藥物分子與靶蛋白相互作用的研究進展

李 安，周小青，孫 闊，楊謹如，朱勇飛，陸一鳴

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410013)

藥物活性分子的靶點中80%以上為蛋白質(zhì)，包括膜表面的各類受體和離子通道、胞內(nèi)受體、酶、細胞因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子等。藥物通過與靶點結(jié)合，即相互作用，在體內(nèi)外發(fā)揮各種藥理功能。無論是在新藥篩選開發(fā)或是靶點發(fā)現(xiàn)的過程中，檢測藥物分子與靶點的相互作用都是研究藥物作用機制、靶點確證及改造和優(yōu)化先導(dǎo)活性分子的關(guān)鍵一步。隨著分子生物學(xué)和生物物理學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，研究人員已經(jīng)能夠利用多種技術(shù)手段從藥物分子與靶蛋白相互作用的親和力、結(jié)合解離動力學(xué)、熱動力學(xué)以及藥物-靶點結(jié)合界面的結(jié)構(gòu)生物學(xué)信息等多個方面探索藥物的作用機制。本文對近年來最新發(fā)展的實驗技術(shù)進行總結(jié)，針對藥物研發(fā)進程中的不同階段，介紹這些方法研究藥物與靶蛋白相互作用的原理、提供的信息以及優(yōu)勢與不足。

1 靶蛋白的尋找與確證

1.1 細胞熱轉(zhuǎn)變分析(CETSA)

當藥物分子結(jié)合到靶蛋白上時，蛋白通常會變得更加穩(wěn)定。利用這一生物物理學(xué)原理，Karolinska研究所的研究人員開發(fā)出了一種檢測藥物與細胞內(nèi)和組織樣品內(nèi)的靶蛋白結(jié)合的方法，他們通過對加藥處理后提取的細胞或組織蛋白進行梯度遞增加熱，結(jié)合Western-blot技術(shù)得到待測蛋白的熱穩(wěn)定性曲線，比較蛋白熱穩(wěn)定性的變化來評估藥物分子與靶蛋白的結(jié)合作用。因這種方法類似于體外的熱漂移實驗(TSA)，他們便將其命名為CETSA(cellular thermal shift assay)[1]。利用這種方法成功鑒定了藥物分子與一系列重要的臨床靶標之間的相互作用，并監(jiān)測了藥物在腫瘤細胞內(nèi)的脫靶與耐藥效應(yīng)。Shaw 等運用CETSA技術(shù)報道了在前列腺癌細胞系內(nèi)鑒定與雄激素受體(AR)直接結(jié)合的藥物分子，同時他們以此方法對一個小分子化合物庫進行了高通量篩選，驗證并測算了AR與其拮抗劑分子在細胞內(nèi)環(huán)境下的親和力與Ki值[2]。CETSA很好地解決了無法直接觀察藥物分子與細胞內(nèi)靶點結(jié)合的難題，在靶點發(fā)現(xiàn)和驗證領(lǐng)域?qū)⒛艿玫綇V泛應(yīng)用。

1.2 鄰近蛋白標記

2012年，Roux等提出了一種在細胞內(nèi)標記蛋白相互作用的方法：鄰近蛋白標記 (BioID)[3]。其基本原理是將誘餌蛋白和生物素連接酶在細胞中融合表達，在加入生物素后，與誘餌蛋白發(fā)生相互作用或距離很近的蛋白會被生物素連接酶標記上生物素，再通過親和素純化被生物素標記的蛋白，利用質(zhì)譜鑒定純化產(chǎn)物即可獲知與誘餌蛋白結(jié)合的蛋白。BioID非常適用于研究難溶或者難以提取的亞細胞、細胞器結(jié)構(gòu)蛋白，能夠檢測到較弱的瞬時相互作用，并且鑒定到的是胞內(nèi)天然相互作用，接近體內(nèi)的真實生理環(huán)境。

然而BioID也有明顯的缺點，就是無法判斷待測蛋白與誘餌蛋白是直接相互作用還是間接的相互作用。為了解決這個問題，來自加利福尼亞大學(xué)的Zhuang等人，基于類泛素分子NEDD8 E2結(jié)合酶以及IAP(凋亡抑制因子)羧基端的泛素連接酶E3結(jié)構(gòu)域設(shè)計了一種嵌合連接酶 NEDDylator，當IAP的底物進入E3活性位點時，NEDD8從E2轉(zhuǎn)移至E3接近底物蛋白并與其表面的賴氨酸發(fā)生共價結(jié)合(NEDD化)，利用這套標記工具，他們發(fā)現(xiàn)了50多種IAP的候選底物，很好地捕捉到了經(jīng)典pull-down方法難以檢測到的胞內(nèi)蛋白間的瞬時相互作用。同時，由于NEDD8只能通過直接攻擊位于E3活性部位硫酯之上的底物蛋白賴氨酸實現(xiàn)對底物的標記，確保了誘餌蛋白IAP與底物蛋白為直接接觸[4]。作為這項技術(shù)的衍生， Hill等[5]對NEDDylator進行了改造，引入了SNAP標簽，其一端與NEDD8 E2融合，另一端攜帶活性小分子，當小分子與靶蛋白質(zhì)結(jié)合時，生物素化的NEDD8可以共價連接到靶蛋白的分子表面，通過后續(xù)的富集鑒定可以準確知曉小分子的靶蛋白。他們用這種方法在復(fù)雜的細胞裂解物中驗證了藥物達沙替尼引導(dǎo)的NEDD化作用與已知內(nèi)源性蛋白的相互作用有關(guān)，這為鑒定小分子的靶標提供了一種新的策略。

2 體外結(jié)合能力的測定

2.1 表面等離子共振技術(shù)

表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)是一種經(jīng)典的檢測生物分子相互作用的分析技術(shù)，近20年來廣泛應(yīng)用于藥物篩選、蛋白質(zhì)組學(xué)、抗體-抗原表位識別等領(lǐng)域，可實時監(jiān)測多肽、蛋白質(zhì)、DNA和寡聚糖等各類生物分子相互作用的整個過程，靈敏度高、特異性強，在獲得親和力KD值的同時能反映受體-配體的結(jié)合速率、解離速率、結(jié)合常數(shù)Ka和解離常數(shù)Kd等相互作用的動力學(xué)信息[6]。然而由于SPR需將目的蛋白以氨基偶聯(lián)的方式包被在傳感器芯片上，蛋白的某些位點和區(qū)域的局部結(jié)構(gòu)可能會受到影響，因此實驗結(jié)果不排除存在假陽性或假陰性的數(shù)據(jù)[7]。

作為SPR技術(shù)的延伸，表面等離子共振顯微鏡(SPR microscopy，SPRM)的應(yīng)用是近年來的一項重要進展。傳統(tǒng)SPR需要提取細胞內(nèi)的蛋白或體外表達純化蛋白，用以偶聯(lián)到芯片表面，對于難溶和難以體外表達的膜蛋白無疑是一個巨大的挑戰(zhàn)和煩瑣的過程。而SPRM可以直接將活細胞固定在芯片陣列上并進行培養(yǎng)，無需提取膜蛋白，可在原位實時地研究藥物配體分子與細胞的結(jié)合過程。同時，SPRM具有微米級高分辨率，單個細胞膜上蛋白的整體和局部的結(jié)合反應(yīng)都能被即時的監(jiān)測到，可以很好地反映藥物與天然狀態(tài)下膜蛋白的結(jié)合動力學(xué)過程[8]。除了真核細胞外，SPRM還能在芯片上包被培養(yǎng)細菌或病毒顆粒，在原位研究抗生素、抗體、抑制劑等藥物分子與生物大顆粒的相互作用[9-10]。

2.2 等溫滴定量熱法

除了動力學(xué)檢測和熒光檢測方法外，微量熱技術(shù)(microcalorimetry)也是研究較多的一種方法。受體和配體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)時，體系要么產(chǎn)生熱量，要么吸收熱量，等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry,ITC)就是在恒溫條件下將配體樣品逐滴滴入包含受體分子的樣品池中，直接測量反應(yīng)體系釋放或吸收的熱量變化來量化兩種分子間的相互作用。進行一次滴定反應(yīng)除可得到親和力KD值外，還可以提供總能量變化ΔG、焓變 ΔH、熵變TΔS及化學(xué)計量比等熱力學(xué)參數(shù)，分析結(jié)合反應(yīng)的類型和作用機制，有助于理解哪種相互作用(氫鍵、范德華力、疏水作用或構(gòu)象變化)對總體結(jié)合親和力的貢獻較大。相對于SPR和MST，ITC既不需要固定化偶聯(lián)修飾蛋白，亦無需熒光標記蛋白，反映了天然溶液狀態(tài)下的分子相互作用，較接近體內(nèi)生理環(huán)境狀態(tài)，與其他分子相互作用方法相比有著獨特的優(yōu)勢。ITC所確定的親和力參數(shù)常常被認為是“金標準”值，在生命科學(xué)和制藥領(lǐng)域已得到了廣泛認可[11]。Justin 等開發(fā)了一對互補等溫滴定量熱法技術(shù)來測量酶抑制動力學(xué)，他們用這種方法研究了脯氨酰寡肽(POP)與其共價和非共價抑制劑的相互作用，檢測到了跨越3個數(shù)量級的動力學(xué)速率，包括過快的結(jié)合反應(yīng)以及低于標準ITC檢測閾值的的pM級別的親和力，大大拓展了經(jīng)典ITC的測定范圍[12]。

2.3 微量熱泳動

微量熱泳動(microscale thermophoresis,MST)是近幾年來新興的一項基于熒光檢測分子相互作用的研究技術(shù)。在微觀的溫度梯度場中，生物分子會發(fā)生定向運動，即熱泳動現(xiàn)象，而生物分子在發(fā)生相互作用形成復(fù)合物之后，其分子量、分子構(gòu)象、水化層及帶電性質(zhì)會發(fā)生改變，引起定向運動尺度的改變，即在結(jié)合配體前后生物分子的熱泳動程度存在變化。MST將熒光檢測與熱泳動相結(jié)合，通過熒光標記生物大分子，在溫度梯度毛細管中檢測分子的熒光分布變化，來分析標記物與配體的親和力[13]。MST快速、靈敏、精確，樣品耗費量少，且不需要將蛋白偶聯(lián)到固相表面，可直接測量溶液環(huán)境中分子間親和力，目前已有許多運用在蛋白-蛋白、蛋白-小分子和蛋白-核酸相互作用的研究實例[14-16]。對于蛋白質(zhì)與多肽相互作用的檢測，也有研究人員采用MST成功測定了植物肽類激素PSK與受體蛋白PSKR的結(jié)合作用[17]。除了對特定的藥物分子-靶點相互作用進行研究，NanoTemper公司還推出了一種全自動機型Monolith NT.Automated，該機型將親和力檢測與自動移液設(shè)備結(jié)合，30 min即可測定100個樣品，非常適合藥物先導(dǎo)分子的高通量篩選。Gerhard Klebe比較了不同方法從化合物庫中篩選先導(dǎo)片段分子，采用MST方法的命中率達到27%，高于TSA(8%)和傳統(tǒng)生化實驗的命中率(17%)[18]。

3 結(jié)合位點與作用機制的鑒定

3.1 X射線晶體衍射

藥物分子與靶蛋白形成復(fù)合物共結(jié)晶是其與靶標結(jié)合的最終驗證，也是最直接、最可靠的證據(jù)。X射線晶體衍射(X-ray diffraction)是目前和未來較長一段時間內(nèi)在原子水平確定生物大分子及復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的最為有效的手段，其分辨率能夠達到0.1 nm以下。隨著蛋白表達純化系統(tǒng)、晶體培養(yǎng)平臺、X射線衍射儀器和數(shù)據(jù)處理分析軟件的不斷升級換代，蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)解析正在邁向高通量、自動化。通過蛋白-小分子共結(jié)晶或小分子浸泡靶蛋白晶體的方法來獲得蛋白-小分子復(fù)合物的晶體，再利用X射線衍射收集數(shù)據(jù)并處理解析，就可以獲得靶蛋白與藥物分子結(jié)合的結(jié)構(gòu)信息[19]。

高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)往往有助于藥物開發(fā)者直接判定結(jié)合位點，并以此為基礎(chǔ)對藥物先導(dǎo)分子進行結(jié)構(gòu)改造來發(fā)展親和力更強或靶點選擇性更高的候選藥物，同時也可以明確藥物的作用機制與方式。然而，共結(jié)晶晶體的獲得是此技術(shù)最大的限制，許多活性分子可能由于結(jié)合動力學(xué)、熱動力學(xué)的性質(zhì)而不適于浸泡蛋白形成共結(jié)晶，因此也可能導(dǎo)致關(guān)于底物結(jié)合與否的假陰性判斷[20]。

3.2 核磁共振

相比于靜態(tài)的晶體結(jié)構(gòu)，核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)可以測定生物大分子在溶液狀態(tài)下的一系列動態(tài)結(jié)構(gòu)，可能更接近于生物分子在體液、細胞內(nèi)或核內(nèi)環(huán)境下的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。NMR在探測配體-蛋白相互作用和藥物篩選方面也有廣泛應(yīng)用?？煞譃閮煞N模式：基于配體(小分子)的相互作用觀察，可通過NMR波譜的化學(xué)位移直接驗證小分子與受體蛋白的結(jié)合，得到親和力等參數(shù)，但不能獲悉結(jié)構(gòu)學(xué)方面的信息，不能看到結(jié)合位點[21-22]；基于蛋白的相互作用觀察，對靶點進行15N或13C同位素單標記，可以進行二維滴定來明確配體結(jié)合到蛋白的哪個部位，而將蛋白同位素雙標記則可以測定復(fù)合物的溶液三維結(jié)構(gòu)與動力學(xué)特征[23-24]。NMR應(yīng)用的技術(shù)瓶頸一是蛋白分子量的限制，分子量往往需要在40 000甚至30 000以下，而大部分具有重要功能的蛋白質(zhì)都超過了這個范圍。同時，蛋白在溶液中的狀態(tài)也必須非常均一穩(wěn)定，一般為單體。二聚體或多聚體的樣品由于譜峰信號重疊嚴重，往往不適合NMR實驗。另一大難點是NMR需要大量同位素標記的蛋白樣品，同位素標記試劑的高成本和蛋白在更換培養(yǎng)基后的表達量問題亦會成為很大的阻礙。

3.3 X射線小角散射

X射線小角散射(small angle X-ray scattering，SAXS)可用于研究蛋白-蛋白、蛋白-DNA、蛋白-RNA和蛋白-小分子之間在溶液中的相互作用，提供有關(guān)靶蛋白的折疊、聚集狀態(tài)、內(nèi)在柔性以及復(fù)合物的形狀、尺寸、外殼結(jié)構(gòu)等信息[25]。雖然SAXS的分辨率僅能達到1～2 nm，但它可以用來監(jiān)測配體對蛋白-蛋白相互作用的調(diào)節(jié)效應(yīng)和對靶蛋白構(gòu)象、寡聚狀態(tài)的影響，對揭示藥物分子的藥理機制有很大幫助。SAXS能夠通過檢測溶液微環(huán)境的變化而檢測到較弱的相互作用，同時提供配體-蛋白結(jié)合解離過程的平衡態(tài)、化學(xué)計量學(xué)等信息，對于超大分子量的或超聚體復(fù)合物，可以聯(lián)合單個分子的X線晶體結(jié)構(gòu)或NMR結(jié)構(gòu)來構(gòu)建蛋白-配體復(fù)合物的低分辨率結(jié)構(gòu)模型，從而直觀地反映高分子復(fù)合物的組裝動力學(xué)過程[26]。

4 總結(jié)與展望

隨著分子生物學(xué)和生物物理學(xué)的不斷突破與進展，基于各種原理的分子相互作用研究手段在進行飛快的更新與升級換代。研究者在藥物研發(fā)和靶點機制的探索過程中已不僅限于采用單一的方法來分析藥物-靶點的相互作用，聯(lián)合運用多種相互作用檢測技術(shù)往往能大幅提高新藥篩選的通量和效率。同時，多種方法之間可以互相取長補短以增強研究結(jié)果的可靠性，能夠最大限度地避免假陽性或假陰性的誤判[27-29]。另外，藥物分子與靶點的結(jié)合也逐漸由單純的體外親和力測定發(fā)展為溶液、胞內(nèi)和體內(nèi)生理狀態(tài)下的鑒定模式，諸如CETSA和BioID這類技術(shù)能幫助我們更直接地探查藥物在體內(nèi)的真實效能與作用方式，雖然在方法上還存在諸多不足需要改善，但相信不久的將來會成為研究藥物相互作用的有力手段。