豆粕替代魚粉并添加精氨酸對點帶石斑魚消化酶活性和腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

陳思琦， 程鎮(zhèn)燕， 安貿(mào)麟， 方珍珍， 王慶奎

（天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津300384）

點帶石斑魚（Epinephelusmalabaricus）隸屬于硬骨魚綱、鱸形目、鮨科（Serranidae），石斑魚屬其蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低，包含多種必需氨基酸、多種無機鹽和微量元素以及各種維生素，近年來，被我國東南沿海的水產(chǎn)養(yǎng)殖群體視為重要的水產(chǎn)品之一，但隨著水產(chǎn)動物對魚粉需求量的增大和全球魚粉的產(chǎn)量下降，魚粉價格直線攀升，相應(yīng)的飼料成本也居高不下（葉元土等，2013），因此尋找到節(jié)約飼料魚粉用量的適宜途徑成為點帶石斑魚配合飼料開發(fā)的研究熱點及難點。

目前節(jié)約飼料魚粉用量的主要途徑是尋找適宜的替代蛋白源及利用脂肪或糖類對蛋白的節(jié)約作用等方面，其中開發(fā)植物蛋白源替代魚粉的研究則是較為活躍的部分。由于豆粕與其他植物蛋白源相比具有蛋白質(zhì)含量較高、消化吸收率高、氨基酸組成較為平衡、價格合理和資源豐富等優(yōu)點，一直以來都被視為理想的動物蛋白源替代品。但由于豆粕其本身含有較多抗?fàn)I養(yǎng)因子及適口性較差，致使其在水產(chǎn)動物飼料中的應(yīng)用受到限制。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)石斑魚飼料中豆粕替代魚粉比例為10%～15%時，對其生長無顯著影響（羅智等，2004）。而且，大量的研究已經(jīng)表明，用植物蛋白源替代魚粉，不但會降低魚體增重，還會影響腸道的組織結(jié)構(gòu)和功能，主要表現(xiàn)為皺襞高度降低、頂端脫落、固有層加寬等，導(dǎo)致其病理學(xué)和免疫方面發(fā)生相應(yīng)變化（Krogdahl等，2015；張錦秀，2003），因此，尋找如何提高植物蛋白替代魚粉的比例而又不危害水產(chǎn)動物的生長及健康是亟待解決的問題。

研究表明，精氨酸及其代謝產(chǎn)物一氧化氮（NO）、鳥氨酸、瓜氨酸等在動物免疫防御、維持和保護腸道黏膜等方面發(fā)揮著重要的作用（Wu，2013；Gurbuz等，1998）。作為魚類的必需氨基酸，精氨酸在魚類營養(yǎng)代謝及免疫系統(tǒng)也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能 （Pohlenz 等，2012；Cheng 等，2012、2011）。在對黃顙魚及斜帶石斑魚的研究表明，飼料中適宜的精氨酸水平能有效改善魚體生長性能，提高其腸道蛋白酶和淀粉酶的活性，增加皺襞高度和肌層厚度，對魚體的消化產(chǎn)生有利影響（陳啟明，2016；遲淑艷等，2016）。本試驗在不同豆粕替代水平下添加精氨酸研究其對石斑魚消化酶活力和腸道結(jié)構(gòu)的影響，旨在為優(yōu)化點帶石斑魚人工配合飼料提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料 本試驗采用3×3雙因素試驗設(shè)計，以魚粉、豆粕、蝦粉和谷朊粉為蛋白源，魚油和豆油為脂肪源，其中豆粕替代魚粉蛋白的水平分別為20%、30%、40%，精氨酸添加水平為0%、0.5%、1%，添加維生素和礦物質(zhì)，并用甘氨酸來調(diào)節(jié)氮平衡，配制9種蛋白質(zhì)為50%、脂肪為12%、能量為20 kJ/g的等氮等能試驗飼料。記為D1（20%/0%）、D2（20%/0.5%）、D3（20%/1%）、D4（30%/0%）、D5（30%/0.5%）、D6（30%/1%）、D7（40%/0%）、D8（40%/0.5%）、D9（40%/1%）。 所有干性原料都經(jīng)過粉碎機多次研磨粉碎后，過60目篩，原料逐級混勻后加入魚油和豆油，再次混勻后加適量水，經(jīng)飼料顆粒機制成直徑為2mm的顆粒飼料，晾干后裝入自封袋，-20℃保存?zhèn)溆?。具體試驗飼料配方及營養(yǎng)成分見表1，各原料及魚體的必需氨基酸含量見表2。

1.2 試驗魚 試驗魚為天津市海發(fā)珍品實業(yè)發(fā)展有限公司提供的同一批魚種，選取1350尾體質(zhì)健壯、規(guī)格相同，個體體重（47.91±3.54）g 的點帶石斑魚，平均分為9組，每組3個重復(fù)，分別記為D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8、D9，每箱放養(yǎng) 50 尾，采用全封閉內(nèi)循環(huán)海水養(yǎng)殖系統(tǒng)，飼養(yǎng)于直徑為1m，高為50 cm的養(yǎng)殖缸中，正式試驗前，試驗魚先用基礎(chǔ)飼料馴化7 d。每天早上清除缸內(nèi)糞便，并換水，每天換水量為總水量的1/3。飼養(yǎng)試驗進行10周，期間，每天飽食投喂2次 （09：00和16：30），養(yǎng)殖試驗期間水體溫度為26～29℃，溶解氧濃度為8.0～10.0mg/L，pH為7.5～7.7。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平

表2 魚體及飼料原料氨基酸含量（干物質(zhì)基礎(chǔ)）%

1.3 樣本采集 養(yǎng)殖試驗結(jié)束時，試驗魚禁食24 h，每個箱中隨機取5尾魚，解剖取胃、前腸、中腸及后腸，每組隨機選取前、中、后腸各3個樣品用0.85%的生理鹽水清洗后分別置于Bouin氏液中固定，8 h后取出移入70%乙醇中保存以用于后續(xù)腸道組織結(jié)構(gòu)分析，剩余的樣品分裝于相應(yīng)編號的密封袋，迅速轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱內(nèi)保存，以用于消化酶活力的測定。

1.4 試驗方法

1.4.1 粗酶液的制備 將采樣的各種組織在冰生理鹽水中洗凈，用濾紙吸干組織表面生理鹽水，置于離心管內(nèi)，用移液管移入9倍于組織塊質(zhì)量的0.85%生理鹽水，勻漿，在4℃下4500 r/min離心15min，取上層清液備用。

1.4.2 生化指標(biāo)檢測 采用試劑盒 （南京建成生物工程研究所）對腸道、胃中的蛋白酶活性、淀粉酶活性和脂肪酶活性進行測定。

1.4.3 腸道結(jié)構(gòu)的觀察 將存放于70%乙醇中的組織取出，叔丁醇逐級脫水，常規(guī)石蠟包埋切片，厚度5～6μm，H·E染色，中性樹膠封片。采用Motic BA600-4數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)高精度掃描切片并保存。之后用Motic數(shù)字切片助理Lite 1.0觀察組織并進行測量，每張切片測定10個視野，以得到的均值作為測定數(shù)據(jù)進行分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并利用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行雙因素方差分析（two-way ANOVA），當(dāng)有交互作用時，用單因素方差分析（one-way ANOVA），若差異達到顯著水平（P＜0.05），則進行Tukey法多重比較。

2 結(jié)果

2.1 豆粕替代魚粉并添加精氨酸對點帶石斑魚組織消化酶活性影響

2.1.1 豆粕替代魚粉并添加精氨酸對點帶石斑魚蛋白酶活性的影響 由表3可以看出，豆粕替代水平和精氨酸添加水平的交互作用對點帶石斑魚前腸和后腸的蛋白酶活性影響顯著（P＜0.05），對點帶石斑魚中腸、胃的蛋白酶活性無明顯影響（P＞0.05）；豆粕替代水平對后腸蛋白酶活性影響顯著（P＜0.05），對前腸、中腸、胃蛋白酶活性影響不顯著（P＞0.05）；精氨酸添加水平對前腸、中腸蛋白酶活性影響顯著（P＜0.05），對后腸、胃蛋白酶活性影響不顯著（P＞0.05）。在精氨酸添加量為0%時，后腸蛋白酶活性隨著替代水平的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，30%豆粕替代組比20%替代組提高了85.1%，比40%豆粕替代組提高了174%；40%替代組則比20%替代組降低了48%，在0.5%和1%精氨酸添加組中，隨豆粕替代水平的升高，后腸蛋白酶活性在各組間無顯著差異（P＞0.05）。在20%豆粕替代組中，0.5%精氨酸添加組較0%和1%組分別提高了56.7%和54.4%（P＜0.05），但是30%和40%豆粕替代水平間，各組別差異不顯著（P＞0.05）。

表3 豆粕替代魚粉并添加精氨酸對點帶石斑魚蛋白酶活性的影響U/g prot

2.1.2 豆粕替代魚粉并添加精氨酸對點帶石斑魚淀粉酶活性的影響 由表4可以看出，豆粕替代水平和精氨酸添加水平的交互作用顯著影響了點帶石斑魚中腸淀粉酶活性（P＜0.05），對前腸、后腸、胃淀粉酶無顯著影響（P＞0.05），在D9組（豆粕替代水平40%，精氨酸添加水平1%）時，中腸淀粉酶活性達到最高。豆粕替代水平和精氨酸補充水平對前腸、中腸、后腸的淀粉酶活性均無顯著影響（P＞0.05），精氨酸添加水平對胃淀粉酶活性無顯著影響（P＞0.05），而豆粕替代水平對胃淀粉酶活性有顯著影響（P＜0.05）。隨豆粕替代水平增加，胃淀粉酶活性降低，同一精氨酸補充水平下，40%替代組胃淀粉酶活性顯著低于20%替代組及30%替代組（P＜0.05），20%和30%替代組胃淀粉酶活性沒有顯著差異（P＞0.05），當(dāng)精氨酸添加量為1%時，30%替代組胃淀粉酶活性比20%替代組降低了27.5%，40%替代組比20%替代組降低了72.5%。精氨酸添加水平對各組織淀粉酶活性無顯著影響（P ＞ 0.05）。

表4 豆粕替代魚粉并添加精氨酸對點帶石斑魚淀粉酶活性的影響 U/gprot

2.1.3 豆粕替代魚粉并添加精氨酸對點帶石斑魚脂肪酶活性的影響 由表5可知，豆粕替代水平和精氨酸添加水平的交互作用對后腸脂肪酶活性存在顯著影響，對其他組織無明顯影響 （P＞0.05）。豆粕替代水平對后腸脂肪酶活性存在顯著影響（P＜0.05），對前腸、中腸、胃脂肪酶活性無顯著影響（P＞0.05）。隨豆粕替代水平升高，后腸脂肪酶活性顯著升高，在40%替代組最高，在0%、0.5%精氨酸添加水平下分別比30%替代組提高45.2%、81.3%（P＞0.05），均顯著高于20%替代組（P＜0.05）；而隨著精氨酸添加水平的增加，后腸脂肪酶活性先上升后顯著下降，當(dāng)替代水平為40%，精氨酸添加水平為0.5%時，后腸脂肪酶活性達到最佳。精氨酸添加水平顯著影響了中腸的脂肪酶活性（P＜0.05），隨精氨酸添加水平升高，中腸脂肪酶活性顯著升高（P＜0.05），當(dāng)豆粕替代水平為40%，精氨酸添加水平為1%時，中腸的脂肪酶活性最佳；豆粕替代水平和精氨酸添加水平均對前腸和胃的脂肪酶活性沒有顯著影響（P＞0.05）。

表5 豆粕替代魚粉并添加精氨酸對點帶石斑魚脂肪酶活性的影響U/g prot

2.2 豆粕替代魚粉并添加精氨酸對點帶石斑魚腸道結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 豆粕替代魚粉并添加精氨酸對點帶石斑魚前腸結(jié)構(gòu)的影響 由表6可看出，豆粕替代水平和精氨酸添加水平以及兩者的交互作用均對點帶石斑魚前腸的肌層厚度和皺襞高度存在顯著影響（P＜0.05），對點帶石斑魚前腸的黏膜下層厚度和上皮細胞寬度無明顯影響（P＞0.05）。隨豆粕替代水平的升高，肌層厚度和皺襞高度均先升高后降低，在30%替代組最高，與20%替代組無明顯差異（P ＞ 0.05），均顯著高于 40%替代組（P ＜ 0.05）。 隨精氨酸添加水平升高，肌層厚度顯著升高 （P＜0.05）；而隨精氨酸添加水平升高，肌層厚度和皺襞高度顯著增加（P＜0.05）。黏膜下層厚度和上皮細胞寬度不受替代水平和精氨酸添加水平的影響，黏膜下層厚度最大值發(fā)生在豆粕替代水平為20%，精氨酸添加水平為1%時，上皮細胞寬度在各處理組之間沒有顯著差異（P＞0.05）。

表6 豆粕替代魚粉并添加精氨酸對點帶石斑魚前腸結(jié)構(gòu)的影響 μm

2.2.2 豆粕替代魚粉并添加精氨酸對點帶石斑魚中腸結(jié)構(gòu)的影響 由表7可看出，豆粕替代水平和精氨酸添加水平的交互作用對點帶石斑魚中腸的肌層厚度、上皮細胞寬度和皺襞高度存在顯著影響（P＜0.05），其中，豆粕替代水平顯著影響了中腸肌層厚度（P＜0.05），對其他指標(biāo)無顯著影響（P＞0.05）；而精氨酸添加水平對中腸肌層厚度和皺襞高度存在顯著影響 （P＜0.05），對黏膜下層厚度和上皮細胞寬度沒有顯著影響（P＞0.05）。隨豆粕替代水平的升高，肌層厚度先升高后降低，在30%替代組最高，與20%替代組無明顯差異 （P＞0.05），顯著高于40%替代組 （P＜0.05）。隨精氨酸添加水平升高，肌層厚度和皺襞高度先升高后趨于平穩(wěn)，0.5%和1%精氨酸添加組顯著高于未添加組（P＜0.05），在20%、40%豆粕替代水平組，精氨酸添加水平對中腸褶皺高度無顯著影響（P＞0.05），而在30%豆粕替代組，隨精氨酸添加水平的升高皺襞高度先升高后降低，0.5%添加組比對照組提高15.8%（P＜0.05），黏膜下層厚度和上皮細胞寬度在各處理組之間均沒有顯著差異（P＞0.05）。

表7 豆粕替代魚粉并添加精氨酸對點帶石斑魚中腸結(jié)構(gòu)的影響 μm

2.2.3 豆粕替代魚粉并添加精氨酸對點帶石斑魚后腸結(jié)構(gòu)的影響 由表8可看出，豆粕替代水平和精氨酸添加水平的交互作用對點帶石斑魚后腸的黏膜下層厚度、肌層厚度、上皮細胞寬度和皺襞高度均不存在顯著影響（P＞0.05）。豆粕替代水平顯著影響了后腸的肌層厚度和皺襞高度 （P＜0.05），而精氨酸添加水平則顯著影響了后腸黏膜下層厚度、肌層厚度和皺襞高度（P＜0.05）。隨豆粕替代水平的升高，肌層厚度降低，20%替代組高于40%替代組17.0%（P＜0.05），與30%替代組無明顯差異（P＞0.05），在各處理組之間，肌層厚度最高值發(fā)生在替代水平為20%，精氨酸添加水平為1%組；而隨豆粕替代水平的升高，皺襞高度先升高后下降，在30%替代組最高，與20%替代組無明顯差異（P＞0.05），高于40%替代組7.4%（P＜0.05），皺襞高度在各處理組之間的最高值發(fā)生在30%豆粕替代水平，1%精氨酸添加水平組。隨精氨酸添加水平升高，黏膜下層厚度、肌層厚度、皺襞高度均顯著升高，最高值均發(fā)生在1%添加組，與0.5%添加組無明顯差異（P＞0.05），較0%添加組分別提高29.4%、16.4%、6.8%（P＜0.05）， 黏膜下層厚度最高值發(fā)生在替代水平為20%，精氨酸添加水平為1%的處理組。上皮細胞寬度在各處理組之間沒有顯著差異（P＞0.05）。

表8 豆粕替代魚粉并添加精氨酸對點帶石斑魚后腸結(jié)構(gòu)的影響 μm

3 討論

3.1 豆粕替代魚粉并添加精氨酸對點帶石斑魚組織消化酶活性的影響 魚類對營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的能力取決于魚類消化酶活性，因此，對魚類消化酶活性的研究有著非常重要的意義。在對大菱鲆幼魚（李宗升，2016）和埃及胡子鲇（吳莉芳等，2010）的研究中發(fā)現(xiàn)隨豆粕替代水平的提高，魚體腸、胃蛋白酶活性呈下降趨勢，對日本鱸魚幼魚（Li等，2014）的研究中，也發(fā)現(xiàn)蛋白酶活性隨飼料中植物蛋白替代比例的上升而減小，認為導(dǎo)致蛋白酶活性下降的重要因素是植物蛋白中普遍含有的植酸。而在本試驗中，豆粕替代量超過30%時，后腸蛋白酶及胃淀粉酶活性顯著降低，試驗結(jié)果與其相符，可能是豆粕作為植物蛋白源在替代魚粉的過程中，當(dāng)豆粕替代魚粉比例過大，大豆中含有的一些抗?fàn)I養(yǎng)因子，如皂甙、胰蛋白酶抑制因子和大豆凝集素等影響了魚類對植物蛋白的吸收利用（鄒文超等，2014）。此外，點帶石斑魚為肉食性，消化道中蛋白酶活性與其食性相適應(yīng)，對植物蛋白的適應(yīng)程度較低，且不及動物蛋白，因此，當(dāng)豆粕替代水平過高時，蛋白酶活性下降，在黑鯛（楊彬彬等，2015）和翹嘴紅鲌（錢曦等，2007）的相關(guān)研究中也有相似報道。同時，精氨酸添加水平為0.5%時，點帶石斑魚前腸、中腸的蛋白酶活性，以及魚體后腸脂肪酶活性顯著提高；在精氨酸添加水平為1%時，中腸腸脂肪酶活性顯著提高。有研究發(fā)現(xiàn)，在黑鯛魚幼魚飼料中添加外源精氨酸能提高胃和前腸的蛋白酶和淀粉酶活力，從而提高黑鯛魚飼料的消化率和吸收率（周凡，2011），以及在對雜交鱘魚幼魚 （Acipenser schrenckii×Acipenser baeri）消化酶活性的研究中，也發(fā)現(xiàn)適宜的精氨酸添加水平顯著提高了幼魚前腸的蛋白酶和淀粉酶活力、中腸蛋白酶活力 （王連生等，2017）。本試驗結(jié)果與其相近，說明在飼料中添加適當(dāng)水平的精氨酸可以提高點帶石斑魚腸道內(nèi)消化酶的活性，有利于腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。

3.2 豆粕替代魚粉并添加精氨酸對點帶石斑魚腸道結(jié)構(gòu)的影響 腸道是魚類營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的器官，主要由黏膜層、黏膜下層、肌肉層和漿膜層四層結(jié)構(gòu)構(gòu)成，其中由黏膜層和黏膜下層向腸腔突起形成的腸道皺襞，其高度可反映該魚體腸道吸收面積，如對大西洋白姑魚 （Ribeiro等，2014）、美國紅魚（Zhou 等，2010）、鯉（Geda 等，2012）等的研究中將皺襞的高低作為動物腸道吸收能力的重要指標(biāo)。有研究表明，在大西洋鮭（Krogdahl等，2015）、 歐洲真鱸 （Kaushik 等，2004）、斑馬魚幼魚（Hedrera 等，2013）和黃金鱸（吳莉芳等，2017）的飼料中添加一定量的大豆產(chǎn)品后，會導(dǎo)致魚后腸組織結(jié)構(gòu)發(fā)生形態(tài)變化，對后腸產(chǎn)生不利影響，使其組織結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，如上皮細胞與固有層分離、肌層變薄、腸絨毛脫落或破損現(xiàn)象。在本試驗中，隨豆粕替代水平的升高，后腸的肌層厚度降低，在20%替代組最高，且皺襞厚度先升高后下降，在30%替代組最高，此試驗結(jié)果與以上研究結(jié)果相符，說明高豆粕替代水平在一定程度上對魚體腸道造成了不利影響。從而影響了魚體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，降低了魚體的生長，本試驗中補充了豆粕替代魚粉后引起的必需氨基酸不平衡，但是氨基酸的消化吸收率沒有測定，也許氨基酸的吸收不同步以及豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子如大豆凝集素、大豆抗原蛋白都可能引起魚類腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及皺襞高度的下降。

在對美國紅魚的研究中發(fā)現(xiàn)，1%精氨酸可提高魚體前腸和中腸皺襞高度以及前腸的上皮細胞高度 （Cheng等，2011），對雜交條紋鱸（Morone chrysops×Morone saxatilis）的研究表明，添加1%～2%外源精氨酸能提高腸道絨毛高度、腸上皮細胞高度和微絨毛高度（Cheng等，2012）。同樣，在飼料中添加適宜水平的精氨酸能顯著提高雜交鱘幼魚前腸和中腸的皺襞高度、前腸肌層厚度（王連生等，2017），對黃顙魚的研究顯示，飼料中精氨酸水平的增加可以有效提高腸道肌層厚度和皺襞高度。在本試驗中，隨精氨酸添加水平升高，前中后腸的肌層厚度、皺襞高度均升高，這與在美國紅魚和雜交條紋鱸上的研究結(jié)果一致 （Cheng等，2012、2011），而在對斜帶石斑魚的研究中發(fā)現(xiàn)，隨精氨酸添加水平的升高前腸后腸的肌層厚度、皺襞高度以及中腸的肌層厚度均呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢，且在2.95%添加組達到最高 （遲淑艷等，2016），與本試驗結(jié)果略有不同，本試驗中隨著精氨酸添加水平的升高魚體腸道的肌層厚度、皺襞高度均升高，可能是本試驗精氨酸的添加量還不足以使腸道肌層厚度和皺襞高度等出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。這些都說明在飼料中適當(dāng)替代豆粕和添加適當(dāng)水平的精氨酸有利于腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。

4 結(jié)論

在本試驗條件下，當(dāng)豆粕蛋白替代魚粉蛋白不超過30%，精氨酸添加量為0.5%～1%，對石斑魚的消化和腸道結(jié)構(gòu)有利。