馬鈴薯泛素結(jié)合酶基因StUBC17的克隆與功能分析

雷朝霞 劉晶，2 白易平 唐唯，2 王洪洋，2

（1. 云南師范大學生命科學學院，昆明 650500；2. 云南師范大學馬鈴薯科學研究院，昆明 650500）

植物泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin-proteasome pathway，UPP）廣泛存在于真核細胞中，在植物的生長發(fā)育、形態(tài)形成及抗逆反應(yīng)等過程中扮演著重要角色［1-2］。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)主要由E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶、E3泛素蛋白連接酶、蛋白酶體和去泛素化酶組成。通過3種酶先后與靶蛋白結(jié)合形成1條多泛素鏈，將底物蛋白泛素化后，使靶蛋白被26S蛋白酶識別并降解，從而實現(xiàn)對多種代謝過程的調(diào)節(jié)。其中，E2泛素結(jié)合酶是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中的重要組成部分，對蛋白泛素化修飾起關(guān)鍵作用［3］。由致病疫霉菌（Phytophthora infestans（Mont.）de Bary）引起的馬鈴薯晚疫病嚴重威脅著全球馬鈴薯生產(chǎn)安全，嚴重時導致馬鈴薯大幅度減產(chǎn)［4］。

Ni等［5］研究發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶基因StRFP1受P. infestans、SA、MeJA等誘導表達，在馬鈴薯抗晚疫病反應(yīng)中起正向調(diào)控作用。穩(wěn)定超量表達StRFP1增強馬鈴薯的抗病性，而抑制StRFP1表達促使馬鈴薯更感病。同樣，抑制E3泛素連接酶基因StPUB17表達導致馬鈴薯抗病性減弱和對鹽脅迫更敏感［6］。He等［7］研究證實了馬鈴薯StPUB17定位于細胞核中，正向調(diào)控馬鈴薯的抗病免疫反應(yīng)。此外，E3泛素連接酶基因CMPG1也在調(diào)控植物免疫方面同樣發(fā)揮重要作用。CMPG1的沉默大大減弱了抗病基因Cf-9、Cf-4、Pto及P. infestans病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）基因INF1等介導抗病信號傳導［8］。另外，E3泛素連接酶基因也可以作為負調(diào)控因子參與植物抗病信號傳導。如E3泛素連接酶基因POB1負調(diào)控植物基礎(chǔ)免疫和細胞死亡反應(yīng)。沉默POB1能夠抑制P.infestans的擴展，增強植物對晚疫病的抗性；而瞬時超量表達POB1則促進P. infestans的侵染，且能夠抑制 Cf4/Avr4介導的細胞死亡［9］。以上研究表明，E3泛素連接酶對植物抗病免疫系統(tǒng)起著重要作用。

有關(guān)E2泛素結(jié)合酶在植物抗病免疫反應(yīng)中功能的報道則很少，且相關(guān)研究多集中在E2泛素結(jié)合酶基因受病原菌誘導表達方面，缺少實質(zhì)的基因功能研究。如Li等［10］利用cDNA-AFLP法在馬鈴薯中篩選出一個EST序列受β-氨基丁酸（β-aminobutyric acid，BABA）誘導表達，經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)該EST對應(yīng)基因為泛素結(jié)合酶基因E2-17（GenBank：XM_015307154.1，StUBC17）。劉炎霖等［11］從水茄（Solanum torvum）中克隆得到一個756 bp的泛素結(jié)合酶基因（StUBCc），RT-PCR表明StUBCc受黃萎病菌誘導表達。劉鑫等［12］通過生物信息學、RNA-seq和qRT-PCR的方法，分析了水稻泛素結(jié)合酶基因家族的特征及其表達模式，發(fā)現(xiàn)有超過50%水稻泛素結(jié)合酶基因受稻瘟病菌誘導表達。

為了研究E2泛素結(jié)合酶是否對馬鈴薯抗病反應(yīng)發(fā)揮作用，本研究在BABA誘導基礎(chǔ)上，從馬鈴薯栽培種“合作88”（“C88”）中克隆得到E2泛素結(jié)合酶基因StUBC17的全長序列并對其進行生物信息學分析。利用病毒誘導的基因沉默技術(shù)（Virusinduced gene silencing，VIGS）在本氏煙（Nicotiana benthamiana）上構(gòu)建了NbUBC（StUBC17同源基因）基因沉默植株，并對其進行晚疫病抗性鑒定。此外，利用農(nóng)桿菌介導基因瞬時表達技術(shù)，在NbUBC沉默植株上共表達馬鈴薯抗病基因和相應(yīng)無毒基因及晚疫病菌PAMP基因INF1，為深入研究StUBC17調(diào)控馬鈴薯抗病性的作用機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯栽培種“合作88”（“C88”）為云南師范大學馬鈴薯科學研究院保存?！癈88”無菌試管苗在含有4%蔗糖的MS培養(yǎng)基中繁殖，待試管苗生長30 d時將其移栽于溫室塑料缽（20 cm×20 cm）中生長，澆水、施肥等按日常管理。將生長兩個月健康無機械損傷的葉片用于P. infestans接種。

本氏煙為云南師范大學馬鈴薯科學研究院保存，種植于恒溫生長室內(nèi)。幼苗移栽后于22℃ 16 h 光照/8 h黑暗條件下生長28-35 d，然后進行VIGS沉默和農(nóng)桿菌注射瞬時共表達試驗。

P. infestans生理小種88069（1.3.4.7）和HB09-14-2（1.2.3.4.5.6.7. 9.10.11）由華中農(nóng)業(yè)大學馬鈴薯實驗室饋贈。合作88對P. infestans生理小種88069表現(xiàn)抗病過敏反應(yīng)，對生理小種HB09-14-2表現(xiàn)感病。菌株繁殖和保存采用黑麥培養(yǎng)基［13］。

1.2 方法

1.2.1 DNA和RNA的提取 采用植物基因組DNA提取試劑盒（貨號DP305，天根天根生化科技有限公司）提取接種P. infestans后的煙草葉片的DNA，具體步驟見試劑盒說明書。采用Trizol-RNA提取試劑盒（貨號DP432，天根天根生化科技有限公司）提取馬鈴薯葉片總RNA，具體步驟見說明書。提取的RNA于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2StUBC17的克隆及序列分析 將前人公布的差 異 表 達 片 段 TDF8-11-2（GenBank：EL732271）序列在NCBI網(wǎng)站和茄科基因組數(shù)據(jù)庫（http：//solanaceae.plantbiology.msu.edu/ index.shtml）上進行BlAST比對，發(fā)現(xiàn)TDF8-11-2與馬鈴薯泛素結(jié)合酶E2-17基因（StUBC17）序列相似率高達87%。初步判斷該序列表達標簽對應(yīng)基因為StUBC17。根據(jù)StUBC17全長序列設(shè)計引物（表1），以“C88”的cDNA為模板，采用Pfu高保真PCR聚合酶（貨號：P501，南京諾唯贊生物科技有限公司）進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收，并與pEASY-T1克隆載體（貨號：CT101，北京全式金生物技術(shù)有限公司）連接，測序。

采用在線軟件HMMER分析蛋白結(jié)構(gòu)域，用Protparam分析蛋白等電點和分子量，用DANMAN軟件對StUBC17和其他同源蛋白的氨基酸序列進行比對。

1.2.3StUBC17在P. infestans誘導下的表達分析 馬鈴薯C88試管苗繼代培養(yǎng)1個月后移栽至溫室，待其生長50 d左右用于P. infestans生理小種（88069和HB09-14-2）接種。提取經(jīng)P. infestans處理和無菌水處理（對照）4個不同時間點（0、24、36和72 h）的葉片的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。每個處理時間點取2片葉片，3次生物學重復。以cDNA為模板，StEF1（GenBank：AB061263）為內(nèi)參基因，qRT-PCR分析StUBC17受P. infestans誘導表達特性。相關(guān)引物見表1，反應(yīng)體系參照KAPA SYBR?快速定量PCR試劑盒（貨號：KK4601，Kappa Bioscience AS）說明 ：2×qRT-PCR mix 5 μL、H2O 2.4 μL、 左 右 引 物（10 μmol/L） 各 0.2 μL、50×Rox 0.2 μL 和模板 2 μL。于 ABI StepOnePlus實時熒光定量PCR系統(tǒng)上進行反應(yīng)，反應(yīng)程序：95℃3 min；95℃ 10 s，58℃ 30 s，40 個循環(huán)。采用 2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.2.4 VIGS載體構(gòu)建及基因沉默效率分析 用于構(gòu)建 VIGS體系的 pTRV2（GenBank：AF406991.1）、含煙草脆裂病毒RNA1片段的pTRV1（GenBank：AF406990.1）及攜帶八氫番茄紅素脫氫酶基因（phytoenedesaturae，PDS）的病毒載體由華中農(nóng)業(yè)大學馬鈴薯實驗室惠贈。將StUBC17序列經(jīng)BlAST比對獲得本氏煙中的同源基因NbUBC（GenBank：KR296788.1），再以NbUBC序列設(shè)計VIGS載體引物（表1）。

采用LA酶（貨號：RR02MA，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）從本氏煙cDNA中PCR擴增NbUBC的3′端片段，用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶酶切擴增片段和TRV2載體，回收后分別連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。得到的轉(zhuǎn)化子用TRV載體通用引物（表1）進行PCR檢測，篩選成功插入目的片段的陽性克隆并測序。利用電轉(zhuǎn)化法將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101菌株中。陰性對照為重組載體攜帶外源GFP片段，即TRV-GFP；陽性對照為重組載體攜帶的PDS片段，即TRV-PDS。

選取3-4葉齡的本氏煙，陰性對照（TRV-GFP）、陽性對照（TRV-PDS）和目標基因（TRV-NbUBC）沉默植株各4株，待陽性對照（TRV-PDS）植株新長出的葉片出現(xiàn)漂白現(xiàn)象時（約25 d），取對照植株（TRV-GFP）和沉默植株（TRV-NbUBC）頂葉以下第3-第4片葉片，3次生物學重復。分別提取葉片總RNA進行qRT-PCR檢測，以NbEF1（GenBank：AY206004）為內(nèi)參基因。用Excel軟件對NbUBC表達量進行t檢驗（兩尾檢驗），分析差異顯著性（**P＜0.01）。

1.2.5 農(nóng)桿菌介導的基因瞬時表達分析 采用Wang等［14］方法，將含有馬鈴薯抗病基因（R3a、R3b和Rx）、無毒基因（AVR3a、AVR3b和CP）及INF1的農(nóng)桿菌在LB平板培養(yǎng)基上活化，28℃培養(yǎng)2 d。挑取單克隆接入1 mL LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/L Kan和 25 μg/L Rif），28℃，200 r/min，培養(yǎng)過夜。取500 μL菌液加入5 mL含相應(yīng)抗生素YEB培養(yǎng)液中，另加0.5 μL的200 μmol/L乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS），28℃，200 r/min，培養(yǎng)過夜。4 000 r/min離心10 min，收集農(nóng)桿菌沉淀，并加入MMA buffer（10 μmol/L MES，10 μmol/L MgCl2和 200 μmol/L AS，pH 5.6），調(diào)整農(nóng)桿菌懸浮液的OD600值約為 0.4。

將含馬鈴薯抗病基因-無毒基因組合（R3a+AVR3a、R3b+AVR3b和Rx+CP）及INF1的農(nóng)桿菌懸液分別注射3株對照植株（TRV-GFP）和3株基因沉默植株（TRV-NbUBC）頂葉以下第3至第5片葉片，每株注射3片葉片，3次生物學重復。GFP為陰性對照，5 d后觀察HR反應(yīng)。含馬鈴薯抗病基因-無毒基因組合（R3a+AVR3a、R3b+AVR3b和Rx+CP）及晚疫病菌PAMP基因INF1的質(zhì)粒由華中農(nóng)業(yè)大學馬鈴薯實驗室饋贈。

表1 實驗所用引物

1.2.6 晚疫病菌接種、病斑面積及菌絲生物量統(tǒng)計 參照Vleeshouwers 等［13］方法對馬鈴薯C88和本氏煙進行離體葉片接種。將P. infestans的孢子囊濃度調(diào)至約5×104個/mL，4℃下放置2-3 h后用于接種。每片葉片主脈兩側(cè)各接種10 μL孢子懸浮液，塑料薄膜密封接種盤，相對濕度95%，溫度20℃。

每次接種本氏煙，陰性對照（TRV-GFP）和沉默植株（TRV-NbUBC）各4株，每株分別取頂葉以下第3、第4片葉片用于P. infestans接種，3次生物學重復。接種5 d后，用游標卡尺測量病斑的長和寬，病斑面積= 1/4×π×長×寬。用Microsoft Excel軟件對病斑面積進行t檢驗（兩尾檢驗），分析差異顯著性（**P＜0.01）。

參照 llorente等［15］方法對P. infestans生物量進行統(tǒng)計。提取P. infestans（88069）接種陰性對照（TRV-GFP）和沉默植株（TRV-NbUBC）2個不同時間點（0和120 h）的葉片總DNA，每個時間點混合取樣（4片葉片），3次生物學重復。以接種后0和120 h的葉片DNA為模板，P. infestans特異基因PiO8和本氏煙內(nèi)參基因NbEF-1a用于qRTPCR檢測，引物見表1。用Microsoft Excel軟件對P.infestans生物量進行t檢驗（兩尾檢驗），分析差異顯著性（**P＜0.01）。

1.2.7 臺盼藍染色 為了更清晰觀察接種P. infestans葉片的發(fā)病表型，用臺盼藍對發(fā)病細胞進行染色。參照Wang等［14］的方法，將接種6 d后的本氏煙葉片浸泡在臺盼藍染液（以100 mL為例：25 mL水飽和酚、25 mL甘油、25 mL乳酸、25 mL 水和25 mg臺盼藍）中，浸泡36 h后，用95%乙醇煮沸2 min進行脫色，然后放在50%甘油中保存，自然光照下拍照。

2 結(jié)果

2.1 StUBC17的克隆和序列分析

基因序列分析表明，克隆得到的StUBC17與NCBI數(shù)據(jù)庫公布的E2-17泛素結(jié)合酶（GenBank：XM_015307154.1）基因的序列完全相同。StUBC17編碼序列全長為447 bp，編碼多肽含有148個氨基酸。StUBC17蛋白預(yù)測分子量為16.52 kD，理論等電點為7.72。蛋白功能域分析表明，第5-142位氨基酸區(qū)間為泛素結(jié)合功能域（圖1-A）。

將StUBC17蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BlAST比對（圖1-B），發(fā)現(xiàn)StUBC17在番茄（SLUBC17，XM_019214130.2）、 辣 椒（CaUBC17，XM_016720-450.1）、煙草（NtUBC17，XM_016606733.1）和本氏煙（NbUBC，KR296788.1）中均有同源蛋白，相似性分別為100%、100%、99.32%和99.32%。通過DNAMAN軟件對StUBC17及其同源蛋白進行氨基酸序列比對，結(jié)果表明，不同泛素結(jié)合酶間的泛素結(jié)合功能域高度保守。

圖1 馬鈴薯StUBC17蛋白結(jié)構(gòu)域（A）及與其同源蛋白氨基酸序列比對（B）分析

2.2 StUBC17的表達特性分析

對不同接種時間點StUBC17的qRT-PCR分析結(jié)果（圖2）表明，在88069和HB09-14-2接種24 h時，StUBC17均上調(diào)表達。而在接種后48和72 h，與對照相比，接種88069的C88葉片中StUBC17表達水平無顯著變化；接種HB09-14-2的“C88”葉片中StUBC17表達水平雖有所下調(diào)，但仍高于對照。

2.3 NbUBC的沉默效率分析

檢測對照和基因沉默植株中NbUBC的表達量，結(jié)果（圖3-A）顯示，該基因的mRNA水平均出現(xiàn)不同程度的下降。

2.4 NbUBC沉默煙草植株晚疫病抗性的鑒定

圖2 熒光定量PCR分析馬鈴薯StUBC17的表達模式

接種P. infestans（88069）5 d后，發(fā)現(xiàn)對照植株葉片發(fā)病較輕且葉片病斑面積明顯較NbUBC沉默植株?。▓D3-B，D）。另外，通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，NbUBC沉默植株上的P. infestans生物量明顯高于對照植株（圖3-C）。結(jié)果表明，沉默NbUBC降低了本氏煙對P. infestans的抵抗能力。

2.5 沉默NbUBC不影響R3a-AVR3a、R3b-AVR3b、Rx-CP及INF1介導的HR反應(yīng)

基因沉默25 d后，分別在對照植株（TRV-GFP）和基因沉默植株（TRV-NbUBC）頂葉以下第3至第5片葉片中瞬時表達R3a-AVR3a、R3b-AVR3b、Rx-CP及INF1。表達5 d后，除陰性對照（瞬時表達GFP）外，葉片注射點均呈現(xiàn)HR反應(yīng)（圖4）。說明沉默NbUBC沒有影響R3a-AVR3a、R3b-AVR3b、Rx-CP及INF1誘發(fā)的HR反應(yīng)。

3 討論

BABA能夠在馬鈴薯上誘導產(chǎn)生抗病性［16］，表明BABA具有在植物誘導抗病方面具有重要利用價值。在前人研究的基礎(chǔ)上，本研究克隆了一個BABA早期誘導表達E2泛素連接酶基因StUBC17，并對其受P. infestans誘導表達特性和對晚疫病抗性反應(yīng)中的功能進行了初探。

絕大多數(shù)植物防御反應(yīng)都涉及到泛素-蛋白酶體系統(tǒng)［17］。E2泛素結(jié)合酶是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中的重要組成部分，對泛素化修飾的特異性和精確時空性起關(guān)鍵作用［3］。研究表明，E2泛素結(jié)合酶廣泛參與植物對逆境脅迫的響應(yīng)途徑。如水稻48個E2泛素結(jié)合酶基因中，3個基因受干旱和鹽脅迫誘導上調(diào)表達，7個基因受干旱和鹽脅迫誘導下調(diào)表達，12個基因受植物激素6-BA和ABA誘導表達［18］。玉米75個E2泛素結(jié)合酶基因中，35個基因受鹽脅迫誘導表達，22個基因受PEG600誘導表達［19］。在擬南芥中超量表達大豆泛素結(jié)合酶GmUBC2基因，可以增強擬南芥耐寒和耐鹽性［20］。決登偉等［21］發(fā)現(xiàn)玉米泛素結(jié)合酶基因ZmUBC-76在鹽脅迫和干旱脅迫處理下，表達量下調(diào)。與這些報道類似，本研究證明馬鈴薯泛素結(jié)合酶StUBC17可以被生物脅迫因子P. infestans誘導表達。

圖3 沉默植株的NbUBC的相對表達量及抗性鑒定

圖4 沉默NbUBC不影響基因?qū)虻淖R別

由于VIGS技術(shù)［22］在馬鈴薯上尚不成熟，而馬鈴薯和本氏煙同為茄科作物，基因組高度保守，且VIGS技術(shù)在本氏煙中較成熟。為了快速、高通量鑒定目標基因?qū)︸R鈴薯抗晚疫病是否有貢獻，研究者大多先在本氏煙上利用VIGS技術(shù)對目標基因進行功能分析［23-24］。本研究利用VIGS技術(shù)初步鑒定NbUBC（StUBC17同源基因）對植物防御P.infestans有一定作用。沉默NbUBC后，沉默植株的抗病性明顯減弱。另外，在NbUBC沉默植株上瞬時表達馬鈴薯抗病基因-無毒基因組合（R3a+AVR3a、R3b+AVR3b和Rx+CP）及晚疫病菌PAMP基因INF1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗病基因-無毒基因組合及INF1激發(fā)的HR反應(yīng)并沒有被干擾。說明E2泛素結(jié)合酶基因NbUBC并不影響R3a、R3b、Rx及INF1介導的HR反應(yīng)。至于NbUBC是否影響其他抗病基因介導的HR反應(yīng)有待進一步研究。

4 結(jié)論

從馬鈴薯中克隆獲得泛素結(jié)合酶基因StUBC17，其受P. infestans誘導表達。該基因編碼蛋白及其同源蛋白間的泛素結(jié)合酶功能域高度保守。在本氏煙上沉默StUBC17同源基因?qū)е轮仓昕共⌒韵陆担页聊摶虿⒉挥绊戱R鈴薯抗病蛋白-無毒蛋白（R3a+AVR3a、R3b+AVR3b和Rx+CP）及晚疫病菌INF1介導的HR反應(yīng)。