百子蓮2個ARF基因與2個Aux/IAA基因的全長克隆與序列分析

楊 舟，呂 可，呂 珊，王俊杰，張 荻

(上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 園林科學(xué)與工程系，上海 200240)

百子蓮(Agapanthuspraecox)又稱藍(lán)百合，是百子蓮科百子蓮屬多年生觀賞花卉，原產(chǎn)于非洲南部，花量大而美麗，在歐美地區(qū)常作為庭院觀賞和高檔鮮切花應(yīng)用，具有良好的觀賞價值和應(yīng)用前景，我國于2002年將其引入上海地區(qū)，引種栽培研究中發(fā)現(xiàn)夏季高溫高濕氣候引起百子蓮結(jié)實率與種子萌發(fā)率下降，嚴(yán)重限制了品種生產(chǎn)與推廣。2010年后建立百子蓮體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系、組織培養(yǎng)擴(kuò)繁與種質(zhì)資源保存等體系，為該品種在園林景觀的應(yīng)用奠定了重要技術(shù)保障[1-2]。目前，體細(xì)胞胚胎發(fā)生是百子蓮快速繁殖和優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源保存的主要方法[1]。

生長素作為唯一具有極性運(yùn)輸特征的植物內(nèi)源激素，是大多數(shù)植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生必不可少的啟動因子，對花芽分化、根莖生長發(fā)育、器官發(fā)育與衰老、維持頂端優(yōu)勢、胚胎極性結(jié)構(gòu)建立等諸多植物生長過程起到重要的調(diào)節(jié)作用[3-4]。近年研究表明，生長素對于百子蓮花芽分化、胚胎發(fā)育和胚性愈傷組織誘導(dǎo)等生理過程具有重要的調(diào)控作用[2]。生長素信號通過作用于下游復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)控植物多方面的生物過程，其主要元件(TIR/AFB、Aux/IAA與ARF)都具有各自的基因家族[5]。其中，生長素響應(yīng)因子(auxin response factors，ARF)與生長素信號負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子生長素/吲哚乙酸(auxin/indole acetic acid proteins，Aux/IAA)是參與生長素信號調(diào)控下游基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子[6-7]。Aux/IAA蛋白通過蛋白互作控制ARF蛋白的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)生長素相關(guān)基因的表達(dá)[8-9]。當(dāng)植物體內(nèi)的生長素含量較低時，Aux/IAA蛋白與ARF蛋白相結(jié)合，抑制生長素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)生長素含量上升時，生長素會結(jié)合自身受體蛋白TIR1，促進(jìn)Aux/IAA蛋白的降解，減少其對ARF轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用，使得ARFs能夠調(diào)控生長素信號應(yīng)答基因的表達(dá)[5， 9]。

前期有關(guān)百子蓮體胚體系構(gòu)建的研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的外源生長素類調(diào)控物質(zhì)毒莠定PIC(4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸，picloram)對于百子蓮愈傷組織的胚性啟動與胚性保持具有良好的誘導(dǎo)及調(diào)控作用[10]，而濃度偏高或偏低都會導(dǎo)致細(xì)胞胚性喪失或退化(圖1-A)，并通過影響內(nèi)源生長素信號調(diào)控體細(xì)胞胚性發(fā)育與形態(tài)建成(圖1-B)。應(yīng)用二代測序技術(shù)對不同濃度PIC繼代的胚性愈傷組織(embryogenic callus，EC)進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)在胚性穩(wěn)定維持的細(xì)胞中ARF家族基因與IAA20表達(dá)增強(qiáng)；與非胚性細(xì)胞相比，EC中的Aux/IAA家族的IAA20、IAA26、IAA30與IAA4均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，而ARF家族基因明顯上調(diào)表達(dá)。因此推斷生長素信號在百子蓮愈傷組織的胚性誘導(dǎo)與保持過程中具有重要調(diào)控作用，且IAA4、IAA26、IAA20、IAA30、ARF1與ARF2等基因可能在此過程中發(fā)揮重要的信號傳導(dǎo)調(diào)控作用(圖2)。

本文通過百子蓮體胚發(fā)生差異表達(dá)文庫，獲得與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑密切相關(guān)的ARF和Aux/IAA基因的核心序列，應(yīng)用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技術(shù)克隆其中2個Aux/IAA與2個ARF家族基因全長，并分析蛋白結(jié)構(gòu)功能，為揭示其在體胚誘導(dǎo)調(diào)控過程中的分子作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

A，百子蓮愈傷組織胚性保持的細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異；B，百子蓮胚性愈傷組織細(xì)胞內(nèi)源IAA含量差異；不同小寫字母代表生長素含量在不同樣品間的顯著性差異，LSD P<0.05。A， PIC plays an important role in Agapanthus praecox embryogenic induction and keeping; B， IAA contents of callus and embryogenic callus in Agapanthus praecox. The bars with different lowercase letters showed the significant difference (P<0.05).圖1 不同濃度PIC繼代的百子蓮胚性愈傷組織Fig.1 Embryogenic callus of Agapanthus praecox treated with different concentrations of PIC

圖2 百子蓮胚性愈傷組織間生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的基因差異表達(dá)變化Fig.2 Auxin signal transduction pathway related-differentially expressed genes between EC subcultured by different concentrations of PIC in Agapanthus praecox

百子蓮實生苗幼葉取自上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院試驗田，液氮速凍后存于-80 ℃冰箱；Trizol試劑購于Invitrogen公司；SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit購于Clonetech公司；DH5-α感受態(tài)細(xì)胞購自Tiangen公司；SanPrep柱式DNA 膠回收試劑盒購自上海生工有限公司；pHB質(zhì)粒購于Biovector中國質(zhì)粒保存中心；Prime Script Reverse Transcriptase，EXTaqenzyme，LATaqenzyme，Prime Script Reverse Transcriptase，Oligo dT18，RNase inhibitor，DNaseⅠ，pMD18-T vector，SYBR Premix ExTaq等購于TaKaRa公司；引物由上海生工有限公司合成；測序由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1ApARF與ApAux/IAA基因全長克隆

以百子蓮葉片為材料，利用Trizol試劑提取并純化總RNA[11]后采用Prime Script Reverse Transcriptase試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以ApARF與ApAux/IAA基因核心片段序列為參考設(shè)計特異性引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 3 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測回收后連接pMD18-T，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌測序驗證核心序列的準(zhǔn)確性，以其為依據(jù)設(shè)計3′-RACE與5′-RACE的特異性引物(表1)。按照購于TaKaRa公司的OligotexTM-dT30mRNA Purification Kit操作說明，運(yùn)用百子蓮總RNA建立mRNA富集純化體系，按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech)用戶手冊構(gòu)建5′-與3′-RACE cDNA文庫。

按照SMARTerTMRACE用戶手冊分別配置ApARF與ApAux/IAA基因的3′， 5′-RACE第1輪PCR擴(kuò)增體系，以RACE cDNA文庫為模板，采用通用引物(UPM)和特異性引物(3′， 5′-GSP1)擴(kuò)增。程序為94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25個循環(huán)。3′，5′-RACE第2輪巢式PCR擴(kuò)增體系以稀釋后的第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用NUP和3′， 5′-GSP2為引物，擴(kuò)增程序為94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 3 min。

表1ApARF與ApAux/IAA基因擴(kuò)增與RACE引物列表

Table1Sequences of primers for PCR ofApARFandApAux/IAA

引物堿基序列 (5'-3')退火溫度擴(kuò)增目的PrimerSequenceAnnealingtemperature/℃PurposeUPMLongCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGT-GGTATCAACGCAGAGT70.3RACE擴(kuò)增文庫接頭引物Adapter primers for RACE amplification libraryShortCTAATACGACTCACTATAGGGC58.2NUPAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT60.23'-GSP1-ARF1GGTTGAAATGACCGCAAAAGTGAGGC63.6ApARF1 3'-RACE3'-GSP2-ARF1GGTTGGGGAGTCATTTACACCGACGA65.15'-GSP1-ARF1ATCGTCGGTGTAAATGACTCCCCAAC63.6ApARF1 5'-RACE5'-GSP2-ARF1CCTGAGACTTGCTTGGGTTGTTGACA63.63'-GSP1-ARF2ATGGTAATGAATCAGAGACCGCCCCT63.6ApARF2 3'-RACE3'-GSP2-ARF2TAGCGAGTGGGACAAGGGTCAGCATA65.15'-GSP1-ARF2ATGCTGACCCTTGTCCCACTCGCTAC66.7ApARF2 5'-RACE5'-GSP2-ARF2TTTGGTCTAGGAACTGGAAGGGGGTT63.63'-GSP1-Aux/IAA2GGTCAAGGTCAACCACGCAGGAAAAT63.6ApAux/IAA2 3'-RACE3'-GSP2-Aux/IAA2GAGGACAAAGATGGGGATTGGATGCT63.65'-GSP1-Aux/IAA2AGCATCCAATCCCCATCTTTGTCCTC63.6ApAux/IAA2 5'-RACE5'-GSP2-Aux/IAA2GGTTGACCTTGACCGTCCTTGCTTTA63.63'-GSP1-Aux/IAA3AAGATGGAGGGTGTGGCAATAGGGAG65.1ApAux/IAA3 3'-RACE3'-GSP2-Aux/IAA3TTACGAGGATGAAGAAGGGGACTGGA63.65'-GSP1-Aux/IAA3TCCAGTCCCCTTCTTCATCCTCGTAA63.6ApAux/IAA3 5'-RACE5'-GSP2-Aux/IAA3CTCCCTATTGCCACACCCTCCATCTT65.1ARF1 senseATGCGTAATAACTGGTGTTG53.7ARF1 antisenseCATGTTCCCTTCATCGTC55.0ARF2 senseAGGCAAATGTTCCGTCTT52.7ARF2 antisenseTCCCTGCTTATGTACCTTAGTG58.2Aux/IAA2 senseAAGGCACAAGTTGTCGGA55.0核心片段克隆Aux/IAA2 antisenseTCCCCATCTTTGTCCTCA55.0Core fragment cloningAux/IAA3 senseGAGTTCGACCTCAACAACG57.6Aux/IAA3 antisenseCAACAAGCATCCAGTCCC57.3

瓊脂糖凝膠電泳檢測回收產(chǎn)物，連接pMD18-T vector載體進(jìn)行測序，獲得4個目的基因的3′-和5′-端序列。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

采用DNAMAN軟件拼接5′-RACE、3′-RACE與核心序列，獲得目的基因cDNA全長序列；NCBI ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)分析序列的CDS-ORF區(qū)，DNAMAN軟件對ORF區(qū)編碼的氨基酸序列進(jìn)行翻譯。NCBI網(wǎng)站BlastP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對氨基酸序列，采用ClustalX軟件分析序列一致性和同源性。TAIR網(wǎng)站(http://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥(Arabidopsisthaliana)中已知的23個ARF家族和29個AUX/IAA家族蛋白序列，運(yùn)用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(neighbor-joining tree，Bootstrap=1 000)。應(yīng)用SOPMA軟件對氨基酸二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。通過NCBI 的Conserved Domain Database數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，EMBI-EBI的Pfam 數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)和PROSITE(http://prosite.expasy.org/)在線軟件對蛋白保守域進(jìn)行分析[12-13]。利用ProtParam在線工具(http://expasy.org/tools/protparam.html)分析氨基酸的構(gòu)成，MEME在線工具(http://meme-suite.org/tools/meme)對Aux/IAA蛋白的基序進(jìn)行預(yù)測，輸入百子蓮與BLAST獲得的其他物種中的共12個Aux/IAA蛋白的序列，設(shè)定基序最大發(fā)現(xiàn)數(shù)目為4[14-15]。

1.2.3 基因過表達(dá)載體構(gòu)建并轉(zhuǎn)化擬南芥

采用pHB質(zhì)粒并選定PstⅠ和BamHⅠ為限制性酶切位點(diǎn)。拼接測序結(jié)果獲得基因全長序列后設(shè)計擴(kuò)增引物(表2)，以百子蓮cDNA文庫為模板，在基因ORF片段的上下游分別引入BamHⅠ和PstⅠ酶切位點(diǎn)。反應(yīng)程序為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 3 min。隨后采用酶切連接法構(gòu)建載體，測序驗證載體構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)，挑取農(nóng)桿菌陽性單克隆經(jīng)PCR檢測后，以花序浸染法侵染擬南芥。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥篩選鑒定及觀察

收獲的T1代種子播種后采用0.05%(V/V)草甘膦進(jìn)行抗性篩選從而確定轉(zhuǎn)化成功后，選擇5～6個株系進(jìn)行培育并收獲T2代種子。將T2代擬南芥種子與野生型(Columbia)種子經(jīng)4 ℃春化后播種于穴盤中。在22 ℃，16 h/8 h(光照/黑暗)的人工氣候箱中培養(yǎng)，2周后對植株生長情況進(jìn)行表型觀察。取表型差異明顯且穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系葉片組織提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(方法同前)，隨后采用qRT-PCR測定4個基因型T2代中目的基因的表達(dá)量。使用Beacon Design 7軟件設(shè)計qRT-PCR引物(表2)。反應(yīng)程序為94 ℃ 10 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。每個樣品進(jìn)行3個重復(fù)，反應(yīng)完成后采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用UBQ5作為內(nèi)參基因(表2)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ApARF與ApAux/IAA家族基因的全長序列獲得

獲得ApAux/IAA2、ApAux/IAA3、ApARF1、ApARF2的基因核心片段序列分別為330、474、921、1 617 bp；3′-端克隆序列長度分別為501、320、453、785 bp。5′-端第2輪巢式PCR擴(kuò)增后，ApARF2基因出現(xiàn)了3個較明顯的條帶(圖3-D)，對各個條帶都進(jìn)行回收和測序比對分析后，確定長度在1 000 bp以上的ApARF2擴(kuò)增條帶為正確結(jié)果。最終獲得ApAux/IAA2，ApAux/IAA3，ApARF1，ApARF2的5′-端克隆序列長度分別為375、399、1 576、1 356 bp。

將5′-RACE與3′-RACE的測序結(jié)果與核心序列進(jìn)行拼接后，獲得ApARF1、ApARF2、ApAux/IAA2、ApAux/IAA3基因的cDNA全長序列分別為2 343、2 888、1 034、821 bp；起始密碼子和終止密碼子分別位于256 nt/2 023 nt、200 nt/2 546 nt、105 nt/583 nt、77 nt/623 nt；各基因的5′非編碼區(qū)和3′非編碼區(qū)長度分別為255 bp/318 bp、199 bp/340 bp、104 bp/450 bp、76 bp/196 bp；CDS-ORF全長分別為1 770、2 349、480和549 bp；分別編碼589、782、159和182個氨基酸殘基，分子量分別為65.99、87.78、18.06、20.72 ku，pI分別為6.36、6.36、6.54和6.92(圖4)。

2.2 蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

蛋白二級結(jié)構(gòu)分析表明(圖5)，ApARF1蛋白由31.24%的α-螺旋(alpha helix)，39.56%的隨機(jī)卷曲(random coil)，22.24%的延伸鏈(extended strand)和6.96%的β-轉(zhuǎn)角(beta turn)組成，其中α-螺旋與隨機(jī)卷曲占比最大；ApARF2蛋白由53.84%的隨機(jī)卷曲，20.84%的延伸鏈，19.44%的α-螺旋和5.88%的β-轉(zhuǎn)角組成，其中隨機(jī)卷曲占比最大。ApAux/IAA2蛋白由33.33%的延伸鏈，28.93%的α-螺旋，25.16%的隨機(jī)卷曲和12.58%的β-轉(zhuǎn)角組成，其中α-螺旋和延伸鏈占比最大；ApAux/IAA3蛋白由39.56%的隨機(jī)卷曲，25.82%的α-螺旋，22.53%的延伸鏈和12.09%的β-轉(zhuǎn)角組成，其中隨機(jī)卷曲和α-螺旋占比最大。四個蛋白中的α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和隨機(jī)卷曲分布規(guī)律性不明顯。

表2ARF與Aux/IAA過表達(dá)載體構(gòu)建與qRT-PCR檢測引物列表

Table2Sequences of primers for construction of over-expression vector and qRT-PCR ofApARFandApAux/IAA

引物名稱堿基序列(5'-3')引物名稱堿基序列(5'-3')PrimersSequencePrimersSequenceApARF1-RsATGGATCCATGGTGTTAGATGGTAAApARF1-RaTTACTGCAGTCAAGGTTGCAACTTCTApARF2-RsATGGATCC ATGGCGTCTCCTGAGGTApARF2-RaTTACTGCAGTCATGACTGGCTGTTGTApAux/IAA2-RsATGGATCCATGAGAGATCCAATGGAAGApAux/IAA2-RaTTACTGCAGTTACCCCCATGGAACATCApAux/IAA3-RsATGGATCCATGGAGCTAGAGTTAGGCCTApAux/IAA3-RaTTACTGCAGCTATGCAG-GTCTCTCTCGTTqT-F-ARF1TTCAGAGTCCATAGTTCCTTATqT-R-ARF1AACCTTGAGATGCTTCCAqT-F-ARF2ACTCAGATGGATTACTCACAAqT-R-ARF2GGCTCATAGGTAGGATTCAAqT-F-AUX2GACGATTGTGGTGTTGATqT-R-AUX2CCATTGGAGCAAGTTCTTqT-F-AUX3CAATAACCATATCGCCTATCCqT-R-AUX3ATCGTCCTCCTTGTCATCUBQ5-FGACGCTTCATCTCGTCCUBQ5-RCCACAGGTTGCGTTAG

A，3′-RACE第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物；B，3′-RACE第二輪巢式擴(kuò)增產(chǎn)物；C，5′-RACE第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物；D，5′-RACE第二輪巢式擴(kuò)增產(chǎn)物。M，DL2000 DNA marker。A， The first amplification of 3′-RACE; B， The second amplification of 3′-RACE; C， The first amplification of 5′-RACE; D， The second amplification of 5′-RACE. M， DL2000 DNA marker.圖3 3′，5′-RACE擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測圖譜Fig.3 Agarose gel electrophoresis of RACE products

圖5 百子蓮ApARF與ApAux/IAA蛋白二級結(jié)構(gòu)特征Fig.5 Secondary structure prediction of ARF and Aux/IAA proteins in Agapanthus praecox

2.3 蛋白結(jié)構(gòu)域分析

蛋白保守域分析結(jié)果表明，百子蓮ApARF1具有B3-DNA結(jié)合域(pfam02362)與Auxin_resp結(jié)構(gòu)域(pfam06507，也稱ARF結(jié)構(gòu)域)，位于氨基酸序列的113～212位與239～321位；ApARF2具有結(jié)構(gòu)域B3-DNA，Auxin_resp與AUX_IAA(pfam02309)分別位于序列的141～242位，267～349位與665～737位。ApAux/IAA2與ApAux/IAA3均具有AUX_IAA 結(jié)構(gòu)域(pfam02309)，位于氨基酸序列的21～159位和69～171位。

同時，ApAux/IAA與ApARF氨基酸序列都在C-端含有60～90 aa的PB1保守域(Phox and Bem1，PS51745)，且與ApAux/IAA2、ApAux/IAA3中的Aux/IAA結(jié)構(gòu)域部分重合，與ApARF2中的Aux/IAA結(jié)構(gòu)域基本完全重合(圖6)。

氨基酸數(shù)目統(tǒng)計結(jié)果表明，ApARF1與ApARF2中間區(qū)域均富含絲氨酸和脯氨酸(ApARF1: Pro7.9%，Ser 13.1%；ApARF2: Pro 10.6%，Ser 12.8%)。

圖6 百子蓮ARF 與AUX/IAA家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.6 Conserved protein domain of ARF and Aux/IAA protein in Agapanthus praecox

基序分析獲得4個基序，長度分別為21，41，50，29個氨基酸，對應(yīng)Aux/IAA蛋白中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ結(jié)構(gòu)域(圖7)。分析結(jié)果表明，百子蓮Aux/IAA 2蛋白具有4個結(jié)構(gòu)域，其中Ⅳ結(jié)構(gòu)不完整；百子蓮Aux/IAA 3蛋白具有Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ結(jié)構(gòu)域，而結(jié)構(gòu)域Ⅱ保守性低(圖8)。

2.4 氨基酸序列同源性分析

BlastP分析表明，ApARF1與ApARF2基因編碼的氨基酸序列與多種其他植物中的ARF蛋白具有較高的同源性，為50%以上(圖8)。其中，與ApARF1氨基酸序列同源性最高的是油棕(ElaeisguineensisARF 24-like)，同源性為65%；與海棗(PhoenixdactyliferaARF 24-like isoform X2)的同源性為64%。與ApARF2氨基酸序列同源性最高的是油棕(ElaeisguineensisARF 4-like)，同源性為65%；其次是荷花(NelumbonuciferasARF 2-like)，同源性為62%。

ApAux/IAA2與ApAux/IAA3編碼的氨基酸序列同樣與其他植物中的Aux/IAA家族蛋白具有較高的同源性，為50%以上(圖9)。與百子蓮ApAux/IAA2氨基酸序列同源性最高的是海棗(PhoenixdactyliferaAUX 22D-like 8132)，同源性為61%，其次是油棕(ElaeisguineensisAUX 22D-like 3480)，同源性為60%。與ApAux/IAA3氨基酸序列同源性最高的是鳳梨(AnanascomosusAux IAA20)，同源性為60%，其次是小果野蕉(Musaacuminatasubsp.MalaccensisAux IAA9-like X1)，同源性為55%。

方框圈定的區(qū)域為圖9中標(biāo)注的保守結(jié)構(gòu)域的序列。Positions of conserved domains displayed in Fig.9 were boxed.圖7 Aux/IAA家族蛋白4個基序Fig.7 Four motifs distribution of 12 Aux/IAA proteins

Asparagus officinalis ARF 2-LIKE isoform X2(XP_020274070.1)，Asparagus officinalis ARF 2-LIKE isoform X1(XP_020274069.1)，Asparagus officinalis ARF 23-LIKE isoform X3(XP_020274071.1)，Phoenix dactylifera ARF 24-like isoform X2(XP_008813740.1)，Elaeis guineensis ARF 24-like isoform X2(XP_010914409.1)；Nelumbo nucifera ARF 2-like(XP_010249209.1)，Elaeis guineensis ARF4-like(XP_010926858.1)，Asparagus officinalis ARF 2-like X1(XP_020261175.1)，Asparagus officinalis ARF 2-like X2 (XP_020261177.1)，Asparagus officinalis ARF 2-like(XP_020248955.1).圖8 ApARF1與ApARF2氨基酸序列同源性比對Fig.8 Multiple sequence alignment of ARF in Agapanthus praecox and other plants

Phoenix dactylifera AUX 22D-like 8132(XP_008788132.1)，Elaeis guineensis AUX 22D-like 3480(XP_010923480.1)，Elaeis guineensis AUX 22D 6161(XP_010936161.1)，Asparagus officinalis AUX 22D-like 4650(XP_020274650.1)，Asparagus officinalis A4U43 4425(ONK64425.1)，Elaeis guineensis Aux IAA20 X2(XP_010904976.1)，Phoenix dactylifera Aux IAA9-like X5 (XP_008809248.1)，Musa acuminata subsp. malaccensis Aux IAA9 X1(XP_009419087.1)，Asparagus officinalis AuxIAA20-like(XP_020244002.1)，Ananas comosus Aux IAA20 (OAY64285.1).圖9 ApAux/IAA2與ApAux/IAA3氨基酸序列同源性比對Fig.9 Multiple sequence alignment of Aux/IAA in Agapanthus praecox and other plants

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

植物ARF與Aux/IAA家族蛋白成員眾多，已經(jīng)在多種草本和木本植物中被分析研究[4]，其表達(dá)特征也比較復(fù)雜[7,16]。因此采用擬南芥(Arabidopsisthaliana)中研究較為深入的23個ARF和29個Aux/IAA家族蛋白[17]分別與ApARF1、ApARF2及ApAux/IAA2、ApAux/IAA3蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析蛋白在生長素調(diào)控途徑中的作用和潛在的相互作用機(jī)制。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果(圖10)表明，ARF家族蛋白在系統(tǒng)進(jìn)化樹中聚合成4類，其中ApARF1與AtARF1(AT1G59750)聚合，ApARF2與AtARF2(AT5G62000)聚合，4個蛋白均在同一聚類中。ApAux/IAA2與AtIAA1(AT4G14560)、AtIAA2(AT3G23030)、AtIAA3(AT1G04240)、AtIAA4(AT5G43700.1)聚合成一簇，與AtIAA4的親緣關(guān)系最近；ApAux/IAA3與AtIAA29(AT4G32280)、AtIAA20(AT2G46990)、AtIAA30(AT3G62100)、AtIAA31(AT3G17600)聚合為一簇。

2.6 轉(zhuǎn)基因植株功能驗證

基因熒光定量實驗表明，在ApARF1、ApARF2、ApAux/IAA2和ApAux/IAA3過表達(dá)擬南芥中，目的基因的表達(dá)量分別是內(nèi)參基因UBQ5的2.6、3.6、3.4和3.2倍，而在野生型植株中均未見表達(dá)(圖11)。

表型比對結(jié)果表明，ApARF1與ApARF2轉(zhuǎn)基因植株的生長速度均明顯快于野生型(圖11-C、D)，可見ApARF1與ApAPF2正向調(diào)控植株的開花成熟及生長過程。ApAux/IAA2和ApAux/IAA3轉(zhuǎn)基因擬南芥植株矮小，生長速度則明顯慢于野生型，發(fā)育受到阻遏，說明ApAux/IAA2和ApAux/IAA3基因?qū)τ谥参锏纳L存在負(fù)調(diào)控作用(圖11-G、H)。

3 討論

目前已在植物中發(fā)現(xiàn)眾多ARF與Aux/IAA家族蛋白成員。Aux/IAA在大豆(Glycinemax)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)[16]、馬尾松(Pinusmassoniana)[18]；ARF在水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、番茄(Solanumlycopersicum)、大豆(Glycinemax)、油菜(Brassicanapus)、葡萄(Vitisvinifera)[4]等植物中被發(fā)現(xiàn)和分析。

左為Aux/IAA家族，右為ARF家族。Bootstrap=1 000。Neighbor-joining bootstrap phylogenetic trees of ARFs (left) and Aux/IAAs (right) from Arabidopsis thaliana and Agapanthus praecox. The bootstrap was 1 000.圖10 ApAux/IAA與ApARF家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.10 Phylogenetic analysis of Aux/IAA and ARF proteins

A，ApARF1基因相對表達(dá)量；B，ApARF1轉(zhuǎn)基因擬南芥表型；C，ApARF2基因相對表達(dá)量；D，ApARF2轉(zhuǎn)基因擬南芥表型；E，ApAux/IAA2基因相對表達(dá)量；F，ApAux/IAA2轉(zhuǎn)基因擬南芥表型；G，ApAux/IAA3基因相對表達(dá)量；H，ApAux/IAA3轉(zhuǎn)基因擬南芥表型；虛線表示內(nèi)參基因UBQ5表達(dá)量。A， Relative gene expression of ApARF1; B， Phenotype of ApARF1 over-expression Arabidopsis thaliana; C， Relative gene expression of ApARF2; D， Phenotype of ApARF2 over-expression Arabidopsis thaliana; E， Relative gene expression of ApAux/IAA2; F， Phenotype of ApAux/IAA2 over-expression Arabidopsis thaliana; G， Relative gene expression of ApAux/IAA3; H， Phenotype of ApAux/IAA3 over-expression Arabidopsis thaliana. The dotted line indicated the expression of reference gene UBQ5.圖11 ApARF和ApAux/IAA轉(zhuǎn)基因擬南芥植株qRT-PCR檢測結(jié)果與生長表型Fig.11 qRT-PCR detection and phenotype observation of ApARF and ApAux/IAA genes in wild type and transgenic over-expression Arabidopsis thaliana

本研究通過RACE技術(shù)獲得百子蓮中2個Aux/IAA基因和2個ARF基因的全長，并對各個基因所編碼的蛋白進(jìn)行分析。在蛋白結(jié)構(gòu)域組成上，ApARF2符合典型的ARF家族蛋白構(gòu)造，具有N-端的B3-like DNA結(jié)合域，C-端Aux_IAA結(jié)構(gòu)域和中間區(qū)域[4，7]；ApARF1缺失C-端負(fù)責(zé)形成ARF、Aux/IAA間同源/異源二聚體的AUX_IAA結(jié)構(gòu)域，但具有PB1保守域(圖6)。PB1結(jié)構(gòu)域能夠介導(dǎo)蛋白間異源或同源聚化[19]，如擬南芥AtARF17蛋白，雖缺失C端的保守域，但仍能夠與Aux/IAA蛋白互作[9,13]，序列分析表明其具有PB1結(jié)構(gòu)域，可見其起到了代替C端的AUX_IAA結(jié)構(gòu)域的作用。系統(tǒng)進(jìn)化樹的聚合結(jié)果(圖10)表明，ApARF1、ApARF2與轉(zhuǎn)錄抑制因子AtARF1、AtARF2聚合。百子蓮ApARF1、ApARF2的中間結(jié)構(gòu)域都富含絲氨酸與脯氨酸，也表明其應(yīng)具有轉(zhuǎn)錄抑制功能，在植物中功能類似AtARF1與AtARF2，通過抑制植物細(xì)胞分裂相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄來正向調(diào)節(jié)葉片的衰老、花脫落、角果成熟等相關(guān)生理過程[8,12,20]。轉(zhuǎn)基因表型實驗也初步驗證了二者與植株生長成熟過程相關(guān)的推測。

百子蓮ApAux/IAA2蛋白具有完整的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ結(jié)構(gòu)域，雖蛋白互作相關(guān)結(jié)構(gòu)Ⅳ結(jié)構(gòu)域不完整，但因具有PB1保守域，應(yīng)仍具有形成蛋白二聚體的功能。系統(tǒng)進(jìn)化樹中(圖10)，ApAux/IAA2與具有完整結(jié)構(gòu)的AtAux/IAA1和AtAux/IAA3蛋白功能相近，應(yīng)能與ARF家族蛋白互作并響應(yīng)生長素信號，負(fù)調(diào)節(jié)生長素響應(yīng)因子，抑制植株的地上部分或根系的生長[21-22]。ApAux/IAA2基因過表達(dá)植株出現(xiàn)的生長延緩表型特征初步驗證了這一推測。百子蓮ApAux/IAA3蛋白具有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域Ⅱ不完整(圖8)。系統(tǒng)進(jìn)化樹中與其聚合的蛋白中，AtIAA31、AtIAA20、AtIAA30、AtIAA29也缺失結(jié)構(gòu)域Ⅱ[15-16]。結(jié)構(gòu)域Ⅱ的缺失會使IAA蛋白更加穩(wěn)定且難以被降解，進(jìn)而抑制ARF轉(zhuǎn)錄活性從而影響相關(guān)生長素介導(dǎo)的發(fā)育過程[23]，如AtIAA31蛋白，穩(wěn)定性高于典型Aux/IAA蛋白，基因過表達(dá)可能造成植株矮化等生長素缺陷表型[24]，與ApAux/IAA3基因過表達(dá)植株的表型相一致。此外，AtIAA30蛋白具有促進(jìn)體細(xì)胞胚胎的發(fā)生的功能[24]，ApAux/IAA3也可能具有類似的調(diào)控作用。

本研究對百子蓮Aux/IAA家族和ARF家族蛋白在體胚誘導(dǎo)和生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用進(jìn)行分析，并通過基因克隆、蛋白結(jié)構(gòu)和功能驗證，為進(jìn)一步探究植物細(xì)胞胚性誘導(dǎo)和構(gòu)建體胚體系提供理論指導(dǎo)。目前對于ARF與Aux/IAA家族蛋白在植物體內(nèi)的功能研究表明，ARF與Aux/IAA之間的同源或異源二聚體化與它們在生長素信號調(diào)控過程中發(fā)揮的生理功能緊密相關(guān)[9]。為進(jìn)一步驗證百子蓮ARF與Aux/IAA蛋白之間的互作和相互調(diào)節(jié)，在后續(xù)實驗中可通過酵母雙雜實驗檢驗百子蓮ApARF與ApAux/IAA蛋白之間是否存在直接對應(yīng)的相互作用，并通過酵母單雜交方式研究ARF蛋白是否對通過結(jié)合Aux/IAA上游的元件激活并調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而進(jìn)一步揭示ARF與Aux/IAA在觀賞植物生長素信號傳導(dǎo)過程中的調(diào)控作用。