水通道蛋白-1基因敲除小鼠的表型變化及其生理病理意義

藍(lán)葉慧，黃文樂，應(yīng)辛欣，錢益宇，華瑩

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 產(chǎn)科，浙江 溫州 325027）

水通道蛋白家族（aquaporins，AQPs）是一種結(jié)構(gòu)微小、完整的膜蛋白家族，可以協(xié)助水分子、小分子物質(zhì)和各種中性溶質(zhì)跨越生物膜。至今已發(fā)現(xiàn)AQPs有13種亞型（0～12），AQP1是AQPs鑒定的第一個成員，為一種選擇性轉(zhuǎn)運物質(zhì)的膜蛋白。通過分析敲除AQP1的轉(zhuǎn)基因小鼠的表型，可以推測AQP1在各器官中的作用[1]。AQP1的缺失與多種器官的異常有關(guān)，包括羊水過多、多尿、心血管穩(wěn)態(tài)失衡、血管生成和細(xì)胞遷移障礙、疼痛感知障礙以及神經(jīng)炎癥等。此外，AQP1的缺失在腦損傷的保護(hù)和腫瘤生長的抑制過程中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)就近年關(guān)于敲除AQP1基因的細(xì)胞、組織和動物模型的表型的研究進(jìn)行綜述。

1 AQP1基因敲除在妊娠中的作用

以AQP1敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠為動物模型，研究發(fā)現(xiàn)AQP1在胎盤生長、胎兒發(fā)育和母胎體液穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[2-4]。ZHENG等[2]發(fā)現(xiàn)與野生型孕鼠比較，AQP1基因敲除的孕鼠的胚胎數(shù)量減少，胎重降低，但羊水量顯著增加。此外，AQP1基因敲除的孕鼠胎盤血管結(jié)構(gòu)異常，合體滋養(yǎng)層細(xì)胞結(jié)節(jié)增多，這說明AQP1基因敲除孕鼠的胎盤發(fā)生了嚴(yán)重變性[2]。有研究發(fā)現(xiàn)AQP1基因敲除孕鼠羊水量增加，但胎鼠的數(shù)目和胎重與野生型孕鼠比較沒有顯著差異。與此相反，GUO等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在胎齡12.5～18.5 d的孕鼠中，與AQP1+/+孕鼠比較，AQP1+/-孕鼠（母本等位基因缺失）和AQP1-/-孕鼠存在胎盤和胚胎過度生長的現(xiàn)象，而AQP1+/-孕鼠（父本等位基因缺失）卻不存在此現(xiàn)象，AQP1母體缺失導(dǎo)致胎盤質(zhì)量和迷路層面積增加。此外，他們對AQP1進(jìn)行了印跡分析，發(fā)現(xiàn)AQP1的啟動子與外顯子1的甲基化狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)。以上研究結(jié)果表明AQP1可以通過影響胎盤發(fā)育而間接影響胚胎發(fā)育。

SHA等[4]發(fā)現(xiàn)在低滲和高滲兩種情況下，AQP1基因敲除的滋養(yǎng)層細(xì)胞滲透性均顯著低于正常的滋養(yǎng)層細(xì)胞。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，在孕鼠孕齡13.5 d時，AQP1+/-孕鼠、AQP1-/-孕鼠和AQP1+/+孕鼠的羊水量沒有顯著差異[5]。但在孕齡16.5 d時，與AQP1+/+孕鼠相比，AQP1-/-孕鼠的羊水量增多、羊水滲透壓和鈣離子濃度均降低。AQP1敲除后，胎膜的AQP9表達(dá)下調(diào)而AQP8表達(dá)上調(diào)。因此，胎膜中AQP1基因敲除與羊水量增加和滲透壓降低密切相關(guān)。此外，我們推測在胎盤和胎膜中AQPs的表達(dá)和作用存在相互代償機制。

2 AQP1基因敲除對腎臟的影響

應(yīng)用AQP1敲除小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)血管加壓素受體-2激活，髓質(zhì)集合管細(xì)胞的增殖顯著增加，細(xì)胞周期的基因表達(dá)改變，AQP1可以促進(jìn)細(xì)胞遷移和細(xì)胞增殖，因此AQP1在急性腎損傷后腎小管的結(jié)構(gòu)再生和功能修復(fù)中起重要作用[6]。與野生型小鼠比較，患內(nèi)毒素血癥時AQP1敲除小鼠表現(xiàn)為進(jìn)水量和尿量的顯著增加，尿鈉排泄量增加，而尿滲透壓顯著降低并伴有更嚴(yán)重的腎小管損傷，AQP1敲除小鼠的腎小球濾過率和腎血流量也降低[7]。這些反應(yīng)表明盡管AQP1敲除小鼠表現(xiàn)為多尿，但是這種多尿并不能減輕內(nèi)毒素血癥引起的急性腎損傷。

3 AQP1基因敲除對神經(jīng)系統(tǒng)的影響

研究發(fā)現(xiàn)盡管AQP1敲除小鼠脈絡(luò)膜叢上皮的腫脹和萎縮速度明顯減慢，但脈絡(luò)叢的大小、結(jié)構(gòu)不變，壓力依賴性腦脊液的滲出無明顯變化[8-9]，且腦脊液的空間幾乎與野生型小鼠相同[10]。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)無論是小鼠的脈絡(luò)叢上皮的Na+依賴性的Cl/HCO3-交換器，還是Na-K-ATP酶的表達(dá)都不受敲除AQP1的影響[11]。與野生型小鼠比較，AQP1基因缺失小鼠脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞滲透率降低，腺苷酸環(huán)化酶激活劑作用后腦脊液的產(chǎn)生降低20%～25%，顱內(nèi)壓下降56%，中心靜脈壓也顯著降低，冷刺激所致的腦損傷小鼠存活率提高[8-9]；AQP1缺失導(dǎo)致小鼠無刺激下的心室變小，白陶土誘導(dǎo)的心室擴(kuò)張減少和腦積水減輕[12]。綜上，AQP1在腦脊液動力學(xué)中發(fā)揮作用，AQP1的缺失對腦損傷可能有保護(hù)作用，AQP1為治療顱內(nèi)壓升高和腦積水的潛在靶點。

此外，ZHANG等[13]研究發(fā)現(xiàn)AQP1的缺失與背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元滲透壓降低有關(guān)。通過行為學(xué)研究發(fā)現(xiàn)AQP1缺失的小鼠在緩激肽、前列腺素E2誘發(fā)的疼痛實驗中，其疼痛感知能力顯著降低。此外，培養(yǎng)的AQP1敲除的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和外植體，自發(fā)的和神經(jīng)生長因子刺激的軸突延伸減少[14]。這些結(jié)果說明AQP1是背根神經(jīng)節(jié)軸突再生的一個新的決定因子。但是，SHIELDS等[15]的研究表明，無論是從電生理學(xué)角度分析還是從非常完整的行為學(xué)角度分析，都還沒有發(fā)現(xiàn)AQP1敲除小鼠和野生型小鼠在傷害感受處理方面的差異。因此，AQP1在傷害感受器中的作用仍有待確定。

4 AQP1基因敲除對心血管系統(tǒng)的影響

在敲除AQP1的小鼠模型中，一些研究已經(jīng)描述了AQP1在心血管表型中的作用[16-19]。與相同年齡的野生型小鼠相比，AQP1基因敲除小鼠無論雌雄均表現(xiàn)出明顯的心臟過小，心肌細(xì)胞變小，主動脈和腸系膜動脈的動脈壁厚度顯著減少，收縮壓和平均血壓較低（主要發(fā)生在夜間），而毛細(xì)血管密度和舒張壓無明顯變化[16]。但是，因為AQP1敲除小鼠壓力感受性反射正常，且心率的降低與血管收縮劑誘導(dǎo)的血壓升高成正比，此表現(xiàn)與野生型小鼠相似，所以較低的平均血壓并不是由改變的水平衡或自主功能障礙引起的。此外，AQP1基因缺失伴隨著心臟的AQP4、AQP7、AQP8及主動脈的AQP7的代償性上調(diào)[16]。這些發(fā)現(xiàn)證實了AQP1在心血管穩(wěn)態(tài)中具有潛在的作用。而且，AQP1缺失惡化了血管緊張素II誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化?？梢姡珹QP1正常表達(dá)對心血管系統(tǒng)起到保護(hù)作用[17]。

然而，AL-SAMIR等[18]研究發(fā)現(xiàn)，盡管AQP1敲除小鼠心臟的主要形態(tài)改變是心肌變薄，左心室壁厚度變小，心室肌纖維橫截面積減小，毛細(xì)血管與肌纖維比值降低，左心室中的毛細(xì)血管的絕對密度降低，但即使在多巴酚丁胺的刺激下，麻醉的AQP1敲除小鼠仍然表現(xiàn)出正常的心臟功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，因為心肌壁變薄，AQP1缺失明顯限制了常氧或低氧狀態(tài)下的最大氧消耗，即最大心輸出量減少[18]。但是，AQP1缺失并不影響動脈血氧飽和度、心率及呼吸速率[19]。因此可能需要通過更深入的研究去驗證AQP1缺失在病理情況下的作用，如在缺血/再灌注和壓力超負(fù)荷中AQP1缺失的影響。

5 AQP1基因敲除對眼的影響

體內(nèi)外的實驗研究發(fā)現(xiàn)AQP1缺失降低了角膜內(nèi)皮細(xì)胞對水的滲透性，不利于角膜腫脹后的透明度恢復(fù)，具體表現(xiàn)為角膜中的中性粒細(xì)胞增多，角膜上皮修復(fù)延遲，角膜細(xì)胞的遷移減少。研究人員推測AQP1缺失小鼠的角膜基質(zhì)傷口愈合速度減慢可能是角膜細(xì)胞遷移受損的結(jié)果[20]?？傊珹QP1敲除小鼠表現(xiàn)的角膜恢復(fù)明顯受損為角膜水腫的發(fā)生機制和治療提供了新的思路。但是，在缺氧誘發(fā)的視網(wǎng)膜病變的新生小鼠模型中，視網(wǎng)膜微血管的增生不受AQP1缺失的影響，這提示AQP1抑制劑可用于治療青光眼[21]。這些研究說明AQP1是眼部功能的一個新的重要決定因素。

6 AQP1基因敲除對細(xì)胞遷移的影響

目前已經(jīng)有大量研究證明了AQP1在細(xì)胞遷移中起重要作用，這涉及多種生物現(xiàn)象，如血管生成、傷口愈合、腫瘤擴(kuò)散和器官再生等。應(yīng)用AQP1敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)，AQP1的缺失并不影響軟骨細(xì)胞的增殖率，但與AQP1+/+軟骨細(xì)胞相比，AQP1-/-軟骨細(xì)胞的血清誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移率和與II型膠原纖維的黏附性以及相對質(zhì)膜水通透性降低[22]。因此，軟骨細(xì)胞中AQP1表達(dá)的適當(dāng)調(diào)節(jié)可能有助于軟骨細(xì)胞的移植和遷移。

另外，乳腺腫瘤病毒誘導(dǎo)的多瘤病毒中T致癌基因小鼠在缺失AQP1時，表現(xiàn)為腫瘤體積減小，微血管密度降低，且腫瘤肺轉(zhuǎn)移的可能性大大降低，提示AQP1是腫瘤血管生成的重要決定因素，為實體瘤的輔助治療提供了潛在的藥物靶點[23]。通過AQP1敲除小鼠體內(nèi)分離的腹腔巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)AQP1缺失自發(fā)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞伸長、軸向極化及向邊緣趨化，AQP1缺失對巨噬細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、膜極化及細(xì)胞遷移有顯著影響。AQP1敲除小鼠因浸潤巨噬細(xì)胞的數(shù)量減少而導(dǎo)致腹膜浸潤明顯減弱[24]。

綜上，AQP1對細(xì)胞的遷移有抑制作用，AQP1的下調(diào)有助于巨噬細(xì)胞在組織重塑、愈合和修復(fù)中發(fā)揮作用。因此，AQP1是潛在的藥理靶點，其對內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的抑制可限制腫瘤的生長和擴(kuò)散，而誘導(dǎo)AQP1可能加速傷口愈合，促進(jìn)器官再生。

7 AQP1基因敲除對腹膜的影響

ZHANG等[25]建立了一種特異性的AQP1敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)小鼠在初始臨床和生物學(xué)分析（包括體質(zhì)量和存活數(shù)目）中與正常小鼠無差異。但是，在腹膜平衡試驗中，AQP1敲除小鼠表現(xiàn)為跨細(xì)胞水轉(zhuǎn)運速率顯著下降，而小分子溶解物、尿素和葡萄糖的轉(zhuǎn)運速率無顯著改變。因此，調(diào)節(jié)細(xì)胞AQP1可能為預(yù)防腹膜透析超濾失敗提供一個潛在的治療靶點。

8 AQP1基因敲除對消化系統(tǒng)的影響

AQP1敲除小鼠膽囊對水的通透性減少了10倍，但膽囊的大小、形態(tài)，膽汁的滲透壓和鹽濃度均沒有明顯變化，AQP1并不參與膽囊重要生理功能[26]。然而，結(jié)扎了膽管的AQP1敲除小鼠表現(xiàn)為：病理性血管生成減少，血管纖維化減少，門靜脈高壓降低，這表明AQP1在慢性肝病期間發(fā)生的病理性血管生成中起著重要作用，AQP1將是慢性肝病在分子水平上的合理治療靶點[27]。

9 AQP1基因敲除對腺體分泌的影響

據(jù)AQP1敲除小鼠的垂體前葉數(shù)據(jù)分析顯示，與野生型小鼠相比，AQP1敲除小鼠的垂體和血清中的前體激素轉(zhuǎn)化酶、羧肽酶E和促腎上腺皮質(zhì)激素水平降低，與這些研究結(jié)果一致，AQP1在AtT20細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致促腎上腺皮質(zhì)激素的分泌減少、致密核心分泌顆粒蛋白的顯著丟失與生成減少[28]。這些發(fā)現(xiàn)表明，AQP1對維持分泌功能和顆粒生物合成很重要，此外，另有研究發(fā)現(xiàn)在AQP1缺失的淚液中pH不變，但鉀離子含量降低[29]。AQP1在腺體分泌中的具體作用機制還需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

10 小結(jié)

AQP1是一種選擇性的水通道蛋白，能顯著增強生物膜對水的滲透性。根據(jù)AQP1基因敲除小鼠在胎盤、腎、心、腦、腹膜、腺體、眼、膽囊和肝臟中的表型分析，AQP1可以促進(jìn)上皮間液的吸收或分泌，并在滲透梯度驅(qū)動下，在水分子的快速運動中發(fā)揮重要作用。應(yīng)用AQP1敲除小鼠研究獲得的結(jié)果，AQP1抑制劑可能成為利尿劑，有望治療腫瘤、青光眼、腦水腫等疾病，而AQP1激動劑可能用于治療多尿、羊水過多，加速傷口愈合，促進(jìn)器官再生。進(jìn)一步研究AQP1表達(dá)的調(diào)節(jié)因素，有助于闡明AQP1在相關(guān)疾病的發(fā)病機制中的作用，使AQP1成為治療疾病的靶點。