葡萄釀制過程中5種殺菌劑的殘留變化

章麗君，章 虎，徐明飛，林春綿，吳慧珍，徐 杰，錢鳴蓉，*

(1.浙江工業(yè)大學 環(huán)境學院，浙江 杭州 310032； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品質量標準研究所，浙江 杭州 310021； 3.浙江樹人大學 生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州 310015)

食品安全問題日益成為全社會關注的焦點。農(nóng)藥在水果、蔬菜等食品中的殘留問題是近年社會民生熱點之一，葡萄酒中潛在的農(nóng)藥殘留風險也不容忽視[1-4]。農(nóng)藥可用于保護作物免受外生生物的侵害，但過高的殘留水平可能會對人體健康造成危害[5-6]。目前，中國國家食品安全標準中未有關于葡萄酒中農(nóng)藥最大殘留限量(MRL)的規(guī)定。隨著公眾對食品安全標準要求的提高，以及家釀葡萄酒在民間的普及，有必要對典型殺菌劑在葡萄家釀過程中的殘留變化進行研究，為家釀葡萄制酒過程中殺菌劑殘留風險評估提供基礎數(shù)據(jù)，以確保消費者的飲用安全。同時，針對家釀葡萄酒過程中殺菌劑殘留變化的研究，也可作為優(yōu)化家釀過程，降低殺菌劑在酒汁中殘留量，促進家釀葡萄酒健康消費的重要依據(jù)。Cabras等[7]指出，葡萄酒中某些農(nóng)藥的殘留水平不僅與藥物化學性質有關，還與釀酒工藝中酵母菌的活性相關。此外，葡萄酒中農(nóng)藥殘留還受釀造工藝、環(huán)境條件等因素的影響[8-10]。文獻顯示，葡萄酒在釀造過程中，酒泥中的農(nóng)藥殘留水平遠高于葡萄酒汁中[11-14]。本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜(HPLC-MS/MS)測定腈菌唑、雙炔酰菌胺、噁唑菌酮、丙環(huán)唑和苯醚甲環(huán)唑5種常見殺菌劑在葡萄家釀過程中的殘留變化，并考查了酵母菌添加對其的影響，以期為相關研究提供基礎資料與數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

紅葡萄，取自杭州地區(qū)葡萄種植基地；RW安琪紅葡萄酒果酒專用酵母，安琪酵母股份有限公司；D254釀酒酵母，法國Lalvin公司。固相萃取柱，HLB 6cc(200 mg)，Waters。色譜級甲醇，德國Merck公司；乙酸(純度≥99.7%)，美國Sigma-Aldrich公司。殺菌劑標準品均購于德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司：腈菌唑，純度99.5%；噁唑菌酮，純度99.0%；雙炔酰菌胺，純度98.5%；丙環(huán)唑，純度99.0%；苯醚甲環(huán)唑，純度98.7%。

1.2 實驗儀器

HPLC-MS/MS: Surveryor高效液相色譜，TSQ Quantum Discovery三重四級桿質譜，美國Thermo Fisher Scientific公司。QT-2型漩渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司；KQ5200B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。BSA822-CW電子分析天平(精確至0.01 g)，德國Satorius公司。

1.3 實驗方法

田間噴藥。參照《農(nóng)藥登記殘留田間試驗標準操作規(guī)程》和杭州地區(qū)操作經(jīng)驗，依據(jù)氣候和病害情況，在6月進行葡萄上的農(nóng)藥噴施。殺菌劑均以參照農(nóng)藥登記最高劑量的1.5倍施藥：腈菌唑(美國陶氏益農(nóng)公司40%可濕性粒劑)，用藥量150 mg·kg-1，噴霧；噁唑菌酮(美國杜邦公司6.25%水分散粒劑)，用藥量1 800倍液，噴霧；雙炔酰菌胺(瑞士先正達作物保護有限公司23.4%懸浮劑)，用藥量250 mg·kg-1，噴霧；對苯醚甲環(huán)唑和丙環(huán)唑，參照苯醚甲環(huán)唑最高劑量1.5倍施藥(苯醚甲環(huán)唑和丙環(huán)唑混劑，四川貝爾化工集團有限公司30%水乳劑，苯醚甲環(huán)唑和丙環(huán)唑各15%)，用藥量80 mg·kg-1，噴霧。每個處理設平行小區(qū)3個，每小區(qū)面積60 m2，另設對照區(qū)1個。

釀酒過程。采摘施藥14 d后的成熟葡萄以及空白組(未施藥)葡萄用于釀酒試驗。用剪刀貼近果蒂處把葡萄剪下來，選取成熟、新鮮、無病蟲、無腐爛，品質好的葡萄，去除癟粒、霉粒、青粒。設3個實驗處理：CK，施藥葡萄發(fā)酵；D254，施藥葡萄+D254釀酒酵母發(fā)酵；RW，施藥葡萄+RW安琪紅葡萄酒果酒專用酵母發(fā)酵，每處理重復3次。另取未施藥葡萄作空白對照。具體操作如下：將5 kg葡萄樣品擠破，葡萄肉和葡萄皮擠碎后放到主發(fā)酵容器中(裝樣量不超過容器的70%)，將發(fā)酵容器置于陰涼、通風、室溫(25 ℃)條件下：1～9 d為初發(fā)酵過程，于第2天向各處理中加入0.1 kg白糖并攪拌均勻，并在D254和RW處理的發(fā)酵罐中分別加入1 g D254釀酒酵母或1 g RW安琪紅葡萄酒果酒專用酵母，于第4天重復第2天的加糖和攪拌操作，初發(fā)酵期間每天用消毒過的玻璃棒攪動樣品；9 d后為后發(fā)酵過程，利用虹吸法，用膠管將葡萄酒汁倒入二次發(fā)酵器，用細紗布過濾葡萄皮、籽、糟等，濾液并入二次發(fā)酵容器中，發(fā)酵容器留有1/10空隙，封蓋處保留縫隙。按照以上發(fā)酵過程，在實驗開始前，和實驗開始后1、3、5、7、9、15、21、26 d分別取發(fā)酵汁液和初發(fā)酵過程中的葡萄渣樣品，發(fā)酵酒汁樣品不少于20 mL，葡萄渣樣品不少于20 g，取樣前充分振搖發(fā)酵容器。樣品采集后，立即低溫(-20 ℃)保存。

1.4 分析方法

樣品前處理。葡萄酒汁樣品經(jīng)解凍后取5 mL于50 mL離心管中，加入10 mL去離子水渦旋混合，調(diào)節(jié)pH至3.6。離心后將15 mL混合液轉移至HLB(200 mg)固相萃取柱中(使用前，先后用5 mL甲醇、5 mL乙酸調(diào)節(jié)pH至3.6的去離子水活化凈化柱)，去離子水洗滌小柱后用5 mL甲醇洗脫，洗脫液經(jīng)0.22 μm 有機濾膜過濾，用HPLC-MS/MS進行分析。稱取葡萄渣樣品15 g搗碎勻漿，加入15 mL經(jīng)1%乙酸酸化的乙腈，混合物渦旋后超聲15 min，再加入6 g無水硫酸鎂、1.5 g無水醋酸鈉，迅速振搖5 min，離心，將上層乙腈提取物轉移至含有 50 mgN-丙基乙二胺(PSA)、50 mg C18和150 mg無水硫酸鎂的離心管中，渦旋混合并離心，再取0.5 mL上層乙腈提取物轉移至含有0.5 mL去離子水的離心管中，渦旋均勻，過0.22 μm有機濾膜后待測。HPLC-MS/MS分析條件詳見表1。

2 結果與分析

2.1 分析方法驗證

采用2.5、5、10、50、250 μg·L-1系列濃度構建標準曲線，外標法進行定量。以離子信噪比為3∶1和10∶1分別計算5種殺菌劑的檢測限(LOD)和定量限(LOQ)。通過日內(nèi)重復性和日間重復性確定方法的精確度，以相對標準偏差(RSD)表示。對于日內(nèi)重復性，同一天分析添加濃度為2.5、5、50、250 μg·kg-1的樣品5次；對于日間重復性，連續(xù)3 d分析添加濃度為2.5、5、50、250 μg·kg-1的樣品。

將目標殺菌劑添加到空白葡萄酒汁及葡萄渣樣品進行重復實驗。結果表明，本文所用的檢測方法具有良好的線性(R2>0.999)，在供試濃度水平下，5種殺菌劑在葡萄酒汁中的回收率為75.4%～112.5%(表2)，在葡萄渣中的回收率為87.1%～105.5%(表3)。

2.2 釀酒過程中5種殺菌劑的殘留變化

如圖1所示，家釀過程中無論是否添加酵母，腈菌唑和雙炔酰菌胺殘留水平都先下降再上升接著下降，之后處于較穩(wěn)定水平。分析原因，可能是發(fā)酵前3 d速度較緩慢，酒汁中腈菌唑和雙炔酰菌胺的含量受降解的影響；隨著發(fā)酵進行，葡萄果肉中的腈菌唑和雙炔酰菌胺逐漸遷移至汁中，所以在5 d時顯示濃度升高；之后腈菌唑和雙炔酰菌胺的降解幅度逐漸強于遷移作用，7 d時顯示濃度下降；至9 d時，二者濃度又回升，尤其是添加酵母的處理，其酒汁中雙炔酰菌胺濃度高于初始濃度；9 d后濾出葡萄渣，初發(fā)酵結束，殺菌劑濃度處于穩(wěn)定水平。酒汁中的噁唑菌酮濃度先上升再下降然后趨于穩(wěn)定。發(fā)酵3 d，可能由于果肉中噁唑菌酮的遷移起主導作用，殘留水平呈上升趨勢；之后隨著發(fā)酵的進行，噁唑菌酮的降解作用逐漸占優(yōu)勢，殘留水平開始下降。

表1HPLC-MS/MS分析條件

Table1HPLC-MS/MS analysis conditions

殺菌劑Fungicide色譜條件Chromatographic conditions色譜柱Column柱溫Columntemperature/℃流速Flow rate/(mL·min-1)流動相Mobilephase質譜參數(shù)MS/MS conditions定量離子Quantita-tiveion碰撞能Collisionenergy/eV定性離子Qualita-tiveion碰撞能Collisionenergy/eV腈菌唑Luna C18250.290% CH3OH289>7015289>12520Myclobutanil(5 μm)噁唑菌酮392>3317392>23814Famoxadone雙炔酰菌胺412>32815412>12527Mandipropamid丙環(huán)唑342>15929342>6931Propiconazole苯醚甲環(huán)唑406>25123406>18839Difenoconazole

表2五種殺菌劑在葡萄酒汁中的回收率

Table2Recovery rate of 5 fungicides in grape wine

殺菌劑Fungicide添加濃度Concentration/(μg·kg-1)日內(nèi)回收率(n=5)Intraday recovery rate/%(RSD)1 d2 d3 d日間相對標準偏差(n=3)Interday RSD/%LOD/(μg·kg-1)LOQ/(μg·kg-1)腈菌唑2.593.4 (1.2)96.9 (1.8)91.8 (6.0)2.20.51.5Myclobutanil584.9 (2.3)86.9 (5.5)94.1 (5.7)7.25094.8 (4.4)94.1 (3.5)97.1 (7.9)0.4250108.9 (0.4)110.7 (1.8)108.6 (4.6)3.8噁唑菌酮2.582.8 (9.7)76.1 (1.9)75.9 (1.4)7.40.31.0Famoxadone575.4 (4.3)82.8 (8.6)86.2 (2.7)9.75076.7 (1.1)75.6 (7.1)83.5 (5.8)3.425076.7 (0.6)82.8 (9.8)85.6 (4.8)7.3雙炔酰菌胺2.5102.5 (9.3)98.5 (8.8)98.1 (8.2)2.40.82.5Mandipropamid593.4 (2.7)96.9 (7.7)101.9 (0.4)4.45092.0 (2.3)94.2 (1.2)93.1 (3.1)1.225092.3 (1.3)96.0 (6.6)95.4 (7.5)2.1丙環(huán)唑2.5100.5 (9.5)107.8 (0.7)106.9 (1.8)4.40.51.5Propiconazole592.7 (4.6)96.2 (0.7)102.9 (8.5)8.650101.8 (2.1)104.9 (2.8)105.9 (0.9)1.525085.6 (8.5)89.8 (1.6)90.6 (2.8)3.0苯醚甲環(huán)唑2.598.2 (2.4)102.2 (3.3)103.2 (1.9)2.70.31.0Difenoconazole589.1 (4.5)94.9 (2.5)98.3 (5.7)5.450104.4 (7.7)112.5 (3.0)112.5 (3.1)4.225099.6 (5.2)103.7 (0.7)109.3 (6.5)4.7

回收率數(shù)據(jù)后括號中的數(shù)字表示相應的相對標準偏差。下同。

Data in bracket after recovery rate was the according relative standard deviation (RSD). The same as below.

表3五種殺菌劑在葡萄渣中的回收率

Table3Recovery rate of 5 fungicides in grape sediment

殺菌劑Fungicide添加濃度Concentration/(μg·kg-1)日內(nèi)回收率(n=5)Intraday recovery rate/%(RSD)1 d2 d3 d日間相對標準偏差(n=3)Interday RSD/%LOD/(μg·kg-1)LOQ/(μg·kg-1)腈菌唑2.599.9 (1.7)96.2 (6.4)94.1 (6.5)3.00.51.5Myclobutanil598.2 (5.4)99.7 (8.9)99.6 (4.7)0.850103.7 (1.7)94.5 (6.7)96.6 (3.9)4.925098.6 (4.2)100.8 (0.7)100.7 (4.5)1.2噁唑菌酮2.597.4 (8.1)95.0 (7.5)95.7 (5.0)1.20.62.0Famoxadone597.4 (4.1)97.9 (1.6)98.3 (2.7)0.550101.2 (4.9)96.7 (3.1)100.4 (1.7)2.425097.8 (1.1)98.9 (2.5)100.0 (2.7)1.1雙炔酰菌胺2.587.1 (9.2)101.7 (2.8)95.1 (8.0)7.30.31.0Mandipropamid598.2 (7.1)103.6 (9.1)99.9 (4.3)2.85096.5 (6.6)105.5 (2.9)92.7 (2.8)6.525099.0 (5.6)104.7 (9.2)99.7 (6.5)3.1丙環(huán)唑2.596.1 (7.6)93.4 (3.6)97.6 (5.6)2.10.31.0Propiconazole598.8 (5.2)96.1 (4.7)102.7 (4.7)3.35092.3 (5.9)92.7 (4.8)95.9 (2.6)2.025096.4 (6.5)93.5 (5.5)99.2 (2.0)2.8苯醚甲環(huán)唑2.597.4 (3.4)101.7 (3.8)93.8 (2.1)4.00.51.5Difenoconazole599.1 (2.5)95.9 (4.5)97.6 (7.5)1.650103.2 (5.7)100.4 (5.9)101.2 (6.1)1.425099.0 (5.6)95.7 (6.7)98.7 (5.4)1.8

圖1 五種殺菌劑在葡萄家釀過程中的殘留變化Fig.1 Dynamic changes of five fungicides residue in homemade wine fermentation process

丙環(huán)唑與腈菌唑及雙炔酰菌胺的濃度變化趨勢一致，而苯醚甲環(huán)唑濃度則一直呈下降趨勢，于9 d后趨于穩(wěn)定。

取初發(fā)酵結束時的葡萄渣，測定其中5種殺菌劑的殘留量，結果如表4所示，各處理之間無顯著差異。總體來看，添加酵母菌對葡萄酒家釀過程中5種殺菌劑的殘留變化無顯著改變，5種殺菌劑的殘留變化差異可能主要源于其理化性狀差異。

王玉路等[15]研究表明，初發(fā)酵(酒精發(fā)酵)過程中，發(fā)酵液中目標農(nóng)藥無明顯降解，其降解主要發(fā)生在二次發(fā)酵和陳釀期過程。本研究顯示，家釀初發(fā)酵過程中不同殺菌劑的遷移與降解有差異，且在二次發(fā)酵過程中，5種殺菌劑殘留水平都呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢。這可能是因為不同研究所采用的釀造工藝不同。家釀葡萄酒步驟操作簡單，且未使用亞硫酸進行殺菌抗氧化。

表4發(fā)酵9 d后葡萄渣中5種殺菌劑的殘留量

Table4Residue levels of 5 fungicides in grape residue after 9 d fermentation μg·kg-1

3 結論

本研究以噴施藥劑的葡萄為材料，探索了葡萄酒家釀過程中殺菌劑殘留的動態(tài)變化。結果表明，在初發(fā)酵過程，不同殺菌劑呈現(xiàn)了不同程度的降解，至初發(fā)酵結束，腈菌唑和雙炔酰菌胺在添加酵母菌的發(fā)酵體系中沒有呈現(xiàn)明顯降解趨勢。在二次發(fā)酵過程中，5種殺菌劑殘留含量趨穩(wěn)。5種殺菌劑的遷移水平和降解趨勢均存在差異，但添加酵母對其無顯著影響。