端粒生物學(xué)異常性疾病的肝臟表現(xiàn)

陳宇星 劉夢 楊玄子 于樂成

1例特殊臨床案例，51歲白人男性接受食管胃底靜脈曲張出血評估，主要的實驗室檢查異常是血小板輕度減少和堿性磷酸酶中度升高，而肝臟合成能力完好。腹部計算機斷層掃描顯示脾臟中度腫大，胃底靜脈曲張，而肝臟外形正常。經(jīng)頸靜脈肝活檢顯示肝臟結(jié)節(jié)性再生性增生(NRH)，無明顯肝纖維化或壞死性炎癥活動。肝靜脈壓力梯度(HVPG)高達31 mmHg，與臨床顯著的門靜脈高壓一致。并發(fā)難治性胃靜脈曲張破裂出血，需要外科門體分流手術(shù)。首次發(fā)病約7年后，患者出現(xiàn)進行性呼吸困難，診斷為特發(fā)性肺纖維化(IPF)。對比增強超聲心動圖不支持肝肺綜合征(HPS)或門脈性肺動脈高壓。鑒于新診斷，懷疑是端粒生物學(xué)異常性疾病(TBD)。應(yīng)用流式-熒光原位雜交(Flow-FISH)評估端粒長度，發(fā)現(xiàn)淋巴細胞和粒細胞的端粒長度均低于第1個百分位數(shù)。二代測序分析發(fā)現(xiàn)了涉及hTERT基因(組氨酸H 983蘇氨酸T)的雜合突變。肺病在其后2年里不斷進展，導(dǎo)致患者在首次出現(xiàn)門靜脈高壓9年后死亡。兩兄弟也在這9年內(nèi)患上了IPF。

一、TBD

端粒是位于線性染色體末端的DNA重復(fù)序列，與被稱為端粒蛋白復(fù)合體(shelterin complex)的特殊蛋白結(jié)合，有助于維持染色體的完整性和穩(wěn)定性(圖1)。端粒酶可合成DNA的多個串聯(lián)重復(fù)序列(端粒DNA)。端粒酶由兩個核心部分組成，即端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)和端粒酶RNA(telomerase RNA)。端?？s短是隨著年齡增長而普遍存在的現(xiàn)象，與年齡相關(guān)的病理學(xué)有關(guān)。“端粒維持”對于減緩伴隨每次細胞分裂和隨后的細胞過早老化而發(fā)生的“端?？s短”至關(guān)重要[1]。

TBD是一種加速老化綜合征，由縮短的端粒遺傳基因突變所致。因此，骨髓、皮膚、肺和胃腸道等細胞周轉(zhuǎn)(turnover)相對活躍的器官系統(tǒng)較易受到影響，其病變可單獨或聯(lián)合出現(xiàn)。由于潛在的臨床表征范圍廣泛，因此TBD常難以識別和診斷。骨髓衰竭、過早發(fā)生的肺氣腫、IPF、NRH和隱源性肝硬化是較常見的臨床表現(xiàn)。角化不良蛋白(dyskerin，DKC1)、TERT和端粒酶RNA組分(TERC)的突變是常見的導(dǎo)致畸變的因素[1]。

端粒由線性染色體末端的多個TTAGGG重復(fù)序列組成，被端粒蛋白質(zhì)復(fù)合體(shelterin)包被，有助于維持其完整性。端粒蛋白復(fù)合體還有助于募集和調(diào)節(jié)端粒酶復(fù)合物，后者是負責(zé)端粒延長的酶。端粒酶有4個蛋白支架，即角化不良蛋白、NOP10、NHP2和GAR，此外還有RNA模板(TERC)和逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)。經(jīng)惠許改編自Townsley等[2]。

二、TBD的肝臟表現(xiàn)

TBD的肝臟表現(xiàn)包括隱源性肝硬化和NRH導(dǎo)致的非硬化性門靜脈高壓癥。對于隱源性肝硬化或特發(fā)性門靜脈高壓癥患者應(yīng)疑及TBD，特別是有原因不明血細胞減少的個人史或家族史、頭發(fā)早白(<30歲)或IPF/肺氣腫，以及40歲以下的患者。由于端粒縮短導(dǎo)致染色體不穩(wěn)，TBD也可能在肝癌的發(fā)生機制中起某種作用。但相反的是，在半數(shù)肝細胞癌(HCC)病例中觀察到端粒延長和端粒酶高活性，這與低分化腫瘤相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)提示端粒功能障礙在腫瘤發(fā)生和進展中具有雙重作用，TBD對肝硬化相關(guān)HCC的影響有待進一步研究闡明[1]。

(一)隱源性肝硬化

盡管肝硬化的病因診斷在過去的幾十年有了顯著進展，但仍有約5%～30%的肝硬化病例難以明確病因。據(jù)報道，約7%的先天性角化不良合并隱源性肝硬化。此外，對于肺和肝等慢周轉(zhuǎn)(slow-turnover)的組織器官而言，TBD通常表現(xiàn)為在成人期發(fā)病的纖維化疾病。與先天性角化不良相反，TBD相關(guān)隱源性肝硬化的平均年齡為37歲(20～57歲)。除了潛在的直接作用，繼發(fā)于端粒酶基因突變的端?？s短也能增加患有不同病因的慢性肝病患者進展為肝硬化的風(fēng)險。兩項大型獨立研究發(fā)現(xiàn)，與非硬化組相比，病因明確的散發(fā)性肝硬化患者的端粒相關(guān)突變發(fā)生率更高[3-4]。此外，采用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)檢測顯示，肝硬化患者白細胞端粒平均長度顯著短于年齡匹配的對照組(0.114對0.001)。80%以上的肝硬化患者的端粒長度低于同齡人群端粒長度的平均數(shù)。這些發(fā)現(xiàn)表明，即使是潛在性慢性肝病患者，端粒縮短也可能在肝硬化的發(fā)生和/或發(fā)展中扮演某種作用。

圖1 端粒維持的組成

TBD相關(guān)性肝硬化的發(fā)病機制尚不清楚。通過定量熒光原位雜交(Q-FISH)分析，發(fā)現(xiàn)端?？s短僅限于肝細胞，并且與細胞衰老標(biāo)記物相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)提示肝臟再生受損，進而導(dǎo)致纖維化的發(fā)生和發(fā)展。這種假設(shè)在端粒酶缺陷型小鼠模型中得到進一步證實，該模型缺乏必需的端粒酶RNA(mTR)基因，觀察到其肝臟再生缺陷和慢性損傷引起的纖維化加速進展。更有趣的是，通過腺病毒載體遞送mTR基因以恢復(fù)端粒功能，可使肝纖維化減清和肝功能改善。這些結(jié)果表明端粒靶向性治療在預(yù)防和逆轉(zhuǎn)TBD相關(guān)性肝硬化中可以起到某種作用。

(二)結(jié)節(jié)再生性增生(NRH)

NRH的特征是彌漫性再生性肝小結(jié)節(jié)，其周圍無纖維化。盡管已知涉及肝臟血流改變，但NRH的發(fā)病機制仍不清楚。多種全身性病癥和藥物治療與NRH相關(guān)(表1)，而門靜脈閉塞被認為是導(dǎo)致結(jié)節(jié)性肝實質(zhì)增生的共同潛在機制。然而，該理論受到一種動物模型的挑戰(zhàn)，該模型通過破壞Notch1信號誘導(dǎo)NRH。對成年小鼠誘導(dǎo)Notch1破壞，可致其肝細胞持續(xù)增殖和隨后的NRH形態(tài)學(xué)改變，但肝臟中無血管改變。已發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮Notch1信號傳導(dǎo)對于肝臟血管的形成和功能是必需的[5]。有人對14例NRH患者的肝活檢組織檢查發(fā)現(xiàn)Notch1表達顯著下降[6]。另外，已報道門靜脈硬化和NRH與亞當(dāng)斯-奧利弗綜合征(Adams-Oliver syndrome，AOS)相關(guān)，AOS是由Notch1單倍型不足引起的罕見遺傳疾病。

一項大型尸檢研究顯示，NRH的流行隨年齡增長而增加，這提示NRH的發(fā)病具有年齡依賴性機制。端?？s短被認為能促進與年齡相關(guān)的疾病，并且已報道多例NRH與導(dǎo)致端粒嚴(yán)重縮短的端粒相關(guān)突變有關(guān)[7]。有趣的是，最近報道了一種Notch1單倍型不足的鼠模型，僅在端粒縮短時出現(xiàn)感興趣的疾病，并且Notch1突變體疾病的嚴(yán)重程度與端粒長度呈反相關(guān)[1]。

此外，先前與再生障礙性貧血和IPF相關(guān)的NRH系列病例可能代表了未被識別的TBD病例。在散發(fā)性和孤立性NRH病例中，端?？s短的流行情況尚不清楚。

1. NRH的臨床表現(xiàn)和診斷

雖然報道的NRH流行率很低，但由于頻繁誤診，其可能被低估了。在早期階段，NRH患者通常無癥狀，直到臨床上出現(xiàn)明顯門靜脈高壓癥。常出現(xiàn)脾臟腫大和胃食管靜脈曲張破裂出血。HPS是非硬化性門靜脈高壓癥的另一種可能并發(fā)癥，在這類人群中發(fā)病率為10%。盡管肺纖維化和肺氣腫是TBD最常見的肺部表現(xiàn)，但在最近的大型系列病例報道中，與NRH相關(guān)的HPS占20%[7]。

NRH在放射影像檢查方面很難與肝硬化區(qū)分，可能的表現(xiàn)包括肝臟表面結(jié)節(jié)和肝實質(zhì)非均質(zhì)性改變。因此，NRH的明確診斷只能依賴肝組織學(xué)檢查。但病理學(xué)家經(jīng)驗不一，也可能錯過NRH診斷。即使在經(jīng)驗豐富的肝臟病理學(xué)家，對NRH的組織病理學(xué)診斷也存在很大的觀察者之間的差異[8]。經(jīng)常需要對肝組織進行網(wǎng)狀蛋白染色以使這些差異得到更明確的顯示。

表1 短端粒相關(guān)基因和表型[1]

注：AD,常染色體顯性遺傳；AR,常染色體隱性遺傳；NRH，結(jié)節(jié)再生性增生

2. NRH的自然史和治療

臨床確診的NRH病例偏向于有嚴(yán)重癥狀，更多病例被頻繁誤診，這使得NRH的長期預(yù)后尚難確定。肝移植后病肝病理學(xué)研究表明，肝移植前有高達80%的NRH病例在臨床和(或)放射影像學(xué)上被誤診為肝硬化[1]。肝功能衰竭在這一人群中很少見，與門靜脈高壓相關(guān)的并發(fā)癥如靜脈曲張破裂出血和利尿劑難治性腹水是最常見的肝移植指征。在非硬化性門靜脈高壓癥患者，不進行肝移植的預(yù)期存活率很高，10年后約為80%[9]。但另一研究顯示，與普通人群相比，這類患者的長期總病死率增加，主要死因是相關(guān)的醫(yī)療條件而非肝臟相關(guān)的并發(fā)癥。約翰霍普金斯醫(yī)院報道顯示，在確診TBD的背景下出現(xiàn)NRH和HPS的6例患者，從確診至死亡的時間平均為6年(4～10年[7])。這組患者較為年輕(平均25歲)，伴進行性呼吸道癥狀和門靜脈高壓癥，后來發(fā)展為肺纖維化和難治性腹水。因此，TBD相關(guān)性NRH可能比其他病因引起的NRH長期結(jié)果差。

目前沒有可用于預(yù)防或治療NRH或非肝硬化性門靜脈高壓的藥物，主要針對潛在的病癥和門靜脈高壓相關(guān)的并發(fā)癥進行治療。臨床前模型的缺乏和對本病病理生理學(xué)認識的不足阻礙了非硬化性門靜脈高壓癥新藥的研發(fā)。已提出NRH是肝臟微血管血流改變的結(jié)果，因此血管調(diào)節(jié)療法可能具有潛在益處。重組人源化單克隆血管內(nèi)皮生長因子抗體貝伐單抗(Bevacizumab)已被證明可預(yù)防轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者出現(xiàn)繼發(fā)于奧沙利鉑的NRH，貝伐單抗治療組和非治療組NRH的發(fā)生率分別為11.4%和28.9%。貝伐單抗還可阻止遺傳性出血性毛細血管擴張癥的肝血管畸形和門靜脈高壓癥的進展[1]。

除NRH外，TBD患者還存在多種其他血管并發(fā)癥的風(fēng)險，包括胃竇血管擴張癥、胃腸道和肺部動靜脈畸形，以及滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變。后者的特征是伴有微動脈瘤樣改變、毛細血管擴張和末梢區(qū)域無灌注的視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)改變[10]。玻璃體內(nèi)應(yīng)用貝伐單抗已常規(guī)用于視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜血管性疾病，包括滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變的治療。貝伐單抗能否用于預(yù)防或治療TBD患者的NRH和其他血管并發(fā)癥仍有待探索。

少部分繼發(fā)于NRH的嚴(yán)重門靜脈高壓癥患者需要肝移植。對17項研究的系統(tǒng)評價顯示，NRH潛在肝移植指征包括嚴(yán)重的胃食管出血、腹水、肝性腦病和肝衰竭。肝移植患者和移植肝的5年存活率達到78.3%，令人滿意。但TBD患者的肝移植結(jié)果尚不清楚。目前僅報道1例TBD成年患者接受肝移植[11]。該患者在隱源性肝硬化的基礎(chǔ)上出現(xiàn)進展性HPS，此外還被診斷為間質(zhì)性肺病(ILD)和骨髓移植后骨髓衰竭?；铙w肝移植后12個月，患者癥狀顯著改善。隨訪22個月未發(fā)現(xiàn)ILD進展或惡性腫瘤。但尚需更多研究和更長時間的隨訪來證實這些發(fā)現(xiàn)。

三、TBD的診斷

有幾種方法可用于測量端粒長度，包括：流式-熒光原位雜交(Flow-FISH)、定量-熒光原位雜交(Q-FISH)、實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)或基于qPCR的技術(shù)(包括單細胞端粒長度測定)、光學(xué)技術(shù)(表面增強拉曼散射)、雜交保護分析法和端粒限制性片段(TRF)長度分析[1]。盡管尚無一種技術(shù)可適用于所有的臨床和研究場景，但TRF長度分析被認為是“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，這主要是因為其簡單性和準(zhǔn)確性。然而，由于TRF長度分析需要大量的DNA，因此難以廣泛應(yīng)用。基于qPCR的方法雖然成本低廉，但因?qū)嶒炇抑g的檢測差異較大而應(yīng)用受限。

Flow-FISH分析非常準(zhǔn)確，使其成為臨床實踐中評估端粒長度的首選技術(shù)。Flow-FISH以熒光探針標(biāo)記端粒，從而允許應(yīng)用基于流式細胞術(shù)的方法對不同細胞群(例如粒細胞和淋巴細胞)的端粒熒光進行評估。Flow-FISH報道提供了相對于年齡的端粒長度，這很重要，因為端粒損耗是正常老化過程的一部分(圖2)。圖2A顯示一位正常病例淋巴細胞和粒細胞的端粒長度在第50百分位標(biāo)記處，亦即約與50%的相同年齡正常人群的端粒長度相似。圖2B顯示某例患者的端粒長度明顯縮短，小于第1百分位數(shù)。

A．顯示一位正常病例淋巴細胞和粒細胞在第50百分位標(biāo)記處的端粒長度(與約50%的相同年齡正常人群的端粒長度相似)。B．顯示一例患者的端粒長度小于第1百分位數(shù)(與所報道的TBD患者的端粒長度相似)。FISH：熒光原位雜交；TBD：端粒生物學(xué)異常性疾病

圖2應(yīng)用Flow-FISH分析端粒長度[1]

端粒相關(guān)基因突變分析 多個基因與端?？s短相關(guān)，根據(jù)其在端粒生物學(xué)中的正常生理作用進行亞分類。遺傳方式通常是X-連鎖隱性遺傳、常染色體顯性遺傳和常染色體隱性遺傳。與端粒酶生物發(fā)生相關(guān)的基因包括DKC1。端粒核心組成基因包括hTERT、TRRC，而TCAB1(WRAP53)參與端粒酶運輸。TINF2、ACD(編碼TPP1)是端粒蛋白復(fù)合體的一部分。在先天性角化不良中，原型TBD的特征是花邊皮疹，毛發(fā)和指甲營養(yǎng)不良，口腔黏膜白斑和骨髓衰竭；DKC1是一種參與端粒酶生物合成的、X-連鎖隱性基因，其突變是最常見的基因組畸變。其他TBD相關(guān)突變，包括hTERT、TERC和TINF2，以常染色體顯性遺傳方式遺傳；而常染色體隱性突變包括NOP10、NHP2和TCAB1(表1)。hTERT和TERC的突變已見諸于再生障礙性貧血、IPF、隱源性肝硬化和NRH的病例報道中(表2)。

表2 文獻報道的端粒TBD相關(guān)肝病的端粒酶突變[1]

多種靶向外顯子組或二代測序組可用于檢測臨床高度懷疑TBD的患者的潛在致病突變(圖3)。無論采用何種方法，只能在約40%的TBD病例中發(fā)現(xiàn)潛在的致病突變，這提示有多種尚未發(fā)現(xiàn)的基因組和表觀遺傳學(xué)的改變導(dǎo)致了端粒長度的縮短。

圖3 TBD相關(guān)肝病的建議評估流程[1]

四、TBD潛在的治療選擇

多年來，在再生障礙性貧血和骨髓衰竭狀態(tài)(包括骨髓增生異常綜合征和骨髓增殖性腫瘤)的患者中試用雄激素治療取得了一定的成功。體外和體內(nèi)研究顯示雄激素可增加端粒酶基因的表達和活性[1]。

2006年，Townsley等報道了一項I/II期臨床試驗結(jié)果，研究對象為年齡調(diào)整的端粒長度小于第1個百分位數(shù)或有骨髓衰竭、肺纖維化或兩者兼而有之的TBD突變患者27例，口服達那唑800 mg/d。9例患者(33%)有肝硬化，其中6例有臨床表現(xiàn)，3例在篩查時獲得診斷。使用達那唑12個月后，12/27(44%)的患者端粒長度損耗有所緩解，不良反應(yīng)包括氨基轉(zhuǎn)移酶升高(41%)、肌肉痙攣(33%)、水腫(26%)和血脂異常(26%)[8]。4例肝硬化患者在基線和24個月時接受肝臟瞬時彈性成像檢查，其中3例顯示肝纖維化顯著消退，第4例有肝硬化進展，但可能與持續(xù)過量飲酒有關(guān)。該研究使用qPCR技術(shù)測量端粒長度，顯示達那唑具有減少端粒長度損耗的功能，可能是通過增加端粒酶活性。這一發(fā)現(xiàn)尚未得到充分證實，且qPCR技術(shù)不夠準(zhǔn)確。

2014年Khincha等研究顯示[12]，4例對雄激素治療有應(yīng)答的先天性角化不良患者，在基線和雄激素平均治療2.6年時應(yīng)用更為敏感的Flow-FISH技術(shù)評估淋巴細胞端粒長度，結(jié)果顯示端粒長度在雄激素治療后維持穩(wěn)定或有所縮短；而5例未應(yīng)用雄激素治療的患者，端粒長度均隨時間延長而縮短。

在肝病患者，使用雄激素治療的主要問題是有發(fā)生藥物性肝損傷(DILI)以及加劇液體潴留和電解質(zhì)異常的風(fēng)險。此外，雄激素對前列腺有刺激作用，所以應(yīng)用于有前列腺肥大或前列腺腺癌病史的患者必須謹慎。

由于潛在的DILI風(fēng)險，雄激素類藥物尚未在晚期肝病患者中廣泛研究。有一項系統(tǒng)回顧分析納入5項雄激素類藥物治療酒精性肝炎或肝硬化的隨機對照試驗[13]，涉及氧甲氫龍(oxandrolone)、免微?；G酮(micronized-free testosterone)、丙酸睪酮(testosterone propionate)或美替諾龍庚酸酯(methenolone enanthate)，結(jié)果顯示對病死率、肝病相關(guān)并發(fā)癥和肝組織學(xué)無明顯影響。嚴(yán)重不良事件包括紅細胞增多癥、門靜脈或肝靜脈血栓形成、心肌梗死等，發(fā)生率為4.6%，而安慰劑對照組為0.9%。

新近一項隨機對照試驗評估了睪酮對伴有肌肉減少癥和低睪酮水平的男性肝硬化患者的益處[14]。睪酮治療顯著增加肌肉質(zhì)量、骨質(zhì)量和血紅蛋白。睪酮治療組的病死率有降低趨勢(16%對25.5%)，盡管未顯示統(tǒng)計學(xué)意義。重要的是，與安慰劑組相比，睪酮治療組未出現(xiàn)不良事件的增加。因此，對患有TBD相關(guān)性肝病的患者有必要進行精心設(shè)計的合成代謝類固醇的治療研究。NRH患者通常可保持良好的肝功能，肝臟生化指標(biāo)接近正常。因此，此類患者對雄激素療法的耐受性可能更好。

TBD具有廣泛的臨床疾病譜。通過研究隱源性肝硬化或NRH，特別是那些與骨髓衰竭或IPF相關(guān)的患者，對TBD有了更多認識。但TBD相關(guān)性肝病患者大多可能未得到診斷，故其真實流行率高于當(dāng)前報道。今后需深入闡明TBD相關(guān)性肝病的病理生理學(xué)，并探討合成代謝類固醇對這部分患者的作用。