羽衣甘藍(lán)β-胡蘿卜素羥化酶基因的克隆及表達(dá)分析

王玉書，王 歡，郭 宇，周明慧，陳 璐，陳 陽(yáng)

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江省抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.齊齊哈爾大學(xué) 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

類胡蘿卜素是在自然界植物、細(xì)菌和真菌中廣泛存在的一類色素類物質(zhì)，同時(shí)在植物光合作用中起重要作用[1-2]。β-胡蘿卜素羥化酶在植物類胡蘿卜素生物合成代謝途徑中具有非常重要的作用，其作用是催化β-胡蘿卜素通過(guò)中間代謝物β-隱黃質(zhì)生成玉米黃質(zhì)，因其增加了植物細(xì)胞中玉米黃質(zhì)的含量，所以該反應(yīng)在植物葉黃素循環(huán)中有非常重要的意義[3]。有研究表明，β-胡蘿卜素羥化酶基因的過(guò)量表達(dá)有助于細(xì)胞中玉米黃質(zhì)的過(guò)量積累，進(jìn)而提高細(xì)胞中類胡蘿卜素含量[4]；而利用反義抑制和T-DNA突變獲得抑制β-羥化酶基因表達(dá)的擬南芥植株，由于β-羥化酶基因的缺陷，它們合成隱黃素等類胡蘿卜素的能力減弱，抗逆性隨之大幅下降[5-6]。目前已從擬南芥[7]、煙草[8]、柑橘[9]、辣椒[10]等植物中分離鑒定了許多β-胡蘿卜素羥化酶基因。通過(guò)生物信息學(xué)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，這些基因均具有非常保守的同源序列。

羽衣甘藍(lán)葉片顏色鮮艷，較耐嚴(yán)寒、干旱，因此成為冬春季節(jié)中重要的綠化景觀植物。研究表明，在羽衣甘藍(lán)生長(zhǎng)過(guò)程中，葉色與葉綠素、類胡蘿卜素及花青素的含量密切相關(guān)[11]。然而到目前為止，關(guān)于羽衣甘藍(lán)中類胡蘿卜素生物合成途徑的相關(guān)基因研究還鮮有報(bào)道。本研究采用同源克隆和RT-PCR技術(shù)獲得羽衣甘藍(lán)β-胡蘿卜素羥化酶基因BoBCH，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，研究該基因在不同組織、不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，為羽衣甘藍(lán)β-胡蘿卜素羥化酶基因的功能鑒定及調(diào)節(jié)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

紫葉羽衣甘藍(lán)DH系D07于2017年1月種植于齊齊哈爾大學(xué)園藝試驗(yàn)基地，分別取D07的根、莖、葉不同組織和幼苗期、蓮座期、觀賞期3個(gè)時(shí)期的幼嫩葉片，經(jīng)液氮速凍后-80 ℃保存，備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成

利用Trizol(Invitrogen，USA)試劑盒提取羽衣甘藍(lán)總RNA，之后經(jīng)NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific，USA)測(cè)定濃度及D260/D280，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。檢測(cè)合格后，取經(jīng)DNase處理后RNA作為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg植物總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，檢測(cè)待用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與基因克隆

基于作者前期全基因組測(cè)序篩選得到的BoBCH基因序列，設(shè)計(jì)克隆引物F(5′-ATGGCGGCAGCACTCTCATCAATCTC-3′)和R(5′-AGAGGTGGAAACCTTGTTGTATAATTTGTAA-3′)。cDNA擴(kuò)增使用ABI Veriti PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行。PCR體系：2×Ultra-Pfu Master Mix酶(Dye Plus)5 μL、模板1 μL、正反引物各0.8 μL和ddH2O 2.4 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。PCR產(chǎn)物電泳分析后，回收、連接、轉(zhuǎn)化及測(cè)序，得到BoBCH的cDNA序列信息。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站對(duì)BoBCH的cDNA序列在線查找開(kāi)放閱讀框(ORF)；利用蛋白質(zhì)分析在線工具(http：//web.expasy.org/protparam/)在線程序分析編碼蛋白的理化性質(zhì)(氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等)；利用ExPasy-ProtScale預(yù)測(cè)氨基酸的親/疏水性；利用NCBI在線工具CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域；利用SignalP4.1和Wolf-Psort進(jìn)行信號(hào)肽和蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；TMHMM2.0對(duì)蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析；用MEGA6.0軟件采用鄰接法進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 基因表達(dá)分析

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)熒光定量引物分別為BoBCH-F和BoBCH-R，以18S rRNA作為內(nèi)參，引物為18S rRNA-F和18S rRNA-R(表1)。引物采用Roche LCPDS2軟件設(shè)計(jì)并由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)根據(jù)QuantiFast? SYBR? Green PCR Kit試劑盒(Qiagen，Germany)說(shuō)明書，在Light Cycler?480Ⅱ型熒光定量PCR儀(Roche，Swiss)上進(jìn)行反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)采用3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)用2-△△Ct算法進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算[12]。

表1PCR引物

Table1The primers of PCR used in this study

引物名稱Primer name引物序列Sequence(5'-3')18S rRNA-FTCGCCGTAACACTCAAACCA18S rRNA-RTGACTGAGGCGAGAGTTAGABoBCH-FCCAGGTCCAGACATAGTAAGBoBCH-RGTACAAAGGGCAGGGACGTA

2 結(jié)果與分析

2.1 BoBCH基因的克隆

以羽衣甘藍(lán)D07觀賞期葉片cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增后獲得BoBCH基因片段，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得條帶與預(yù)期大小相符(圖1)。對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行測(cè)序分析，將該基因命名為BoBCH(GenBank登錄號(hào)為MH016242)。

2.2 BoBCH基因cDNA序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1BoBCH基因編碼氨基酸序列分析

利用ORF finder在線工具翻譯BoBCH的cDNA序列，BoBCH基因編碼301個(gè)氨基酸。利用蛋白質(zhì)分析在線工具(http：//web.expasy.org/protparam/)分析BoBCH蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明BoBCH蛋白由20種氨基酸組成，其中絲氨酸(Ser)含量最多，半胱氨酸(Cys)含量最少，帶負(fù)電氨基酸殘基25個(gè)，帶正電氨基酸殘基37個(gè)；分子量約為33.8 ku，理論等電點(diǎn)為9.67；親水性平均系數(shù)(GRAVY)為-0.072，說(shuō)明BoBCH蛋白為親水蛋白。利用ExPasy-ProtScale預(yù)測(cè)氨基酸的親/疏水性表明：該蛋白的最高值為2.133，在第140個(gè)氨基酸處，疏水性最強(qiáng)；最低值為-3.044，在第170個(gè)氨基酸處，親水性最強(qiáng)。同時(shí)，從整條多肽鏈的氨基酸預(yù)測(cè)值來(lái)看，親水性氨基酸殘基所占比例高于疏水氨基酸殘基，由此推斷，BoBCH蛋白是一種親水性蛋白，與基因編碼氨基酸序列的分析結(jié)果一致。利用NCBI在線工具CDD分析BoBCH氨基酸保守蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，BoBCH屬于FA_hydroxylase蛋白超家族(圖2)。

M， DNA marker； 1～3， RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。M, DNA marker; 1-3, RT-PCR products.圖1 羽衣甘藍(lán)BoBCH基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of BoBCH gene from the kale

2.2.2 BoBCH蛋白的信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

運(yùn)用在線工具Signal P4.1 server進(jìn)行信號(hào)肽分析預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，C值、S值、Y值均小于閾值0.45，推測(cè)BoBCH蛋白無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，屬于非分泌蛋白。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析顯示， BoBCH蛋白在93～115、130～152、183～200和204～226處有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖3)。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，BoBCH可能定位于葉綠體中。

2.2.3 BoBCH蛋白序列的進(jìn)化分析

為了預(yù)測(cè)BoBCH基因的功能，從NCBI中查找到其他植物的BCH同源蛋白序列，采用MEGA6.0鄰接法與羽衣甘藍(lán)BCH蛋白序列對(duì)比并構(gòu)建無(wú)根系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。羽衣甘藍(lán)與結(jié)球甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜、擬南芥等10個(gè)高等植物的BCH序列比對(duì)顯示，這11個(gè)植物BCH氨基酸序列被聚為兩大類。羽衣甘藍(lán)BCH與結(jié)球甘藍(lán)處于同一分支，其親緣關(guān)系最近，其序列一致性高達(dá)99%；與醉蝶花、蘿卜、大白菜等物種的BCH蛋白在進(jìn)化上親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 BoBCH基因特異性表達(dá)分析

圖2 BoBCH的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of BoBCH conserved domains

圖3 BoBCH蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of transmembrane domains in BoBCH protein

為了研究BoBCH基因在羽衣甘藍(lán)不同組織中的表達(dá)情況，對(duì)不同組織提取的RNA進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR分析。結(jié)果表明，觀賞期BoBCH在不同器官中均有表達(dá)，但表達(dá)具有組織特異性，其在葉片中表達(dá)量最高，極顯著高于其他器官(P<0.01)；其次是莖；而在根中表達(dá)量最少，與其他組織表達(dá)差異極顯著(P<0.01)。BoBCH基因在D07幼苗期、蓮座期和觀賞期3個(gè)時(shí)期葉片中的表達(dá)量也存在顯著差異，其中觀賞期時(shí)表達(dá)量最高，蓮座期和幼苗期表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，觀賞期BoBCH的表達(dá)量約為其他兩個(gè)時(shí)期表達(dá)量的10倍(圖5)。

圖4 羽衣甘藍(lán)BoBCH與其他植物BCH蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree analysis of BoBCH protein in kale and BCHs of other plants

3 討論

本研究利用同源克隆技術(shù)從羽衣甘藍(lán)D07中克隆得到BoBCH基因的全長(zhǎng)cDNA序列。通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)，BoBCH與結(jié)球甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜、擬南芥、琴葉擬南芥等植物的BCH氨基酸序列相似性達(dá)76%以上，它們均屬于FA_hydroxylase蛋白超家族，表明該結(jié)構(gòu)域在分析進(jìn)化過(guò)程中穩(wěn)定性較好，在類胡蘿卜合成及抵抗非生物脅迫中發(fā)揮類似的作用[13-14]。氨基酸序列同源性分析表明，BoBCH蛋白與結(jié)球甘藍(lán)蛋白在同一分支，進(jìn)化關(guān)系最近，因此推測(cè)它們應(yīng)該具有相類似的功能，可能與類胡蘿卜素合成有關(guān)?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)得知，BoBCH蛋白含有脂肪酸羥化酶超家族保守域(BoBCH保守區(qū)域分別為93～115、130～152、183～200和204～226處殘基)，可能定位于葉綠體中。這與目前己報(bào)道的其他物種中β-胡蘿卜素羥化酶定位于葉綠體類囊體膜上的結(jié)論一致[15]，推測(cè)該類酶經(jīng)由葉綠體導(dǎo)肽從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)饺~綠體類囊體膜上。這些生物信息分析對(duì)于將來(lái)研究BoBCH蛋白相關(guān)功能具有指導(dǎo)意義。

不同大寫字母代表不同組織或發(fā)育時(shí)期間表達(dá)量差異顯著(P<0.01)。The bars with different capital letters showed the significance(P<0.01).圖5 BoBCH在D07不同組織和不同發(fā)育時(shí)期中的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of BoBCH in different tissues and different developmental stages of D07

研究發(fā)現(xiàn)，羽衣甘藍(lán)β-胡蘿卜素羥化酶基因BoBCH在根、莖、葉中均能表達(dá)，但不同組織器官中存在顯著性差異，BoBCH在葉片中的表達(dá)量最高，其次是莖，根中表達(dá)量最低。在不同發(fā)育階段的結(jié)果表明，在幼苗期與蓮座期時(shí)，BoBCH基因表達(dá)量均較低，并且無(wú)顯著差異，然而觀賞期時(shí)BoBCH的表達(dá)量高達(dá)幼苗期與蓮座期的10倍之多，表明在觀賞期時(shí)葉片中BoBCH基因積累較多，并發(fā)揮其催化作用。這可能是因?yàn)锽oBCH的活性與葉片中類胡蘿卜素含量密切相關(guān)[16]，說(shuō)明本研究克隆得到的BoBCH基因可能在羽衣甘藍(lán)葉片的類胡蘿卜素合成途徑中發(fā)揮重要作用。

本研究克隆獲得羽衣甘藍(lán)BoBCH基因的cDNA序列，并對(duì)該基因在不同組織及不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，推測(cè)BoBCH基因在羽衣甘藍(lán)類胡蘿卜素代謝調(diào)控中起重要作用。后續(xù)研究中，將會(huì)就該基因的瞬時(shí)表達(dá)、轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證等方面進(jìn)行BoBCH基因功能的研究，并對(duì)該基因與類胡蘿卜素生物合成途徑中相關(guān)酶基因之間的互作關(guān)系進(jìn)行深入研究，進(jìn)而全面解析羽衣甘藍(lán)類胡蘿卜素合成代謝調(diào)控的分子機(jī)制。