高產(chǎn)聚蘋果酸黑色素短梗霉CGMCC18996全基因組組裝注釋及關(guān)鍵蛋白分析

王舸楠，李佳謙，李雨桐，陳世偉，王淑賢，趙廷彬，賈士儒，喬長(zhǎng)晟,,

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；3.天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心，天津 300457；4 .天津慧智百川生物工程有限公司，天津 300457）

聚蘋果酸（polymalic acid，PMLA）是以蘋果酸為唯一單體的均聚高分子聚合物，屬于聚酯類聚合物，具有高生物相容性、高水溶性、生物可吸收性、化學(xué)可衍生性、可降解性和無(wú)免疫原性等多種優(yōu)良性能[1]。PMLA分子的側(cè)鏈帶有可修飾性較強(qiáng)的羧基，一些分子能夠通過(guò)官能團(tuán)反應(yīng)引入其聚合鏈上，同時(shí)PMLA水解產(chǎn)生的蘋果酸是理想的調(diào)酸劑，這使PMLA在生物醫(yī)藥、食品和生物材料領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景[2-6]。

研究表明產(chǎn)黑色素短梗霉（Aureobasidium melanogenum）是一種具有較強(qiáng)產(chǎn)PMLA能力的類酵母真菌[4]，但目前對(duì)其PMLA生物合成研究并不透徹，對(duì)通路中關(guān)鍵酶的研究并不清晰。產(chǎn)量還有很大的提升空間[7]。同時(shí)，該菌基因組信息依舊較少，限制了該菌株的開(kāi)發(fā)利用。因此，對(duì)該菌種進(jìn)行基因組測(cè)序及組裝可為改造菌種，提高產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

目前，主流的基因測(cè)序分為兩種，單分子測(cè)序（如Pacbio三代測(cè)序平臺(tái)）和高通量測(cè)序（如二代Illumina平臺(tái)），其中單分子測(cè)序具有讀長(zhǎng)長(zhǎng)組裝結(jié)果好的特點(diǎn)，但其測(cè)序成本與錯(cuò)誤率較高；高通量測(cè)序采用雙端測(cè)序策略，結(jié)果兼?zhèn)滟|(zhì)量高、價(jià)格低的特點(diǎn)，但其測(cè)序長(zhǎng)度較短，組裝會(huì)產(chǎn)生較多的片段（contigs）。因此采用三代測(cè)序結(jié)果組裝再通過(guò)二代測(cè)序結(jié)果進(jìn)行糾錯(cuò)（基因組polish），能夠很大程度降低contigs數(shù)目同時(shí)保持基因組準(zhǔn)確率，在完成基因組組裝后，可通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果對(duì)基因組進(jìn)行結(jié)構(gòu)注釋，以同時(shí)獲得高質(zhì)量基因組注釋結(jié)果[8]。

本研究通過(guò)PacBio Sequel II及Illumina NovaSeq 6000測(cè)序平臺(tái)對(duì)高產(chǎn)PMLA產(chǎn)黑色素短梗霉基因組進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)不同組裝軟件對(duì)測(cè)序的下機(jī)文件進(jìn)行組裝及優(yōu)化；結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)注釋。之后對(duì)基因組注釋結(jié)果進(jìn)行不同數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋，同時(shí)分析PMLA合成關(guān)鍵蛋白。通過(guò)這種方法，期望得到適合于基因組分析以及后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的高質(zhì)量基因組，為產(chǎn)黑色素短梗霉的開(kāi)發(fā)利用提供一定生物信息學(xué)參考，并同時(shí)為其他類似物種的基因組組裝提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株黑色素短梗霉，已保存至中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（保藏號(hào)：CGMCC18996）；基因組提取試劑盒 湖南艾科瑞生物工程有限公司；乙腈（色譜純）北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸（均為色譜純）天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

UC7超薄切片機(jī) 德國(guó)Leica公司；LC-10高效液相色譜儀 日本島津公司；ZWYR-D2403恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智城分析儀器制造有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱 泰宏醫(yī)療器械有限公司；NanoDrop One超微量分光光度計(jì) 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組提取與測(cè)序

本實(shí)驗(yàn)的基因組提取、建庫(kù)以及測(cè)序委托諾禾致源科技股份有限公司（北京）完成，實(shí)驗(yàn)流程均按照諾禾致源公司測(cè)序方法進(jìn)行（https://www.novogene.com/novo/sd_cpjs_6.html，https://www.novogene.com/novo/ed_cpjs_2.html）。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

使用曙光云計(jì)算服務(wù)器（曙光信息產(chǎn)業(yè)股份有限公司）進(jìn)行生物信息學(xué)分析。最終得到相關(guān)的測(cè)序下機(jī)文件以及組裝的基因組文件已上傳至國(guó)家生物信息中心（項(xiàng)目號(hào)：PRJCA011444）。

1.3.2.1 原始下機(jī)文件獲取及質(zhì)控

通過(guò)Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)獲取高通量測(cè)序產(chǎn)生的fastq基因組測(cè)序文件，通過(guò)PacBio Sequel II測(cè)序平臺(tái)獲取單分子測(cè)序產(chǎn)生的bam基因組測(cè)序文件，同時(shí)驗(yàn)證高通量測(cè)序和單分子測(cè)序文件的md5值與平臺(tái)提供是否一致。

1.3.2.2 基因組組裝及評(píng)估

使用SPAdes-3.15.5[9]組裝軟件對(duì)二代測(cè)序clean reads進(jìn)行組裝，為了得到最優(yōu)N50及L50值，將k-mer大小設(shè)定為77、87、97、107、117及127進(jìn)行組裝。并通過(guò)QUAST[10]軟件對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。三代測(cè)序通過(guò)Flye[11]、Canu[12]、NextDenovo（https://github.com/Nextomics/NextDenovo）以及MECAT2[13]組裝軟件進(jìn)行組裝，通過(guò)quickmerge[14]將最優(yōu)結(jié)構(gòu)與其他組裝結(jié)果進(jìn)行融合，之后對(duì)得到的融合后結(jié)果進(jìn)行去重復(fù)處理進(jìn)一步降低contigs數(shù)目。

1.3.2.3 基因組注釋

使用BRAKER2[15]軟件進(jìn)行基因組注釋，首先通過(guò)HISAT2將轉(zhuǎn)錄組序列比對(duì)到基因組上，生成bam文件，再將生成的bam文件與基因組文件作為輸入?yún)?shù)使用BRAKER2進(jìn)行注釋。將獲得的氨基酸序列通過(guò)InterProScan[16]與eggNOG-mapper[17]進(jìn)行注釋得到UniProtKB AC/ID（基因名），將這些基因名進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）（https://www.kegg.jp/kegg/）、基因本體論（Gene Ontology，GO）[18]及直系同源集（Clusters of Orthologous Groups，COG）[19]數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，并通過(guò)antiSMASH[20]對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3.3 菌體形態(tài)

透射電鏡拍攝方法如下，將電子顯微鏡固定劑（2.5%戊二醛溶于磷酸緩沖液）添加到經(jīng)離心分離的菌株中，重懸菌體，使用 0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3 次，1%鋨酸固定液固定1 h；之后使用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3 次，丙酮脫水3 次。使用純EMBed 812樹(shù)脂（90529-77-4）包埋，移入65 ℃烘箱中聚合48 h；使用超薄切片機(jī)切至60～80 nm薄片，用2%乙酸鈾飽和醇溶液和檸檬酸鉛染色15 min。最后，使用JEM1200電鏡進(jìn)行觀察拍攝，得到放大4000 倍的產(chǎn)黑色素短梗霉CGMCC18996圖像。

1.3.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用Alphafold2-2.2.0[21]，將基因組注釋的氨基酸序列作為輸入?yún)?shù)，運(yùn)行模式參數(shù)選擇monomer，其余均選用默認(rèn)選項(xiàng)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，最終在生成文件中選擇最優(yōu)結(jié)果（即rank0結(jié)果）。之后將蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Data Bank，PDB）[22]中已上傳的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PCKA）：1YLH[23]；蘋果酸合成酶（malate synthase，MASY）：3CUZ[24]）。

2 結(jié)果與分析

2.1 通過(guò)二代測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組預(yù)組裝

基于Illumina NovaSeq 6000測(cè)序平臺(tái)對(duì)產(chǎn)黑色素短梗霉基因組進(jìn)行測(cè)序，共得到35.85 Gb×2的雙端測(cè)序結(jié)果。且該測(cè)序平臺(tái)得到的raw reads具有較高的質(zhì)量評(píng)分（Q＞35）。之后，選取質(zhì)控后clean reads進(jìn)行后續(xù)的組裝實(shí)驗(yàn)。

不同k-mer長(zhǎng)度對(duì)產(chǎn)黑色素短梗霉clean reads進(jìn)行組裝結(jié)果見(jiàn)表1，組裝結(jié)果顯示，產(chǎn)黑色素短梗霉基因組大小約為44 Mb。其中，在k-mer長(zhǎng)度為127時(shí)得到N50值為908694，L50值為14，基因組覆蓋度為121.2×?；谠摻Y(jié)果可以判斷該菌基因組長(zhǎng)度理論值在44 Mb左右；且隨著k-mer長(zhǎng)度的增加，N50值增大，L50值減??；若繼續(xù)增大k-mer值會(huì)進(jìn)一步優(yōu)化組裝參數(shù)。但由于SPAdes軟件進(jìn)行組裝的k-mer值最大為127，這可能是考慮到繼續(xù)加大k-mer值對(duì)測(cè)序深度要求較高，從而提高測(cè)序成本。

2.2 三代測(cè)序組裝結(jié)果及基因組結(jié)構(gòu)注釋

基于PacBio平臺(tái)的單分子測(cè)序共產(chǎn)生46 Gb大小的bam基因組測(cè)序文件，轉(zhuǎn)換為fasta文件后，根據(jù)二代組裝結(jié)果設(shè)置基因組大小為44 Mb進(jìn)行組裝。各組裝軟件組裝結(jié)果如表2所示，其中，選用Canu組裝的最優(yōu)結(jié)果通過(guò)quickmerge軟件與其他組裝結(jié)果進(jìn)行融合，并結(jié)合二代測(cè)序文件進(jìn)行基因組糾正（polish），在刪除重復(fù)contigs后的最終組裝結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 三代組裝結(jié)果Table 2 Results of third-generation assembly

表3 產(chǎn)黑色素短梗霉基因組裝結(jié)果Table 3 Results of genome assembly of A.melanogenum

結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文件進(jìn)行基因組結(jié)構(gòu)注釋共注釋出15684 個(gè)基因，并找到基因編碼區(qū)與氨基酸預(yù)測(cè)區(qū)，因結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文件進(jìn)行結(jié)構(gòu)注釋，這些基因可能包含有可變剪切和重復(fù)注釋的結(jié)構(gòu)，會(huì)增加注釋出的基因數(shù)目。因此，進(jìn)行功能注釋和基因名稱注釋后需刪除重復(fù)的基因名；最終，共獲得6202 個(gè)基因注釋結(jié)果。

2.3 GO、KEGG、COG以及antiSMASH次級(jí)代謝注釋結(jié)果

對(duì)注釋出的6202 個(gè)基因進(jìn)行GO、KEGG與COG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，結(jié)果如圖1所示。其中，COG注釋結(jié)果顯示大部分基因與碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝、轉(zhuǎn)錄后修飾、RNA加工及修飾有關(guān)。KEGG注釋結(jié)果顯示大部分基因所處代謝通路與核糖體、過(guò)氧化物體、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。GO注釋結(jié)果顯示大部分基因與RNA、過(guò)氧化物體以及線粒體有關(guān)。最終，antiSMASH次級(jí)代謝物預(yù)測(cè)結(jié)果共發(fā)現(xiàn)4 個(gè)非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase，NRPS）基因簇、5 個(gè)一類聚酮合酶（polyketide synthetase，pks）基因簇、3 個(gè)β-內(nèi)酯類合成基因簇以及7 個(gè)萜類合成基因簇，其中1 個(gè)一類pks基因簇和黑色素合成有關(guān)（相關(guān)性100%），1 個(gè)一類pks基因簇與黑麥酮酸類化合物合成有關(guān)（相關(guān)性18%）。

圖1 COG（a）、KEGG（b）、GO（c）數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果Fig.1 Results of annotation in the COG (a),KEGG (b),and GO (c) database

2.4 產(chǎn)黑色素短梗霉菌體透射電鏡結(jié)果

如圖2所示，在低產(chǎn)組中菌株具有較大細(xì)胞核（N）以及周圍存在的具有雙層膜結(jié)構(gòu)線粒體（M），在高產(chǎn)組中出現(xiàn)了類似乙醛酸循環(huán)體的圓形結(jié)構(gòu)，提示黑色素短梗霉中可能存在有乙醛酸循環(huán)途徑。

圖2 產(chǎn)黑色素短梗霉PMLA低產(chǎn)組（a、c）及PMLA高產(chǎn)組（b、d）透射電鏡結(jié)果Fig.2 TEM results of low-and high-PMLA producing A.melanogenum

2.5 PMLA合成相關(guān)基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

在對(duì)基因結(jié)構(gòu)與基因名注釋后，找到PCKA、MASY的蛋白質(zhì)序列，其晶體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖3、4所示，其中，PCKA、MASY與PDB上傳晶體結(jié)構(gòu)（PCKA：1YLH[23]，MASY：3CUZ[24]）進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示預(yù)測(cè)的蛋白結(jié)構(gòu)與PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中序列比對(duì)結(jié)果基本一致，氨基酸比對(duì)結(jié)果中序列與其晶體結(jié)構(gòu)中小分子配體的結(jié)合位點(diǎn)也具有較高的一致性。同時(shí)蛋白的保守作用位點(diǎn)如PCKA中86R、140V、146G、287G、288D、289D，MASY中440C、275C、276G、277R、278W在比對(duì)結(jié)果中一致。

圖3 Alphafold對(duì)PCKA預(yù)測(cè)結(jié)果（a）及與PDB中已上傳晶體結(jié)構(gòu)的比對(duì)（b）和序列對(duì)比結(jié)果（c）Fig.3 Results of PCKA prediction by Alphafold software (a),crystal structure of PCKA versus that in PDB database (b),and amino acid alignment results (c)

圖4 Alphafold對(duì)MASY預(yù)測(cè)結(jié)果（a）及與PDB中已上傳晶體結(jié)構(gòu)的比對(duì)（b）和序列對(duì)比結(jié)果（c）Fig.4 Results of MASY prediction by Alphafold software (a),crystal structure of MASY versus that in PDB database (b),and amino acid alignment results (c)

3 討論

結(jié)合基因組及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可以組裝并注釋出質(zhì)量較高的基因組。本研究通過(guò)三代測(cè)序（Pacbio sequel II平臺(tái)）、二代測(cè)序（Illumina NovaSeq 6000）平臺(tái)對(duì)產(chǎn)黑色素短梗霉基因組進(jìn)行測(cè)序，因三代組裝需要預(yù)估基因組大小，因此，首先通過(guò)二代數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組預(yù)組裝共得到44 Mbp基因組大小。之后考察了不同組裝軟件對(duì)產(chǎn)黑色素短梗霉基因組的組裝效果，在一般的默認(rèn)選項(xiàng)下，Canu軟件得到了較好的組裝效果。對(duì)該組裝結(jié)果通過(guò)二代數(shù)據(jù)修正并去重后得到包含26 個(gè)contigs、N50為2204220、GC值為50.09%、大小為42 Mb的較高質(zhì)量基因組組裝結(jié)果。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)該組裝結(jié)果進(jìn)行結(jié)構(gòu)注釋，共找到6202 個(gè)基因。產(chǎn)黑色短梗霉屬于出芽短梗霉的亞種，其在不同環(huán)境中也會(huì)呈現(xiàn)出酵母狀與菌絲體狀的不同形態(tài)[25]。將基因組組裝與注釋結(jié)果與酵母和絲狀真菌的模式生物基因組進(jìn)行比較；其中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）基因組大小為12.15 Mb，編碼6016 個(gè)蛋白，GC含量為38.15%[26]；構(gòu)巢曲霉基因組大小為30.30 Mb，編碼10008 個(gè)蛋白，GC含量為50.10%[27]。因此，產(chǎn)黑色素短梗霉基因組組成更偏向構(gòu)巢曲霉，且本實(shí)驗(yàn)室先前通過(guò)無(wú)參轉(zhuǎn)錄組注釋發(fā)現(xiàn)很多與構(gòu)巢曲霉同源的基因[28]。因構(gòu)巢曲霉是絲狀真菌的模式生物，該結(jié)果提示產(chǎn)黑色素短梗霉可能同樣適用構(gòu)巢曲霉的分子轉(zhuǎn)化方法。

本研究通過(guò)Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)對(duì)產(chǎn)黑色素短梗霉進(jìn)行了大約35 GB下機(jī)文件大小的高通量測(cè)序，該測(cè)序量的測(cè)序深度較大，理論測(cè)序深度為1000×。通過(guò)二代組裝軟件進(jìn)行組裝后，最終組裝出N50值為908694的基因組，該結(jié)果僅達(dá)到三代測(cè)序組裝結(jié)果N50的41.4%，因此，考慮到組裝結(jié)果以及建庫(kù)與測(cè)序成本[29]，三代測(cè)序進(jìn)行組裝輔以二代測(cè)序進(jìn)行基因組修正的測(cè)序方法更具有性價(jià)比。

通過(guò)COG、KEGG與GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果表明，產(chǎn)黑色素短梗霉中基因表達(dá)主要位于核糖體、線粒體以及過(guò)氧化物體等細(xì)胞器中，其中，有研究表明線粒體中的三羧酸循環(huán)、乙醛酸循環(huán)體中的乙醛酸循環(huán)以及細(xì)胞質(zhì)中的還原性三羧酸途徑與PMLA的生物合成有關(guān)[7,30-31]。功能注釋結(jié)果中出現(xiàn)了大量與過(guò)氧化物體有關(guān)的基因，而能夠產(chǎn)生蘋果酸的乙醛酸循環(huán)體也屬于一類過(guò)氧化物體。因此，該結(jié)果說(shuō)明在產(chǎn)黑色素短梗霉中可能存在乙醛酸循環(huán)體。實(shí)驗(yàn)室先前研究發(fā)現(xiàn)乙醛酸體中的MASY可通過(guò)乙醛酸途徑生成蘋果酸，相比于線粒體中存在的蘋果酸/天冬氨酸穿梭體系，乙醛酸循環(huán)體中蘋果酸可能可以直接通過(guò)單層乙醛酸體膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中而被非核糖體肽合成酶（non-ribosomal peptide synthase，NRPS）聚合成PMLA[28]。透射電鏡結(jié)果也顯示，在加入CaCO3的高產(chǎn)PMLA組中，菌體內(nèi)部出現(xiàn)了較多的圓形細(xì)胞器，提示菌體中存在乙醛酸循環(huán)體的可能。antiSMASH注釋結(jié)果表明在產(chǎn)黑色素短梗霉中存在4 個(gè)NRPS基因簇，該結(jié)果也同樣反映出NRPS蛋白聚合蘋果酸形成PMLA的可能性。同時(shí)，注釋出的與黑色素合成的pks基因簇可解釋該菌種在生長(zhǎng)過(guò)程中逐漸變黑的現(xiàn)象。

實(shí)驗(yàn)室先前研究表明[28]，PCKA、MASY和NRPS基因在PMLA高產(chǎn)組中發(fā)生了較大幅度的上調(diào)。因此，通過(guò)對(duì)基因組注釋得到的PCKA和MASY的編碼區(qū)進(jìn)行了蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并將預(yù)測(cè)結(jié)果與PDB上已有的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)。比對(duì)結(jié)果表明，蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果與已有晶體結(jié)構(gòu)基本吻合，且保守結(jié)構(gòu)域相似，提示預(yù)測(cè)蛋白與其他菌株中已存在蛋白可能具有相似的功能。PCKA是糖異生途徑的限速酶，一般情況下催化草酰乙酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸，但有研究表明PCKA在真菌細(xì)胞質(zhì)中可反向催化磷酸烯醇式丙酮酸生成草酰乙酸[23]。而細(xì)胞質(zhì)中的草酰乙酸會(huì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為PMLA的前體物質(zhì)蘋果酸。MASY可催化乙醛酸循環(huán)中的第二部反應(yīng)，將乙醛酸轉(zhuǎn)化為蘋果酸[24]，而乙醛酸體的單層膜結(jié)構(gòu)可能使蘋果酸被動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而被細(xì)胞質(zhì)中存在的NRPS蛋白聚合成為PMLA[28]。本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有對(duì)NRPS蛋白預(yù)測(cè)的原因是因?yàn)槠浒被嵝蛄休^長(zhǎng)（5000 aa左右），軟件無(wú)法預(yù)測(cè)，其次是在PDB上還沒(méi)有找到近似的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，比對(duì)較為困難。

本研究對(duì)產(chǎn)黑色素短梗霉進(jìn)行二代、三代基因組測(cè)序并組裝得到最優(yōu)組裝結(jié)果，后通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)基因組進(jìn)行結(jié)構(gòu)注釋，將得到的結(jié)構(gòu)注釋結(jié)果進(jìn)行不同數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋。同時(shí)對(duì)產(chǎn)黑色素短梗霉進(jìn)行了透射電鏡拍攝，電鏡結(jié)果提示菌株中存在乙醛酸循環(huán)體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可能與PMLA合成有關(guān)，最終，實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)PMLA合成相關(guān)的PCKA和MASY蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)并與PDB上已有電鏡結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黑色素短梗霉中這兩種蛋白與PDB上已有晶體結(jié)構(gòu)基本一致，且這兩種蛋白功能最終都與蘋果酸代謝有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為產(chǎn)黑色短梗霉菌株的PMLA代謝提供一定的參考，相關(guān)的測(cè)序下機(jī)文件以及組裝的基因組文件已上傳至國(guó)家生物信息中心（PRJCA011444），為后續(xù)的菌株開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)。