三種酶解底物制備的誘食劑的香氣分析及適口性研究

宋詩(shī)清， 童彥尊， 馮 濤*， 范然然， 喻 晨

（1．上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海市 201418；2.安琪酵母股份有限公司 特種酶制劑事業(yè)部，湖北省宜昌市443003）

犬糧誘食劑大都以蛋白質(zhì)酶解液為底物進(jìn)行美拉德反應(yīng)獲得（易建華等，2016），因此許多針對(duì)誘食劑生產(chǎn)的商業(yè)復(fù)合蛋白酶面世，成為該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)之一。風(fēng)味的好壞是誘食劑產(chǎn)品的命脈，一款風(fēng)味飽滿(mǎn)的誘食劑能極大改善狗糧的適口性。風(fēng)味呈現(xiàn)并非由某一種或一類(lèi)的化合物決定，而是相互作用的結(jié)果（Kerth等，2015）。在寵物食品方面，香氣提取主要采用HS-SPME（Chen等，2017）。電子鼻在食品領(lǐng)域中被廣泛運(yùn)用，可區(qū)分不同產(chǎn)品的整體香氣差異或檢測(cè)同一種產(chǎn)品的貨架期（Rock等，2008）。電子鼻能將人對(duì)風(fēng)味的捕捉數(shù)字化，結(jié)合感官評(píng)價(jià)使風(fēng)味分析更具科學(xué)性。Tian等（2015）將電子鼻與GC-MS聯(lián)用對(duì)牛肉的品質(zhì)及風(fēng)味進(jìn)行了分級(jí)和評(píng)價(jià)。

本試驗(yàn)對(duì)三種不同的酶制得的誘食劑進(jìn)行感官評(píng)定、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）和氣相色譜-嗅辨儀（GC-O）分析，確定誘食劑的風(fēng)味特征及關(guān)鍵風(fēng)味成分。用電子鼻區(qū)分三種誘食劑的整體香氣差異。采用適口性測(cè)試驗(yàn)證三種誘食劑的實(shí)際應(yīng)用效果，體現(xiàn)三種誘食劑風(fēng)味的優(yōu)劣。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 誘食劑A、B、C采用不同酶解液做底物的誘食劑；犬糧：上海仕林生物科技有限公司提供；20只試驗(yàn)犬（表1）：上海交大農(nóng)學(xué)院教學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)場(chǎng)；2-辛醇 （色譜純）、烷烴C5-C22（色譜純）：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；二氯甲烷（分析純）：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

表1 試驗(yàn)犬信息

1.2 儀器與設(shè)備 7890A-5975C型GC-MS 7890A氣相色譜儀 （安捷倫科技有限公司）；ODP嗅聞裝置 （德國(guó)Gerstal公司）；FOX4000電子鼻（法國(guó)阿爾法莫斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 感官評(píng)價(jià) 選5名感官人員對(duì)誘食劑進(jìn)行感官評(píng)定，標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2 HS-SPME法萃取香氣 準(zhǔn)確稱(chēng)取4 g誘食劑，加入20 mL萃取瓶中，在50℃水浴溫度下平衡15 min，用老化好的萃取纖維頭（50/30μm纖維頭：DVB/CAR/PDMS）頂空萃取 40 min，萃取溫度為50℃。萃取纖維頭解吸5 min，解吸溫度為250℃。

1.3.3 GC-MS條件 GC條件：HP-INNOWAX色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣 N2，流量為3 mL/min，不分流；進(jìn)樣口溫度250℃；升溫程序：45℃保留1 min，以4℃/min升溫至230℃，保留15min。

MS條件：采用電子電離源；電離能量70 eV；離子源溫度230℃；接口溫度250℃；采用全掃描方式；質(zhì)量掃描范圍為m/z 20～350。

1.3.4 SDE法萃取香氣 用同時(shí)蒸餾裝置，取15 mL誘食劑和150 mL蒸餾水混合，溫度控制在100～200℃，用二氯甲烷作溶劑，加60mL，萃取3 h。萃取結(jié)束后收集提取液，加無(wú)水硫酸鈉，低溫陳化24 h，濃縮至1 mL，加入10μl內(nèi)標(biāo)物（0.2mg/ml2-辛醇）。 進(jìn)樣量：0.2 μL，分流比 10∶1，溶劑延遲6min，升溫程序不變。

1.3.5 AEDA法分析 用二氯甲烷將濃縮液分別以 1∶3、1∶9、1∶27、1∶81，1∶243 比例稀釋?zhuān)?2 μL 稀釋后樣品注射到GC-O裝置（GC條件不變），直到評(píng)價(jià)人員在ODP末端不再嗅聞到氣味，記下此時(shí)的稀釋倍數(shù)，并計(jì)算FD因子 （Usami等，2013；Choi等，2010）。評(píng)價(jià)人員需記錄從ODP口聞到的氣味特性及時(shí)間，結(jié)果與香氣物質(zhì)的出峰時(shí)間匹配，要求至少有兩名評(píng)價(jià)人員（共三人）描述一致。

1.3.6 電子鼻分析 分別稱(chēng)取三種誘食劑各1 g到5mL的樣品瓶中，依次放于電子鼻的自動(dòng)進(jìn)樣器上。采樣時(shí)間900 s，采樣溫度60℃，進(jìn)樣針量為2500μL，每個(gè)樣品重復(fù)4次。

1.3.7 適口性測(cè)試 犬糧制備：在55℃條件下將誘食劑均勻噴涂在犬糧表面（添加量5%），冷卻后得到誘食劑添加糧Aa、Bb和Cc，空白犬糧D作為對(duì)照。

動(dòng)物試驗(yàn)（Aldrich 等，2015）：先以 Aa和 Bb、Aa和Cc做兩組比對(duì)，選取效果較好的與D比較進(jìn)行驗(yàn)證；每組持續(xù)兩天，每天喂2餐（間隔7 h），選20只成年小型犬。每餐同時(shí)喂兩種犬糧各100 g，喂食持續(xù)30 min，記錄犬對(duì)犬糧的第一口偏好，喂食完畢再記錄剩余的犬糧；每次喂食前清潔并固定食具，準(zhǔn)備飲用水，每餐需交換食具位置，犬糧不得重復(fù)飼喂；試驗(yàn)犬須健康狀況良好，無(wú)嘔吐拉稀狀態(tài)。

1.3.8 計(jì)算公式 用NIST庫(kù)檢索出峰，通過(guò)烷烴C5-C22在相同條件下的保留時(shí)間，計(jì)算揮發(fā)性物質(zhì)的保留指數(shù) （retention index，RI）（Majlát等，1974），將算得的 RI與Wiley 7n.l數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，RI按公式（1）計(jì)算：

式中：tx為揮發(fā)性物質(zhì)的保留時(shí)間，min；tz為與揮發(fā)性物質(zhì)碳原子數(shù)相同的烷烴的保留時(shí)間，min；z為烷烴碳原子數(shù)。

香氣活力值（OAV）等于揮發(fā)性物質(zhì)的濃度與水中的嗅覺(jué)閾值之間的比值。揮發(fā)性物質(zhì)濃度按公式（2）計(jì)算：

式中：Wi為揮發(fā)性物質(zhì)含量，μg/g；ms為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量，μg；Ai為揮發(fā)性物質(zhì)峰面積；As為內(nèi)標(biāo)物的峰面積；m0為濃縮物質(zhì)量，g。

FD因子即Log3FD，F(xiàn)D為樣品的稀釋倍數(shù)，Log3FD≥3時(shí)證明香氣物質(zhì)對(duì)香氣貢獻(xiàn)大（Buttery等，2013）。

采食率/%=消耗的犬糧/總?cè)Z×100。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 用SPSSStatistic 19進(jìn)行方差分析，按Duncan的多范圍測(cè)試結(jié)果具有顯著性（P<0.05）。

采用Unscrambler 9.7進(jìn)行PLSR分析動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果與香氣物質(zhì)間的相關(guān)性，模型采用Full Cross-Validation進(jìn)行校正。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評(píng)定與比較 三種誘食劑的感官評(píng)定結(jié)果如表3及圖1所示。三種誘食劑均有明顯的雞肉香氣，可能由于三款誘食劑都以雞肝作為反應(yīng)底物；誘食劑A和B的脂肪感強(qiáng)于C；誘食劑C和A的烤香、焦糖香、醬香和豐滿(mǎn)度均強(qiáng)于B，誘食劑B的香氣較寡淡；在余味方面，誘食劑C高于誘食劑A和B。通過(guò)感官評(píng)定初步認(rèn)為三種誘食劑的特征風(fēng)味是肉香、脂肪香和烤香。

表3 感官評(píng)定結(jié)果

圖1 誘食劑的感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖

2.2 誘食劑的揮發(fā)性風(fēng)味成分分析與比較 三種誘食劑的GC-MS結(jié)果如表4所示。在三種誘食劑中共檢測(cè)鑒定出40種揮發(fā)性成分，分別從誘食劑A、B、C中檢測(cè)鑒定出27種、24種和32種物質(zhì)，其中醛類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)、醇類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)較多。醛類(lèi)物質(zhì)一般由脂肪酸氧化或美拉德反應(yīng)產(chǎn)生，是誘食劑中脂肪香、烤香的重要來(lái)源 （Mottram等，2015）。從三種誘食劑中都鑒定出的醛類(lèi)物質(zhì)有2-甲基丁醛、異戊醛、辛醛丙二醇縮醛、菠蘿醛、糠醛、苯甲醛、苯乙醛和戊醛丙二醇縮醛。其中2-甲基丁醛、糠醛及菠蘿醛能呈現(xiàn)烘烤香氣，戊醛丙二醇縮醛能加強(qiáng)誘食劑的油脂感。三種誘食劑的醇類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)較少，糠醇具有焦糖香，甲硫醇有強(qiáng)烈蔥蒜氣息是肉香的重要來(lái)源，而2-乙基己醇具有脂肪香。從三種誘食劑鑒定出了低分子量，易揮發(fā)的丙位丁內(nèi)酯，具有奶油特征香氣，可增強(qiáng)香氣飽滿(mǎn)度。從三種誘食劑中鑒定出的酮類(lèi)物質(zhì)為呋喃酮，具有焦糖香，可增加香氣厚實(shí)感。從誘食劑A和B中都鑒定出了1-羥基-2-丁酮和羥基丙酮，提供烤香和焦糖香，可見(jiàn)誘食劑中的酮類(lèi)物質(zhì)主要以焦糖香韻為主。酸類(lèi)物質(zhì)在誘食劑中的形成一般是通過(guò)油脂的氧化等過(guò)程（Zviely，2012），僅在誘食劑A中鑒定出乙酸，而酸在誘食劑中主要起調(diào)和口感的作用。雜環(huán)類(lèi)物質(zhì)主要來(lái)自于美拉德反應(yīng)，是誘食劑中形成肉類(lèi)風(fēng)味的重要成分（Chen 等，2017；Liu 等，2015），三種誘食劑中均鑒定出2-甲基吡嗪、2-甲基呋喃和2-乙?；秽芴峁┛鞠愫徒固窍悖蝗N誘食劑都鑒定出了具有明顯肉類(lèi)特征和蔥蒜氣息的含硫物質(zhì)，如二甲基二硫醚是肉香型誘食劑中極為關(guān)鍵的成分，在肉類(lèi)香精中也十分常見(jiàn)。總體來(lái)講三種誘食劑的主要呈香物質(zhì)種類(lèi)較相似。

2.3 誘食劑的特征性揮發(fā)性成分定量分析與比較 采用SDE-GC-O從誘食劑A、B、C中鑒定分別出18、17和22種香氣活性成分，結(jié)果如表5所示，其中甲硫醇、2-甲基丁醛、2-甲基吡嗪、苯甲醛和糠醛等具有較高的FD因子（Log3FD≥3），對(duì)誘食劑的香氣貢獻(xiàn)大。以保留指數(shù)為橫坐標(biāo)，以L(fǎng)og3FD為縱坐標(biāo)繪制FD圖譜如圖2所示，F(xiàn)D因子較高的成分大多處于靠前的位置即出峰較早，多為小分子物質(zhì)。為進(jìn)一步確認(rèn)誘食劑中關(guān)鍵揮發(fā)性成分，通過(guò)內(nèi)標(biāo)法得到物質(zhì)含量，并查找這些物質(zhì)在水中的嗅覺(jué)閾值，得到OAV值，通常香氣成分的FD因子與OAV呈正相關(guān)。如表6所示，三種誘食劑中甲硫醇的OAV值最高，其次為2-甲基丁醛和菠蘿醛等?？傮w來(lái)講，甲硫醇、2-甲基丁醛、菠蘿醛、2-甲基吡嗪、糠醛具有較高的FD因子及OAV值，對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)大。由此可見(jiàn)三種誘食劑因美拉德配方和工藝相同，關(guān)鍵呈味物質(zhì)的種類(lèi)相似，但在含量上有差異。誘食劑A的肉香，脂肪香更突出，誘食劑C烤香更突出，誘食劑B特征香氣較淡，故通過(guò)引入FD因子和OAV值分析得出關(guān)鍵呈味物質(zhì)能夠區(qū)分三種酶解液造成的香氣差異。

表4 三種誘食劑的主要揮發(fā)性成分

表5 誘食劑A、B、C的AEDA分析結(jié)果

圖2 誘食劑A、B、C的FD譜圖

2.4 電子鼻區(qū)分三種誘食劑的風(fēng)味 電子鼻的雷達(dá)圖如圖3所示，三種樣品的輪廓清晰，表明穩(wěn)定性好。誘食劑A對(duì)于LY2/gCTL、LY2/gCT、LY2/AA傳感器的吸收度更高，表明誘食劑A中有更多寵物或烘烤類(lèi)食品揮發(fā)出的特征風(fēng)味物質(zhì)（Yu等，2012）。誘食劑C的整體雷達(dá)輪廓最大，可見(jiàn)其香氣最強(qiáng)，與之前GC-MS和GC-O的分析結(jié)果相符。

電子鼻的主成分分析 （PCA）結(jié)果如圖4所示。PCA是通過(guò)對(duì)原始數(shù)據(jù)向量進(jìn)行線(xiàn)性變換來(lái)尋找樣品間的差異的一種算法，該算法不丟失任何樣品信息，僅通過(guò)改變坐標(biāo)軸來(lái)達(dá)到區(qū)分樣品的目的。由圖可知主成分1（PC1）和主成分2（PC2）共能反映99.988%的信息，證明檢測(cè)結(jié)果可信度高。由于PC1占比94.273%，故主要觀察三個(gè)樣品在橫軸上的距離，顯示誘食劑A與誘食劑B相似度更高，而A和C的差異性最大。

表6 誘食劑A、B、C中FD因子大于3的香氣化合物的OAV值

圖3 三種誘食劑的電子鼻雷達(dá)圖

圖4 誘食劑的主成分分析圖

2.5 誘食劑對(duì)狗糧適口性的改善 由圖5可知，誘食劑添加糧Aa與Bb在采食率和第一口偏好上沒(méi)有顯著差異，但Aa的采食率和第一口偏好都優(yōu)于Bb。表明誘食劑A對(duì)狗糧適口性的改善好于B，但不明顯。由圖6可知，Aa與Cc在采食率上就沒(méi)有顯著差異，但Aa的平均采食率高于Cc，而Aa的第一口偏好數(shù)顯著高于Cc，表明誘食劑A在對(duì)犬糧香氣改善明顯。選取Aa與空白糧D進(jìn)行對(duì)照做驗(yàn)證，結(jié)果如圖7所示，Aa的采食率和第一口偏好都顯著高于D。該組試驗(yàn)中，試驗(yàn)犬對(duì)Aa的第一口偏好次數(shù)占比82.5%，平均采食率達(dá)64%，驗(yàn)證試驗(yàn)表明誘食劑能顯著改善犬糧的適口性。

圖5 Aa和Bb采食率和第一口采食偏好的比較

圖6 Aa和Cc采食率和第一口采食偏好的比較

圖7 Aa和D采食率和第一口采食偏好的比較

利用Unscrambler v9.7做PLSR分析動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果與呈香物質(zhì)之間的相關(guān)性，以GC-MS檢測(cè)得到的風(fēng)味物質(zhì)含量為X變量，誘食劑的應(yīng)用效果（第一口偏好和采食率）為Y變量，如圖8所示，兩橢圓分別表示50%和100%的方差貢獻(xiàn)率。由圖中紅框區(qū)域可知，糠醇（焦糖氣息）、糠醛（杏仁香）、苯甲醛（苦杏仁香）、丙位丁內(nèi)酯（奶香、果香）、乙酸（刺激性酸味）、2-乙基己醇（脂肪香）、甲硫醇（蔥蒜味、肉香）、菠蘿醛（烤土豆）、硫醇（肉香、烤香）、戊醛丙二醇縮醛（脂肪香）、5-甲基呋喃醛（焦糖香）和5-甲基-2-噻吩醛（杏仁香）與第一口偏好和采食率相關(guān)性較好，且以上這些物質(zhì)在誘食劑A中含量更高，與AEDA分析結(jié)果相符。這體現(xiàn)出肉香、烤香、脂肪香和醬香更協(xié)調(diào)且能提供犬類(lèi)偏愛(ài)的酸味口感的誘食劑對(duì)犬的吸引力更大（Frantz，2011），能有效提升狗糧的適口性。

圖8 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果與風(fēng)味物質(zhì)間的相關(guān)性

3 結(jié)論

通過(guò)感官評(píng)定得出三種誘食劑的主體風(fēng)味是肉香、烤香和脂肪香，誘食劑A的肉香較突出且香氣協(xié)調(diào)性更好，風(fēng)味更宜人，而誘食劑C的烤香較突出。通過(guò)HS-SPME-GC-MS分析，從3種誘食劑中共鑒定出40種風(fēng)味物質(zhì)，以醛類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)和醇類(lèi)為主，具有肉香、烤香和脂肪香的風(fēng)味特征。采用SDE-GC-O技術(shù)鑒定出了甲硫醇、糠醛、菠蘿醛、2-甲基吡嗪等有較高的FD因子和OAV值，對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)大，其中甲硫醇最突出，是肉香重要來(lái)源。誘食劑A的關(guān)鍵香氣物質(zhì)的OAV較高，但烤香成分如2-甲基丁醛和2-甲基吡嗪的OAV低于誘食劑C，這與感官評(píng)價(jià)結(jié)果相符。采用電子鼻辨別三種誘食劑的差異，由PCA分析得出三種誘食劑差異較明顯，顯示不同酶對(duì)誘食劑風(fēng)味有影響，誘食劑A和B更相似，與C區(qū)別較大。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示誘食劑添加糧Aa的第一口偏好與采食率均高于Bb和Cc，表明誘食劑A對(duì)狗糧風(fēng)味的改善效果較好，而Aa的采食率和第一口偏好都顯著高于空白糧D，表明以肉香和烤香為主體的誘食劑能顯著改善狗糧的適口性。采用PLSR分析風(fēng)味物質(zhì)與第一口偏好及采食率的相關(guān)性，得出直接影響誘食劑風(fēng)味優(yōu)劣的主要幾種風(fēng)味物質(zhì)成分有糠醇、糠醛、苯甲醛、丙位丁內(nèi)酯、乙酸、2-乙基己醇、甲硫醇、菠蘿醛、硫醇、戊醛丙二醇縮醛、5-甲基呋喃醛和5-甲基-2-噻吩醛，與AEDA分析結(jié)果相符。