• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    同位素稀釋技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜快速精準(zhǔn)測(cè)定飼料及原料中16種霉菌毒素

    2019-01-24 03:17:48符金華楊琳芬董澤民徐國(guó)茂姜文娟黃艷清李瑾瑾周仁丹
    中國(guó)飼料 2019年1期
    關(guān)鍵詞:霉菌毒素質(zhì)譜

    符金華, 楊琳芬, 董澤民*, 徐國(guó)茂, 姜文娟 , 邢 磊,黃艷清, 李瑾瑾, 周仁丹, 葉 金, 吳 宇, 廖 豐

    (1.江西省獸藥飼料監(jiān)察所,江西南昌 330096;2.南昌大學(xué)分析測(cè)試中心,江西南昌 330047;3.國(guó)家糧食局科學(xué)研究院,北京西城 100037;4.雙胞胎(集團(tuán))股份有限公司,江西南昌 330096)

    霉菌毒素是真菌在適宜環(huán)境條件下產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,其對(duì)人和畜禽具有致癌、致畸、致突變作用(朱聰英等,2010)。飼料及其原料特別易于被霉菌毒素污染(Binder等,2007),從而降低飼料的口感與質(zhì)量,給畜牧業(yè)發(fā)展和畜產(chǎn)品安全造成極大的危害。其中,對(duì)人和畜禽毒性較大毒害的主要有黃曲霉毒素、嘔吐毒素、T-2毒素和玉米赤霉烯酮等數(shù)十種(Marin 等,2013;鄭翠梅等,2012)。因此,飼料及原料中各種毒素的限量和檢測(cè)要求日趨嚴(yán)格。

    目前,霉菌毒素的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法(TLC) 、熒光/酶聯(lián)免疫法(ELISA) 、高效液相色譜法(HPLC)及氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS)等(朱 聰英等 ,2010;Cavaliere 等,2007;Chiar 等 ,2007)。雖然在一定程度上能夠滿足目前部分毒素的檢測(cè),但也存在諸多問題。如TLC法的穩(wěn)定性和重復(fù)性差,易受外界環(huán)境的干擾;ELISA法通常作為篩選方法,不能準(zhǔn)確定量,且易出現(xiàn)假陽性;HPLC法容易受到基質(zhì)干擾,檢測(cè)通量不夠,且部分毒素的檢測(cè)限達(dá)不到限量標(biāo)準(zhǔn)要求;GC-MS法的操作步驟繁瑣,衍生化的效率低等。另外,實(shí)際的飼料樣品中霉菌毒素污染通常是多種霉菌毒素同時(shí)污染 (Monbaliu等,2009),而這些方法檢測(cè)的毒素種類比較單一。

    因此,開發(fā)出飼料及原料中多種霉菌毒素一步檢測(cè)方法具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)是一種集高效分離和多組分同時(shí)定性、定量于一體的檢測(cè)技術(shù),具有較強(qiáng)抗基體干擾能力、高通量、高選擇性、高靈敏度等優(yōu)勢(shì),成為近年來痕量檢測(cè)中發(fā)展非常快的新技術(shù)之一 (Markus等,2012;Johannes等,2012;Mira等,2010;Micheal等,2009)。 但HPLC-MS/MS法均需要專用的前處理設(shè)備耗材,提取凈化步驟繁瑣,且霉菌毒素的檢測(cè)種類面仍然比較窄 (Shephard 等,2012;趙孔祥等,2011)。 本研究建立了一種飼料及原料中16種霉菌毒素的超高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜檢測(cè)法(Q-trap-UPLC-MS/MS)。樣品經(jīng)簡(jiǎn)單的提取、同位素稀釋后直接檢測(cè),不需要過多功能凈化柱及脫脂等操作,實(shí)現(xiàn)了一次前處理和一針進(jìn)樣,同時(shí)精確檢測(cè)16種霉菌毒素。該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、低成本、定量準(zhǔn)確,對(duì)批量飼料及原料樣品中霉菌毒素的快速監(jiān)測(cè)意義重大。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器和試劑 質(zhì)譜型號(hào)為Sciex4500 Qtrap(美國(guó) Sciex公司);液相為島津LC-20AD XR(日本Shimadzu公司);赫西離心機(jī)(中國(guó) 湖南赫西儀器裝備有限公司);HY-3多功能振蕩器 (中國(guó)江蘇光都機(jī)電設(shè)備有限公司):Milli-Q超純水純化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司);METTLER TOLEDO ME104分析天平(中國(guó) 梅特勒-托利多(上海)有限公司)。

    甲醇、乙腈(HPLC級(jí),德國(guó)Merck公司);乙酸銨、甲酸、乙酸(HPLC 級(jí),美國(guó) Sigma公司);0.2 μm PTFE膜針頭過濾器 (PALL公司);實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。分別移取一定體積的16種霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液 (濃度為0.01~2.5μg/mL,購自Romer公司)于10mL容量瓶中,水定容,得到16種霉菌毒素混標(biāo),于-20℃保存,濃度詳見表1。

    表1 真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的濃度及相應(yīng)的穩(wěn)定同位素混合溶液

    穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)混合工作液:分別移取一定體積的14種霉菌毒素穩(wěn)定同位素單標(biāo) (濃度為0.01~2.5μg/mL,購自 Romer公司)于 4mL儲(chǔ)液瓶中,用水稀釋至2mL配制穩(wěn)定同位素混標(biāo),充分混勻后于-20℃避光保存。準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備液,用乙腈-水-乙酸溶液(35:64.5:0.5)逐級(jí)稀釋,配制成不同濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。向400μL內(nèi)插管中加入20μL 14種穩(wěn)定同位素混合工作液,再分別吸取180μL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液于內(nèi)插管中,渦旋混勻后準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè)。1.2 實(shí)驗(yàn)方法 液相色譜條件:Waters公司CORTECSTM UPLC C18柱 (100 mm ×2.1 mm,1.6μm);柱溫40℃;進(jìn)樣量2μL;流動(dòng)相A為甲醇,B為含0.1%(體積分?jǐn)?shù))的甲酸和1mmol/L乙酸銨的水溶液;流速為0.3mL/min;采用梯度洗脫。

    質(zhì)譜條件:加熱電噴霧離子源溫度為500℃;噴霧電壓為5500 V;離子傳輸管溫度為320℃;gas1和 gas2均為50 psi,氣簾氣為35 psi。EPI掃描速度 10000 Da/s,掃描質(zhì)量范圍50~1000,分段多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式,MRM檢測(cè)窗口設(shè)置為30 s,錐孔電壓50 V;正、負(fù)離子采集;監(jiān)測(cè)離子、碰撞池能量等參數(shù)見表2。

    稱取飼料樣品 (5±0.1)g于50mL離心管中,準(zhǔn)確加入 20mL 乙腈/水/乙酸 (V/V/V:70/29/1)提取溶劑,渦旋2min,振蕩30min,以4000 r/min離心10min使固液分離。準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移0.5mL上清液于1.5 mL離心管中,加入0.5 mL水稀釋,渦旋混勻1 min,然后以12 000 r/min離心10min,取上清液用0.22μm的PTFE濾膜過濾,吸取20μL預(yù)先渦旋混勻的穩(wěn)定同位素混合溶液于400μL內(nèi)插管中,再加入180μL的樣品濾液,混合后待測(cè)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 實(shí)驗(yàn)條件考察 本研究選擇的樣品前處理提取溶劑為乙腈/水/乙酸(V/V/V:70/29/1),提取液經(jīng)直接提取稀釋,加入同位素內(nèi)標(biāo)后,上機(jī)檢測(cè)。選擇含有0.1%甲酸的1mmol/L NH4Ac的水相作為弱洗脫流動(dòng)相,甲醇為強(qiáng)洗脫流動(dòng)相,且采用梯度洗脫程序。質(zhì)譜采用正、負(fù)離子模式下獲得[M+H]+、[M+NH4]+吸收峰,采用分段多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)掃描模式,離子源溫度為500℃,駐留時(shí)間為100ms,得到精確保留時(shí)間和選擇離子精確質(zhì)量數(shù)、信號(hào)采集的特征離子對(duì)及質(zhì)譜條件見表2。

    表2 16種真菌毒素的精確保留時(shí)間、質(zhì)量數(shù)及質(zhì)譜條件

    按照上述優(yōu)化的條件,得到了16種毒素的高質(zhì)量離子信號(hào)、低干擾離子信號(hào)及理想的總離子色譜峰(圖 1)。

    圖1 16種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的總離子流色譜圖

    2.2 方法學(xué)考察

    2.2.1 基質(zhì)效應(yīng) 常見5大類配合飼料和4種原料的基質(zhì)效應(yīng)見圖2所示。以目標(biāo)物在空白基質(zhì)液中的峰面積與溶劑中峰面積的百分比來評(píng)估基質(zhì)效應(yīng),當(dāng)結(jié)果接近100%時(shí),表明無明顯的基質(zhì)效應(yīng),而高于100%說明有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),低于100%則說明有基質(zhì)抑制效應(yīng)。在5類配合飼料和4種原料基質(zhì)中,16種霉菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)較為相似。FB1、FB2、OTA和T2四種毒素呈現(xiàn)基質(zhì)增強(qiáng)效 應(yīng) ,DON、DON-3G、3-AcDON、15-AcDON、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、NIV 及 ZEN 等 10 種 毒素呈現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng),HT-2和ST毒素的基質(zhì)效應(yīng)較弱。在5類配合飼料和4種原料中,各霉菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)分別為60.3%~122.3%和54.0%~124.3%,說明存在一定的基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng)。

    圖2 16種霉菌毒素在5種配合飼料及4種原料中的基質(zhì)效應(yīng)(n=3)

    然而,基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線是一種常見的減少基質(zhì)效應(yīng)的方法,但由于霉菌毒素污染的普遍性,空白基質(zhì)不易獲得,特別是完全匹配的基質(zhì)更難獲得,而代表性基質(zhì)的普適性面臨挑戰(zhàn),具有較大的不確定性,導(dǎo)致基質(zhì)匹配定量在標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)中的應(yīng)用受到局限。因此,為了更好消除基質(zhì)效應(yīng)的影響,本實(shí)驗(yàn)采用穩(wěn)定同位素稀釋法進(jìn)行定量,以確保結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

    2.2.2 線性范圍、檢出限及定量下限 由表3可知,在各自的線性范圍內(nèi),16種霉菌毒素線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)均>0.998。對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋,以3倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(LOD),10倍信噪比計(jì)算定量下限(LOQ)。 16種霉菌毒素的LOQ均低于我國(guó)和歐盟規(guī)定的飼料及原料中的限量值,說明本方法可以滿足日常檢測(cè)的需要。

    表3 16種霉菌毒素的線性范圍、檢出限及定量下限

    2.2.3 準(zhǔn)確度與精密度 取16種霉菌毒素含量較低(低于方法檢出限)的5類常見的配合飼料和4種常見的飼料原料樣品。分別添加高、中、低3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn),添加濃度、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表4和表5。其中,16種霉菌毒素在5種常見配合飼料中的回收率絕大數(shù)為70.2%~129.5%,只有極個(gè)別毒素的回收率為66.9%~69.9%。如犢牛飼料中AFG1、DON、DON-3G毒素的回收率偏低,F(xiàn)B1、FB2毒素的回收率偏高;但FB1、FB2毒素在魚、鴨飼料中的回收率偏低,這可能與這些飼料中含有菜籽粕、DDGS等原料有關(guān),且與基質(zhì)效應(yīng)的結(jié)果保持一致。同時(shí),16種霉菌毒素回收率的RSD值均在0.1%~14.5%。

    16種霉菌毒素在豆粕、玉米、菜籽粕和魚粉4種常見的飼料原料中的回收率絕大部分為80.2% ~116.1%,只有FB1、FB2毒素在豆粕中的回收率為66.4%~70.9%,稍微偏低,這可能是豆粕中的蛋白質(zhì)含量較高,對(duì)部分毒素具有一定的吸附性而造成。同時(shí),所有16種毒素回收率的RSD值均在0.1%~7.7%,兩大類基質(zhì)中的回收率和RSD均符合相關(guān)法規(guī)的檢測(cè)要求。

    2.2.4 質(zhì)控樣品的考察 為了進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性和適用性,使用本方法FAPAS能力測(cè)試玉米樣品。結(jié)果如表6所示,證書標(biāo)示的8種真菌毒素的檢測(cè)值均在范圍內(nèi),且接近標(biāo)示中值,表明本方法準(zhǔn)確可靠。相比于傳統(tǒng)的商品化MycoSpin 400多毒素凈化小柱和普通三重四極桿質(zhì)譜 (安捷倫6410B)的檢測(cè)方法,兩種方法的相對(duì)平均偏差均不大于7.1%,結(jié)果無顯著性差異。但Qtrap質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合穩(wěn)定同位素稀釋方法定量更加簡(jiǎn)單,且無需對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化,對(duì)多目標(biāo)物的分析時(shí)可有效減少建立儀器方法的難度與時(shí)間,便于實(shí)驗(yàn)室快速建立準(zhǔn)確可靠的定量方法以開展批量樣品的日常檢測(cè)。

    2.3 實(shí)際樣品檢測(cè) 按照上述優(yōu)化的各項(xiàng)條件,16種霉菌毒素的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行上機(jī)分析,以穩(wěn)定同位素稀釋法進(jìn)行定量。結(jié)果表明,16種毒素標(biāo)準(zhǔn)品能夠有效分離,得到精確保留時(shí)間。同時(shí),得到了所有的選擇離子精確質(zhì)量,質(zhì)量數(shù)與理論計(jì)算值非常接近。因此,16種毒素的HPLC/MS/MS方法條件優(yōu)化完成,可以滿足實(shí)際應(yīng)用于樣品的日常檢測(cè)。

    采用本研究中建立的方法對(duì)某地區(qū)的134份豬飼料、禽飼料、牛飼料及各種原料樣品進(jìn)行檢測(cè)。 飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB 13078-2001,2001)規(guī)定了飼料及原料中最高限量的6種霉菌毒素:AFB1、ZEN和DON超標(biāo)率分別為4.5%、3.0%、2.2%,T-2、(FB1+FB2)及OTA 超標(biāo)率均為0.0%。對(duì)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)未規(guī)定限量值的其他毒素,參考本方法中各毒素的檢出限,16種毒素的檢測(cè)數(shù)據(jù)見表7和表8。結(jié)果顯示,其他尚沒有限量值的霉菌毒素均有 不 同 程 度 的 檢 出 ,15-AcDON、AFG1、AFG2、DON-3G、AFB2、HT-2、ST 等毒素的檢出較高,均超過80%。說明了近年來由于氣候的異常,可能導(dǎo)致我國(guó)部分地區(qū)的飼料及原料中霉菌毒素污染較為普遍。因此,加強(qiáng)日常監(jiān)測(cè)尤為重要,而本方法可適用于大量飼料及原料樣品中多毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警及快速準(zhǔn)確定量篩查。

    3 結(jié)論

    基于Q-trap-UPLC-MS/MS結(jié)合穩(wěn)定同位素稀釋技術(shù),建立了飼料及原料中16種霉菌毒素的快速準(zhǔn)確檢測(cè)方法。樣品通過簡(jiǎn)單的提取、稀釋、離心和過膜等步驟即可上機(jī)檢測(cè),無需凈化操作。采用加標(biāo)回收法和測(cè)定基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確度和精密度,方法可適用于國(guó)內(nèi)外的飼料及原料中霉菌毒素的限量檢測(cè)要求。本方法前處理快速,有效避免了基質(zhì)效應(yīng)的干擾及檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確,可滿足日常批量飼料及原料樣品中霉菌毒素快速定性和精確定量分析的要求。

    表4 常見5種飼料中16種霉菌毒素的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

    表5 常見4種飼料原料中16種真菌毒素的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

    表6 FAPAS能力測(cè)試樣品的檢測(cè)結(jié)果

    表7 134份飼料及原料樣品中16種霉菌毒素的檢測(cè)結(jié)果

    表8 10份飼料樣品中霉菌毒素的含量

    注:“N/F”:未檢出或低于方法檢出限。

    化合物 樣品49 樣品52 15-ACDON N/F 1320.57 3-ACDON N/F 4878.66 AFB167.36 102.4樣品58 623.2 83.2 56.24樣品88 N/F N/F 332樣品97 N/F N/F 9.92樣品99 樣品100 樣品101 樣品102 樣品132 88.8 4.728 100 59.6 54.40 35.12 N/F 25.04 25.36 N/F 1.872 0.3336 N/F 2.824 16.48 AFB247.83 75.94 54.64 257.31 4.57 1.647 0.005 0.002 2.147 12.76 AFG12.04 2.544 0.6528 4.464 N/F N/F N/F N/F 0.065 0.1224 AFG236.56 40.08 3.456 N/F 1.72 N/F 1.24 N/F 1.688 1.184 DON 47.12 73.36 1632 145.6 146.4 620 384.8 485.6 583.2 450.4 DON-3G 5.084 242.4 136 110.4 246.4 558.4 112.8 152.8 208.8 125.6 FB1N/F N/F 4216 377.6 64.4 880 210.4 237.6 121.6 1912 FB2N/F 1.168 1380 76.16 27.6 389.6 150.4 57.12 28.88 428 HT-2 6.784 6.16 24.56 5.976 N/F 2.584 12.48 4.176 2.064 3.384 NIV 960.0 N/F N/F N/F 411.2 N/F 297.6 N/F 247.2 N/F OTA 41.76 2.976 14.08 5.248 2.792 2.56 2.76 2.408 2.568 3.400 ST 0.7088 0.4992 5.24 3.20 1.376 2.936 1.760 1.056 1.176 1.632 T2 N/F N/F 1.776 0.2168 0.596 1.976 7.552 3.560 1.264 1.448 ZEN N/F N/F 1360 236.8 N/F 288 108.8 N/F N/F 133.6

    猜你喜歡
    霉菌毒素質(zhì)譜
    揭示水霉菌繁殖和侵染過程
    What Makes You Tired
    氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀在農(nóng)殘檢測(cè)中的應(yīng)用及維護(hù)
    一類具有毒素的非均勻chemostat模型正解的存在性和唯一性
    毒蘑菇中毒素的研究進(jìn)展
    嚴(yán)苛標(biāo)準(zhǔn)方能清洗校園“毒素”
    吹掃捕集-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定水中18種揮發(fā)性有機(jī)物
    霉菌的新朋友—地衣
    地衣和霉菌
    棗霜化學(xué)成分的色譜質(zhì)譜分析
    少妇粗大呻吟视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 黄色成人免费大全| 91av网站免费观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 99热这里只有精品一区 | 天堂动漫精品| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产野战对白在线观看| 久久久久性生活片| 12—13女人毛片做爰片一| 好男人在线观看高清免费视频| 悠悠久久av| 操出白浆在线播放| 我的老师免费观看完整版| 99在线视频只有这里精品首页| 两个人的视频大全免费| 在线观看免费午夜福利视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 91字幕亚洲| 国内精品久久久久久久电影| 大型黄色视频在线免费观看| 午夜老司机福利片| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产97色在线日韩免费| 日韩欧美三级三区| 国产精品久久久久久精品电影| 国产精品亚洲一级av第二区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 免费看日本二区| 欧美色视频一区免费| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产日本99.免费观看| 午夜a级毛片| 淫妇啪啪啪对白视频| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 亚洲av中文字字幕乱码综合| 黄色视频,在线免费观看| 又黄又粗又硬又大视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 女人被狂操c到高潮| 1024视频免费在线观看| 天堂动漫精品| 日本五十路高清| 欧美精品亚洲一区二区| 色老头精品视频在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久草成人影院| 久久天堂一区二区三区四区| 国产成人av激情在线播放| 嫩草影院精品99| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 免费在线观看亚洲国产| 久久 成人 亚洲| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 久久国产精品影院| 日本一区二区免费在线视频| 午夜福利18| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 人人妻人人看人人澡| 淫秽高清视频在线观看| 色老头精品视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产男靠女视频免费网站| 99热这里只有精品一区 | 日韩大尺度精品在线看网址| 免费看美女性在线毛片视频| 又紧又爽又黄一区二区| 久久这里只有精品19| 日韩精品免费视频一区二区三区| 黄色a级毛片大全视频| 丝袜美腿诱惑在线| 女同久久另类99精品国产91| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 在线观看一区二区三区| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久精品国产亚洲av高清一级| 日本黄色视频三级网站网址| av片东京热男人的天堂| 宅男免费午夜| 搞女人的毛片| tocl精华| 亚洲美女黄片视频| 午夜精品一区二区三区免费看| а√天堂www在线а√下载| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 欧美3d第一页| 天堂√8在线中文| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 在线观看日韩欧美| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久精品91无色码中文字幕| 婷婷精品国产亚洲av在线| 级片在线观看| 国产亚洲精品久久久久5区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 老司机福利观看| 国产精品九九99| 黄色成人免费大全| 成人国语在线视频| 亚洲熟妇熟女久久| 国产精品99久久99久久久不卡| 免费在线观看成人毛片| 宅男免费午夜| 婷婷亚洲欧美| 久久久久性生活片| 亚洲熟妇熟女久久| 日本成人三级电影网站| 国产亚洲欧美98| 国产黄a三级三级三级人| 国产精品亚洲一级av第二区| 99久久综合精品五月天人人| 国产精品九九99| 动漫黄色视频在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产精品日韩av在线免费观看| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲avbb在线观看| 午夜日韩欧美国产| 全区人妻精品视频| 国产黄片美女视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产区一区二久久| 成在线人永久免费视频| 亚洲全国av大片| 成人一区二区视频在线观看| 国产精华一区二区三区| 亚洲,欧美精品.| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 午夜福利成人在线免费观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲全国av大片| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产亚洲av高清不卡| 国产精品亚洲一级av第二区| 久热爱精品视频在线9| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美性长视频在线观看| 国产亚洲精品一区二区www| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲国产中文字幕在线视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 黄频高清免费视频| 国产一区在线观看成人免费| 特级一级黄色大片| 成人国语在线视频| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲自拍偷在线| 9191精品国产免费久久| 美女 人体艺术 gogo| 色综合站精品国产| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲av片天天在线观看| xxxwww97欧美| 日本免费a在线| 亚洲美女黄片视频| 亚洲欧美日韩东京热| 人妻久久中文字幕网| av视频在线观看入口| 亚洲国产看品久久| 老司机在亚洲福利影院| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产成人精品无人区| avwww免费| 一级黄色大片毛片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日本一二三区视频观看| 亚洲男人天堂网一区| 12—13女人毛片做爰片一| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 午夜福利在线在线| 老司机深夜福利视频在线观看| 中出人妻视频一区二区| 欧美黑人巨大hd| 亚洲,欧美精品.| 日韩免费av在线播放| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久草成人影院| 1024视频免费在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 18禁观看日本| 国产亚洲精品一区二区www| 色av中文字幕| www.www免费av| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲真实伦在线观看| 欧美性长视频在线观看| 正在播放国产对白刺激| 麻豆成人午夜福利视频| 久久中文字幕人妻熟女| 午夜福利欧美成人| 成人特级黄色片久久久久久久| 欧美最黄视频在线播放免费| 三级毛片av免费| av视频在线观看入口| 人人妻人人看人人澡| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 一级毛片精品| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲五月天丁香| АⅤ资源中文在线天堂| 国产精品影院久久| 老司机在亚洲福利影院| 日韩大尺度精品在线看网址| av片东京热男人的天堂| a级毛片在线看网站| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 制服诱惑二区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 中国美女看黄片| 麻豆成人午夜福利视频| 国产区一区二久久| 日日爽夜夜爽网站| 欧美一级毛片孕妇| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 免费高清视频大片| 成人三级黄色视频| 亚洲电影在线观看av| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 两个人看的免费小视频| 最新在线观看一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 91成年电影在线观看| 在线永久观看黄色视频| 成人手机av| 国内精品久久久久精免费| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 精品国产美女av久久久久小说| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产免费男女视频| 草草在线视频免费看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 高清在线国产一区| 老司机靠b影院| 听说在线观看完整版免费高清| 成人三级做爰电影| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久久久久久久久黄片| 亚洲成av人片免费观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产av一区二区精品久久| 色精品久久人妻99蜜桃| av片东京热男人的天堂| 黄色丝袜av网址大全| 身体一侧抽搐| 久久精品综合一区二区三区| 国产精品 国内视频| 国产av一区在线观看免费| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 美女黄网站色视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 久热爱精品视频在线9| 国产成年人精品一区二区| 一级作爱视频免费观看| 91老司机精品| www.自偷自拍.com| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美一级a爱片免费观看看 | av在线天堂中文字幕| 久久午夜亚洲精品久久| 一级毛片高清免费大全| av免费在线观看网站| 变态另类丝袜制服| 夜夜夜夜夜久久久久| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 精品欧美一区二区三区在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲av成人av| 少妇的丰满在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 岛国视频午夜一区免费看| 免费在线观看亚洲国产| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产精品一区二区三区四区久久| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 九九热线精品视视频播放| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 18禁观看日本| 亚洲精华国产精华精| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美+亚洲+日韩+国产| 午夜免费成人在线视频| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 神马国产精品三级电影在线观看 | 伦理电影免费视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲成人久久性| 一个人免费在线观看电影 | 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 可以在线观看毛片的网站| 大型黄色视频在线免费观看| 天堂√8在线中文| av片东京热男人的天堂| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 中国美女看黄片| 韩国av一区二区三区四区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 欧美成人免费av一区二区三区| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产午夜精品久久久久久| 老司机午夜福利在线观看视频| 女同久久另类99精品国产91| av有码第一页| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲电影在线观看av| 视频区欧美日本亚洲| 中出人妻视频一区二区| 成年版毛片免费区| 久久精品国产清高在天天线| 日韩有码中文字幕| 日韩国内少妇激情av| 1024香蕉在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 不卡av一区二区三区| 丰满的人妻完整版| 热99re8久久精品国产| 又黄又爽又免费观看的视频| 岛国视频午夜一区免费看| 一进一出抽搐动态| 国产精品亚洲美女久久久| 午夜免费观看网址| 国产单亲对白刺激| 嫩草影视91久久| 亚洲五月婷婷丁香| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久国产精品人妻蜜桃| 十八禁网站免费在线| 怎么达到女性高潮| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久香蕉国产精品| 久久久久久久久中文| 视频区欧美日本亚洲| 成人精品一区二区免费| 叶爱在线成人免费视频播放| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产黄片美女视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 在线观看www视频免费| 精品久久久久久久末码| 黄色成人免费大全| 91国产中文字幕| 国产一级毛片七仙女欲春2| 91国产中文字幕| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产av又大| 黄色 视频免费看| tocl精华| 一区二区三区高清视频在线| 免费在线观看亚洲国产| 国产成人系列免费观看| 成人亚洲精品av一区二区| av欧美777| 国产精品 欧美亚洲| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| www.精华液| 久久这里只有精品中国| 午夜久久久久精精品| 香蕉av资源在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲精品美女久久av网站| 黄色毛片三级朝国网站| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国产精品九九99| 99国产精品99久久久久| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美乱色亚洲激情| 久久亚洲真实| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 好男人在线观看高清免费视频| 老司机靠b影院| 亚洲人与动物交配视频| 日韩欧美精品v在线| www国产在线视频色| 国产又色又爽无遮挡免费看| 级片在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 人人妻人人看人人澡| 久久中文字幕人妻熟女| 国产免费男女视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久香蕉激情| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产激情久久老熟女| 99久久精品热视频| 怎么达到女性高潮| 听说在线观看完整版免费高清| 老司机深夜福利视频在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲电影在线观看av| 在线观看日韩欧美| 亚洲自拍偷在线| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲激情在线av| 亚洲在线自拍视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 精品久久久久久久末码| 悠悠久久av| 老司机午夜十八禁免费视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 99热这里只有是精品50| 国产亚洲欧美在线一区二区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 露出奶头的视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| www日本黄色视频网| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲精品色激情综合| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 精品国产乱码久久久久久男人| 免费一级毛片在线播放高清视频| 18禁观看日本| 国产成人系列免费观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 麻豆成人av在线观看| 宅男免费午夜| 欧美丝袜亚洲另类 | 精品久久蜜臀av无| 亚洲 国产 在线| 久久久久性生活片| 成人av一区二区三区在线看| 国产精华一区二区三区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 岛国在线免费视频观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| av有码第一页| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲精品色激情综合| 制服人妻中文乱码| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 很黄的视频免费| 又粗又爽又猛毛片免费看| 成人av在线播放网站| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 曰老女人黄片| 大型av网站在线播放| 亚洲国产精品合色在线| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 免费在线观看日本一区| 亚洲国产看品久久| 亚洲男人天堂网一区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 最好的美女福利视频网| 99精品久久久久人妻精品| 国产成人精品久久二区二区免费| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲在线自拍视频| 久久中文看片网| 91大片在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 日韩欧美在线二视频| 一区福利在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲性夜色夜夜综合| 日本一本二区三区精品| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产高清videossex| 美女午夜性视频免费| 国产精品亚洲av一区麻豆| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| av福利片在线| 老熟妇仑乱视频hdxx| 最近在线观看免费完整版| 亚洲成人久久性| 一级作爱视频免费观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 999久久久精品免费观看国产| 两性夫妻黄色片| 色哟哟哟哟哟哟| 久99久视频精品免费| 好男人电影高清在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 嫩草影视91久久| aaaaa片日本免费| 久久人人精品亚洲av| 最新在线观看一区二区三区| 色在线成人网| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产精品久久电影中文字幕| 国产av一区二区精品久久| 亚洲天堂国产精品一区在线| 免费在线观看完整版高清| 亚洲 欧美一区二区三区| av有码第一页| 看片在线看免费视频| 国产精品精品国产色婷婷| 91九色精品人成在线观看| 日韩三级视频一区二区三区| 久久久久国内视频| 国产亚洲av高清不卡| 午夜福利在线观看吧| 亚洲一区中文字幕在线| 黄片大片在线免费观看| 大型黄色视频在线免费观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 日本一本二区三区精品| 九九热线精品视视频播放| 欧美性长视频在线观看| 久久亚洲真实| 国产精品久久久久久久电影 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 成在线人永久免费视频| 又黄又粗又硬又大视频| av在线天堂中文字幕| 成人精品一区二区免费| 91成年电影在线观看| 看免费av毛片| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 女同久久另类99精品国产91| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 色av中文字幕| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久香蕉激情| 亚洲一区二区三区不卡视频| 日本免费a在线| 一区二区三区国产精品乱码| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产精品亚洲美女久久久| 听说在线观看完整版免费高清| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产成人精品无人区| 国产伦在线观看视频一区| 极品教师在线免费播放| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 大型av网站在线播放| 国产精品1区2区在线观看.| 1024视频免费在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 99热只有精品国产| 一级毛片精品| 日本a在线网址| 国产精品98久久久久久宅男小说| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 黄色 视频免费看| 国产成人影院久久av| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 啪啪无遮挡十八禁网站| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 精品无人区乱码1区二区| ponron亚洲| 性欧美人与动物交配| 1024香蕉在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 日韩三级视频一区二区三区| 国产人伦9x9x在线观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲片人在线观看| 九色国产91popny在线| 久久久久久久午夜电影| 成人亚洲精品av一区二区| 日本 av在线| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 99在线人妻在线中文字幕| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产一区二区激情短视频| 日韩欧美在线乱码| 18禁美女被吸乳视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 不卡av一区二区三区| 亚洲九九香蕉| av免费在线观看网站| 国产亚洲av嫩草精品影院| 少妇熟女aⅴ在线视频| 制服诱惑二区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 精品一区二区三区四区五区乱码| 巨乳人妻的诱惑在线观看|