(xié)同作用。

表4 復(fù)合精油（百里∶香蘭）的最小抑菌濃度（MIC）mg/mL

表5 復(fù)合精油（百里∶肉桂）抑菌圈直徑mm

2.2.2.2 百里香酚與肉桂醛復(fù)配的最小抑菌濃度由表6可知，百里香酚與肉桂醛復(fù)配時，質(zhì)量比為4∶1 時，MIC 最低。

2.2.3 肉桂醛與香蘭素的抑菌圈直徑及最小抑菌濃度

2.2.3.1 肉桂醛與香蘭素的抑菌圈直徑 由表7可知，肉桂醛和香蘭素復(fù)合后，質(zhì)量比為 2∶1、4∶1、6∶1時，抑菌圈直徑都大于20 mm，對3種細(xì)菌都表現(xiàn)出極度敏感。隨著肉桂醛濃度占比的增加，其抑菌圈直徑增大，存在劑量反應(yīng)。肉桂醛和香蘭素復(fù)合后的抑菌圈直徑均大于香蘭素單獨使用時，表明肉桂醛和香蘭素復(fù)合具有協(xié)同作用。

表7 復(fù)合精油（肉桂∶香蘭）抑菌圈直徑mm

2.2.3.2 肉桂醛與香蘭素的最小抑菌濃度 由表8可知，肉桂醛與香蘭素復(fù)配在質(zhì)量比4∶1時，對三種菌的抑菌作用最強，最小抑菌濃度為0.156mg/mL。

表8 復(fù)合精油（肉桂：香蘭）的最小抑菌濃度（M IC）mg/mL

3 討論

3.1 單一精油的抑菌作用 植物精油作為一個安全的綠色飼料添加劑受到廣泛關(guān)注，對天然植物精油的研究較多，在三種飼用植物精油及其主要成分對豬源致病菌的抑菌作用研究中表明，肉桂油、牛至油和百里香油及其主要成分對大腸桿菌K88和霍亂沙門菌A72有著很強的抑制作用，其抑菌活性為肉桂油＞百里香酚＞牛至油（王中興等，2014）。有研究發(fā)現(xiàn)，在無氧條件下，香芹酚、肉桂醛、檸檬醛、檸檬烯和百里香酚對產(chǎn)氣莢膜梭菌有抑制作用（Ouwehand等，2010）。體外試驗證明，如果將馬鞭草精油與氨基糖類抗生素混用，可以增強其抗生素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑制作用（Barreto等，2014）。香蘭素在食品貯藏保鮮中的應(yīng)用研究中得出香蘭素有著較強的抑菌作用（呂佳煜等，2015）。通過體外抑菌試驗研究羅勒精油、茶樹油、百里香精油等13種植物精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑根霉、園弧青霉、總狀毛霉、釀酒酵母等有害微生物的抗菌作用，結(jié)果表明，百里香精油和肉桂精油抑菌活性較強（柴向華等，2016）。在21日齡斷奶仔豬的飼料中添加1 g/kg刺五加精油的研究中，發(fā)現(xiàn)刺五加精油能夠顯著降低仔豬腸道內(nèi)的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的含量（Fang等，2009）。在斷奶仔豬日糧中添加香芹酚和百里香酚，仔豬腸道乳酸桿菌種群增多，空腸腸球菌屬和大腸桿菌數(shù)量減少（阮棟，2017）。本試驗選取的精油產(chǎn)品是化工合成精油，結(jié)果表明化工合成的肉桂醛、百里香酚、香蘭素均具有較強的抑菌作用，抑菌效果為肉桂醛＞百里香酚＞香蘭素。

3.2 復(fù)合精油的抑菌作用 通過水蒸氣蒸餾提取肉桂、丁香、連翹三種香辛料揮發(fā)油的方法，分別測定了其單一作用和其兩兩復(fù)合對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑和MIC，結(jié)果表明，三種揮發(fā)油對兩種菌均有較強的抑制作用，肉桂和丁香，肉桂和連翹復(fù)合而成的復(fù)合精油對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出協(xié)同增強的作用，而丁香和連翹復(fù)合對兩種菌無協(xié)同作用（黃涵年等，2016）。通過研究迷迭香精油和肉桂精油抗菌活性中研究中得出兩種精油聯(lián)合使用時對白色念珠菌有協(xié)同增效作用，并且在肉桂和迷迭精油的混合比例為1∶7、1∶9時對黑曲霉表現(xiàn)出拮抗作用 （賈佳等，2015）。研究表明，丁香酚 3mg、百里香酚 3mg、香芹酚2mg復(fù)合成的植物精油方劑，對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌都有一定的抑制作用。張志杰等（2011）報道，植物精油與復(fù)合酶制劑復(fù)合使用，能夠提高肉雞的生長性能，對其球蟲病有著很好的改善作用 （趙文靜，2017）。研究結(jié)果表明，將苯甲酸與百里香酚復(fù)合，該復(fù)合物可有效降低斷奶仔豬腹瀉率，并增加回腸中乳酸菌及盲腸中丁酸的數(shù)量（張志杰等，2011）。從植物精油與丁酸鈉的體外協(xié)同抑菌效果研究中得出，丁酸鈉和植物精油有著協(xié)同增效的作用（韓乾杰等，2017）。雖然精油體外抑菌效果的研究已有較多的報道，但對化工合成的精油如百里香酚、肉桂醛、香蘭素的抑菌作用研究較少，本試驗研究了百里香酚與肉桂醛、百里香酚與香蘭素、肉桂醛與香蘭素不同復(fù)配比例下對大腸桿菌K88、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果，從而得出對這3種致病菌具有最佳抑菌效果的復(fù)合精油比例。本研究的結(jié)果表明，香蘭素與肉桂醛、香蘭素與百里香酚復(fù)合具有協(xié)同抑菌的作用，但肉桂醛與百里香酚復(fù)合無明顯協(xié)同作用，其原因可能在于在本試驗中，肉桂醛與百里香酚單獨使用時對3種致病菌已具有極強的抑菌作用，所以兩者復(fù)合沒有表現(xiàn)協(xié)同，如果降低精油的濃度，肉桂醛與百里香酚也可以具有協(xié)同作用，不同濃度精油的抑菌作用和協(xié)同作用還需要進一步研究。本次試驗只研究了部分比例復(fù)合的精油，其他比例復(fù)合可能有或者更好的抑菌和協(xié)同效果。

4 結(jié)論

單一精油的測定結(jié)果表明，百里香酚和肉桂醛對大腸桿菌K88、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌能力強于香蘭素。

當(dāng)百里香酚與肉桂醛復(fù)合比例為4∶1時，對大腸桿菌K88的抑菌效果最佳；當(dāng)肉桂醛與香蘭素的復(fù)合比例為4∶1時，對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果最佳。