啤酒花HPLC指紋圖譜研究

董志敏，許月明，聞 俊，蔣益萍，秦路平,,辛海量

(1.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234；2.海軍軍醫(yī)大學藥學院，上海 200433；3.浙江中醫(yī)藥大學藥學院，浙江 杭州 310053)

啤酒花HumuluslupulusL.是?？迫劜輰俣嗄晟葙|蔓生藤本植物，雌性球穗花序不僅作為釀造啤酒的重要添加原料，也廣泛作為藥物應用，具有止咳化痰、健胃、消食、安神、利尿之功效，用于緩解食欲不振、腹脹、失眠、肺結核、癔病、浮腫、膀胱炎等癥狀[1]。在我國，啤酒花被作為民族藥(中藥)收錄于《哈薩克藥物志》、《內蒙古植物藥志》、《寧夏中藥志》、《新疆藥用植物志》、《四川中藥志》等，為藥食兩用的新疆特色資源植物，同時，在黑龍江、山東等地也有啤酒花栽培[2]。目前在歐洲，啤酒花提取物用于緩解更年期的潮熱不適以及絕經后骨質疏松癥[3]。據文獻報道，啤酒花含有木脂素、黃酮、多酚以及揮發(fā)性成分，其中，木脂素中的α酸、β酸，黃酮中的黃腐酚廣受業(yè)界關注，大量研究證明其具有抗骨質疏松作用[4-5]。綜觀啤酒花指紋圖譜研究，目前對啤酒花指紋圖譜研究甚少，要想對啤酒花進行系統(tǒng)的質量評價，區(qū)分啤酒花栽培種與野生種，須對啤酒花進行系統(tǒng)的指紋圖譜研究。因此，本實驗采用HPLC指紋圖譜，研究了26批新疆不同產地、品種啤酒花的指紋圖譜(表1)，并對啤酒花中的7種主要成分進行了指認。本方法簡單、方便、準確、高效，可用于啤酒花的質量評價。

表1 啤酒花樣品產地來源及相似度

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津 LC-20AD高效液相色譜儀(配有四元梯度系統(tǒng)，PDA檢測器)；色譜柱Diamonsil C18柱(250 mm × 4.6 mm,5 μm)；LC-solution色譜工作站。AG285型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。DL-1000B 智能超聲波清洗機(上海之信儀器有限公司)。

1.2 試劑

黃腐酚(CAS：6754-58-1，純度≥98%，上海歷鼎生物技術有限公司)；啤酒花浸膏ICE-3(美國釀造化學家協(xié)會)：包含類葎草酮、葎草酮、加葎草酮、類蛇麻酮、蛇麻酮、加蛇麻酮。色譜乙腈(Damas-beta有限公司)，色譜甲醇(Damas-beta有限公司)，分析磷酸(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3 藥材

啤酒花樣品由王果平于2017年采集于新疆不同地方(表1)，并經海軍軍醫(yī)大學藥學院生藥學教研室辛海量副教授鑒定，密封存放于干燥陰涼處。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱Diamonsil C18柱(250 mm × 4. 6 mm,5 μm)；流動相：0.1%磷酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～10 min，20%～25%B；10～12 min，25%～75%B；12～30 min，75%～78%B；30～40 min，78%～81%B；40～42 min，81%～83%B；42～60 min，83%～90%B);流速1.0 ml/min;柱壓10.2 MPa，柱溫30℃；檢測波長358 nm；進樣量10 μl。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取黃腐酚26.46 mg，置于100 ml容量瓶，加甲醇稀釋至刻度線，搖勻，得黃腐酚對照品儲備液；精密稱取啤酒花浸膏(ICE-3)466.27 mg置于100 ml容量瓶，加甲醇稀釋至刻度線，搖勻，得類葎草酮、葎草酮、加葎草酮、類蛇麻酮、蛇麻酮、加蛇麻酮對照品儲備液。分別取上述對照品儲備液適量，稀釋適當倍數，過0.45 μm微孔濾膜，得對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

分別取26個不同產地的啤酒花，依次粉碎存放于26個存放袋中，置于陰涼處，分別等量稱取0.5 g粉末，置于26個具塞錐形瓶中，加入50%乙醇20 ml，稱重，超聲處理30 min，涼至室溫，再稱重，用50%乙醇補足損失重量，濾除殘渣，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1精密度試驗

取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，進行測定。結果顯示，各共有峰相對保留時間RSD<1%，相對峰面積RSD<3%，表明該方法精密度良好。

2.4.2重復性試驗

分別取同一批啤酒花樣品適量，共6份，精密稱重，按照“2.3”項方法制備供試品溶液，按照“2.1”項色譜條件進行分析。結果表明，各共有峰相對保留時間RSD<1%，相對峰面積RSD<5%，表明該方法重復性良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗

取同一批啤酒花樣品適量，按照“2.1”項色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進行分析。結果表明，各共有峰相對保留時間RSD<1%，相對峰面積RSD<5%，表明供試品在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.5 樣品測定

取26批啤酒花樣品，分別按“2.3”項制備供試品，按“2.1”項色譜條件進行測定，結果得到19個共有峰，并對其中的黃腐酚、類葎草酮、葎草酮、加葎草酮、類蛇麻酮、蛇麻酮、加蛇麻酮進行指認，對照品及啤酒花樣品HPLC圖譜如圖1所示。

圖1 對照品及啤酒花樣品HPLC圖譜A.黃腐酚對照品；B.啤酒花浸膏(ICE-3)對照品；C.啤酒花樣品；9.黃腐酚；13.類葎草酮；14.葎草酮；15.加葎草酮；17.類蛇麻酮；18.蛇麻酮；19.加蛇麻酮

2.6 啤酒花指紋圖譜的建立

2.6.1內參比峰的選擇

在各批次的指紋圖譜中，13號峰為啤酒花中主要成分類葎草酮，保留時間適中，分離度良好，且面積大，為共有峰，確定為內參比峰。

2.6.2系統(tǒng)聚類分析

將26批啤酒花樣品各色譜峰峰面積相對于稱樣量量化處理，得到26×19矩陣信息，用SPSS 20統(tǒng)計軟件對其進行系統(tǒng)聚類分析，采用歐氏距離進行聚類分析，以化學距離為2.5，可以將26個樣品分為5類。聚類分析結果如圖2所示。

圖2 系統(tǒng)聚類分析樹狀圖

2.6.3共有模式的建立

采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”對26批啤酒花樣品的HPLC指紋圖譜進行數據分析處理，將S1作為參照圖譜，選取“時間窗寬度”為0.1 min，以平均數的方法生成啤酒花共有模式的指紋對照圖譜。計算不同樣品與對照品的相似度如表1所示，啤酒花指紋圖譜見圖3。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

啤酒花供試品的HPLC的3D圖像顯示，在358 nm檢測波長下有較好吸收，基線平穩(wěn)，各峰型較好，出峰數量也較多，因此選定檢測波長為358 nm。本研究考察了甲醇-0.1%磷酸水系統(tǒng)和乙腈-0.1%磷酸水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸水系統(tǒng)分離效果較好。故選定乙腈-0.1%磷酸水作為流動相進行梯度洗脫，能達到較好的分離。

3.2 系統(tǒng)聚類分析與指紋圖譜相似度評價

圖3 26批不同產地啤酒花樣品指紋圖譜

由聚類分析樹狀圖可以看出，26批啤酒花樣品以化學距離為2.5，可分為5類。第一類又細分為3組，均為栽培種，第二類均為野生種，第三類均為栽培種，包含薩斯特和扎一品種；第四類為焉耆縣的栽培種，第五類為栽培種，含有馬可波羅栽培品種。由聚類分析結果可以看出，野生種和栽培種化學成分含量差異明顯，野生種可以單獨聚成一類，栽培種之間不同品種的化學成分含量差異較大，栽培種其不同的品種也可以單獨聚類。在相似度評價中，相似度≤0.900的5批啤酒花均為野生種啤酒花。經系統(tǒng)聚類和相似度評價分析可以得出，啤酒花化學成分含量與栽培品種和野生種的關系密切。

綜上所述，本實驗建立了啤酒花HPLC指紋圖譜，可為今后控制啤酒花的質量提供理論依據。