改良微柱凝膠法檢測(cè)ABO變異型血型

朱碎永，金方思，施順秋，裘曉樂，鄭婷婷

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 輸血科，浙江 溫州 325027）

ABO血型系統(tǒng)是臨床上最重要的血型系統(tǒng)，它在輸血、生物學(xué)、遺傳學(xué)、法醫(yī)學(xué)和人類學(xué)等方面被廣泛應(yīng)用[1-2]。常見ABO血型有A、B、O、AB 4種表型，人群中也發(fā)現(xiàn)一定數(shù)量的ABO變異型，這些ABO變異型血型表現(xiàn)為凝集強(qiáng)度改變或正反定型不一致，用鹽水試管法和微柱凝膠血型卡檢測(cè)易出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象[3-6]。為提高微柱凝膠法的檢測(cè)敏感度，避免出現(xiàn)漏檢，本研究通過改變微柱凝膠法離心方式，增加孵育時(shí)間，調(diào)整孵育溫度，建立改良微柱凝膠法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2016年11月至2018年5月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院、溫州市人民醫(yī)院和瑞安市人民醫(yī)院ABO血型凝集強(qiáng)度改變或正反定型不一致的患者12例，男7例，女5例，年齡21～69歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，血液采集均征得本人及家屬的知情同意。

1.2 試劑和儀器 ABO血型定型血清（北京金豪生物試劑有限公司、上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；抗A抗H（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；A、B、O試劑紅細(xì)胞（江蘇力博生物技術(shù)有限公司）；1%O型混合紅細(xì)胞20例（本課題組自制，每例取3份同1名獻(xiàn)血員紅細(xì)胞混合后洗滌4次）；基因組DNA提取試劑盒、基因分型檢測(cè)試劑盒和人類紅細(xì)胞類孟買血型基因分型檢測(cè)試劑盒（天津秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；微柱凝膠血型卡（ABO、RhD血型抗原檢測(cè)卡，江蘇力博生物技術(shù)有限公司）；醫(yī)用低速離心機(jī)（江蘇力博生物技術(shù)有限公司）；PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司）；3730基因測(cè)序儀（美國(guó)ABI公司）；醫(yī)用冷藏箱（青島海爾特種電器有限公司）。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 方法

1.3.1 ABO血型檢測(cè)：ABO正反定型采用單克隆抗A、抗B血型定型試劑、ABO標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞進(jìn)行鹽水試管凝集法檢測(cè)；H抗原用抗H血清鹽水試管凝集法檢測(cè)。

1.3.2 ABO血型復(fù)核：將待測(cè)標(biāo)本用0.9%氯化鈉溶液配制成1%紅細(xì)胞懸液，加入微柱凝膠血型卡腔中，置離心機(jī)，按說明書要求離心，觀察結(jié)果。

1.3.3 吸收放散試驗(yàn)：取待測(cè)標(biāo)本壓積紅細(xì)胞1 mL，用0.9%氯化鈉溶液洗滌3次后加入等量抗A或抗B血清，4 ℃吸收1 h，0.9%氯化鈉溶液洗滌3次（末次洗滌液檢測(cè)不到抗體），加入1/2體積0.9%氯化鈉溶液，置56 ℃放散10 min，離心取放散液，加A或B型試劑紅細(xì)胞離心檢測(cè)[7]。

1.3.4 分子生物學(xué)鑒定：用DNA試劑盒對(duì)標(biāo)本進(jìn)行基因DNA提取，用序列特異性引物-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（sequence specific primers polymerase chain reaction，PCR-SSP）法進(jìn)行基因分型，嚴(yán)格按照其儀器試劑說明書進(jìn)行。

1.3.5 改良微柱凝膠法建立：①離心方式的調(diào)整。取1% O型紅細(xì)胞懸液50 μL加入微柱凝膠血型卡中，900 r/min分別離心0.5、1、1.5、2、2.5、3 min，使紅細(xì)胞進(jìn)入抗血清中而不進(jìn)入凝膠中為最適離心時(shí)間1，分別置4 ℃冰箱15、30、45、60 min，1500 r/min分別離心2、2.5、3、3.5、4 min，紅細(xì)胞全部進(jìn)入凝膠底部的最短時(shí)間為最適離心時(shí)間2。②孵育溫度的選擇。選IgM抗體和ABO血型抗原反應(yīng)最適溫度4 ℃為孵育溫度。③孵育時(shí)間的確定。取1%已知ABO變異型血型標(biāo)本紅細(xì)胞50 μL加入微柱凝膠血型檢測(cè)卡中，900 r/min最適離心時(shí)間1離心，分別置4 ℃冰箱15、30、45、60 min，1 500 r/min最適離心時(shí)間2離心，以最短時(shí)間凝集最強(qiáng)者為最適孵育時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 患者ABO血型血清學(xué)和基因檢測(cè) 對(duì)12例凝集強(qiáng)度改變或正反定型不一致的標(biāo)本，采用血型血清學(xué)檢查及部分標(biāo)本血型基因檢測(cè)結(jié)合臨床表現(xiàn)確認(rèn)其ABO血型，結(jié)果顯示，12例標(biāo)本中A3亞型1例，B（A）型3例，A類孟買型（Amh）1例，B類孟買型（Bmh）2例，A抗原減弱3例，B抗原減弱2例。見表1。

2.2 微柱凝膠法復(fù)核 全部標(biāo)本用微柱凝膠血型卡檢測(cè)，同鹽水試管法比較，2種方法檢測(cè)敏感度相似，在12例標(biāo)本中只檢出1例A3亞型和1例B（A）型紅細(xì)胞上的A抗原，檢出比例為2/12。見表1-2。

2.3 改良微柱凝膠法的建立

2.3.1 確定離心方式：對(duì)20例O型標(biāo)本測(cè)試確定孵育前離心時(shí)間為900 r/min離心2 min，4 ℃孵育后1 500 r/min離心3 min。

2.3.2 確定孵育時(shí)間：對(duì)1例A3亞型和1例A抗原減弱標(biāo)本紅細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，4 ℃孵育15、30、45、60 min檢測(cè)敏感度分別為±、1+、1+、1+，重復(fù)測(cè)試10次，結(jié)果一致?？梢?，4 ℃孵育30 min是理想的最短有效時(shí)間。

2.3.3 改良微柱凝膠法的確立：取50 μL 0.8%～1%待檢紅細(xì)胞加入微柱凝膠血型卡中，900 r/min離心2 min，置4 ℃冰箱孵育30 min，1 500 r/min離心3 min。

2.4 改良微柱凝膠法檢測(cè) 全部標(biāo)本用改良微柱凝膠法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，改良微柱凝膠提高了檢測(cè)敏感度，12例標(biāo)本中僅1例B抗原減弱檢測(cè)不出來，檢出比例為11/12。見表2。

表1 12例患者ABO血型血清學(xué)和血型基因檢測(cè)結(jié)果

表2 12例患者血清標(biāo)本微柱凝膠法和改良微柱凝膠法檢測(cè)結(jié)果

3 討論

AB亞型、B（A）型、類孟買型、ABO抗原減弱型等ABO變異型均以抗原性弱為主要特征的ABO血型表型。在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)鹽水試管檢測(cè)中，ABO變異型紅細(xì)胞上ABH抗原凝集非常弱或檢測(cè)不到[8-9]。本研究12例標(biāo)本中1例標(biāo)本抗A血清檢測(cè)為混合凝集反應(yīng)，難以判定血型；8例標(biāo)本用抗A、抗B血清不能檢測(cè)出A或B抗原，血清中不能檢測(cè)出相應(yīng)的抗體，正反定型不一致；1例標(biāo)本抗A混合凝集反應(yīng)，抗B強(qiáng)凝集，反定型檢出弱抗A，正反定型不一致，難以判定血型；2例標(biāo)本抗A血型檢測(cè)不凝集，抗B強(qiáng)凝集，反定型檢出弱抗A，最容易檢測(cè)為B型。為確定ABO血型，本研究對(duì)12例標(biāo)本做吸收放散試驗(yàn)和H抗原檢測(cè)，以確定標(biāo)本紅細(xì)胞上A、B和H抗原的存在，部分標(biāo)本進(jìn)一步檢查血型基因確定其ABO血型。然而對(duì)臨床急危重患者緊急用血時(shí)，吸收放散試驗(yàn)操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，需經(jīng)驗(yàn)豐富的操作人員操作；基因檢測(cè)操作更是復(fù)雜、耗時(shí)，這嚴(yán)重影響臨床及時(shí)輸血治療和輸血安全。經(jīng)吸收放散試驗(yàn)和H抗原檢測(cè)結(jié)合部分基因檢測(cè)，本研究中12例標(biāo)本血型分別為A3亞型1例，B（A）型3例，A類孟買型1例，B類買孟型2例，A抗原減弱3例，B抗原減弱2例?？梢?，常規(guī)鹽水試管法難以勝任ABO變異型血型的篩查。微柱凝膠法能很好地把血型血清學(xué)技術(shù)與凝膠分子篩技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來，具有操作簡(jiǎn)便、易于自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化、結(jié)果可靠、特異性強(qiáng)、易于保存和核對(duì)等優(yōu)點(diǎn)，早在20世紀(jì)初歐美發(fā)達(dá)國(guó)家已將其作為常規(guī)紅細(xì)胞血型血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于臨床[10-11]，國(guó)內(nèi)一些醫(yī)院和血站在2000年左右開始用微柱凝膠法檢測(cè)ABO、RhD血型[12-14]。目前，微柱凝膠法檢測(cè)ABO、RhD血型已在市縣級(jí)甚至于鎮(zhèn)級(jí)醫(yī)院開展。然而該法在常溫下進(jìn)行，微柱凝膠柱內(nèi)抗血清量有限（15 μL左右），且抗血清分布高度只有2～3 mm，故離心時(shí)紅細(xì)胞與柱內(nèi)抗血清實(shí)際接觸時(shí)間極短，鑒定時(shí)，如紅細(xì)胞上相應(yīng)抗原位點(diǎn)減少，紅細(xì)胞和紅細(xì)胞之間來不及搭橋就直接被離心到柱底，因此敏感度不是非常高，抗原減弱型和亞型可出現(xiàn)漏檢[15-17]。本研究中12例ABO變異型血型用上述2種方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，微柱凝膠法和常規(guī)鹽水試管法檢測(cè)敏感度相似，檢出比例為2/12，與文獻(xiàn)報(bào)道[18-19]相同，顯然微柱凝膠法也不適合于ABO變異型血型的篩查。

為提高ABO變異型血型的篩出率和盡量減少操作難度和時(shí)間，必須運(yùn)用操作簡(jiǎn)便而敏感度高的檢測(cè)方法。林海芬等[20]用加入抗血清的方法來提高檢測(cè)ABO血型的敏感度，此法雖能檢出ABO抗原減弱血型，但只能應(yīng)用于已知個(gè)別標(biāo)本的檢測(cè)，不能用于批量標(biāo)本的鑒定。為此，本研究通過改變微柱凝膠法離心方式，增加孵育時(shí)間，調(diào)整孵育溫度，建立改良微柱凝膠法，使抗原和抗體在最適溫度下有較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間，以提高檢測(cè)敏感度。本研究中12例ABO變異型標(biāo)本用改良微柱凝膠法檢測(cè)，結(jié)果顯示，1例A3亞型、3例B（A）型、3例A類孟買型、3例A抗原減弱型和1例B抗原減弱型均檢出A或B抗原，僅1例B抗原減弱型檢測(cè)不出B抗原，檢出比例高達(dá)11/12，明顯高于微柱凝膠法和常規(guī)鹽水試管法2/12的檢出比例。可見，改良微柱凝膠法通過延長(zhǎng)孵育時(shí)間、調(diào)整孵育溫度，使抗原和抗體在最適反應(yīng)溫度下有較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間，提高了對(duì)ABO變異型血型的檢測(cè)敏感度。

綜上所述，改良微柱凝膠法不改變微柱凝膠血型卡組成成分和批量標(biāo)本的檢測(cè)，僅通過改變微柱凝膠血型卡的離心方式，增加孵育時(shí)間，調(diào)整孵育溫度，提高了檢測(cè)敏感度，適合ABO變異型血型的篩檢。