腸道微生態(tài)與慢性肝病研究進(jìn)展

盧峪霞 楊長(zhǎng)青

隨著近年來(lái)宏基因組學(xué)和代謝組學(xué)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)了腸道微生態(tài)在很多疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用，最新的文獻(xiàn)總結(jié)了腸道菌群在調(diào)節(jié)宿主生理及病理變化中的作用，并將焦點(diǎn)集中于腸—肝軸[1]。Marshallpo[2]于1998年正式提出了“腸-肝軸”的概念。由于腸道菌群失調(diào)及其他因素的影響，導(dǎo)致肝功能異常、肝脂肪變性和結(jié)締組織重塑等慢性肝病進(jìn)展，其中有炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、線粒體功能紊亂等參與。腸道屏障功能被破壞時(shí)，腸道滲透性增加導(dǎo)致腸衍生細(xì)菌產(chǎn)品如脂多糖(LPS)的易位，刺激toll樣受體(tlr)，激活庫(kù)普弗氏細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、膽道上皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞，導(dǎo)致肝纖維化，引起慢性肝病[3]。越來(lái)越多的研究表明腸道微生物群失調(diào)與各種肝病有關(guān)，如酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、肝硬化、自身免疫性肝病和肝癌等。腸道微生態(tài)與慢性肝病之間的關(guān)系，成為了新的研究熱點(diǎn)，本文對(duì)近年來(lái)這方面最新進(jìn)展作一綜述。

一、 腸道微生態(tài)與慢性病毒性肝炎

腸道微生物群的變化在誘導(dǎo)和促進(jìn)乙肝病毒引起的慢性肝病進(jìn)展方面起到了重要的作用。為闡明慢性乙肝早期腸道微生物的組成、功能特征，及其在疾病進(jìn)展中的影響，有學(xué)者[4]入組85名低Child-Pugh scores慢性乙型肝炎患者及20名健康對(duì)照，收集糞便樣本，應(yīng)用 Illumina MiSeq 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行菌群鑒定，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，慢乙肝組腸道菌群有以下顯著變化：5個(gè)物種操作單元(operational taxonomic units, OTUs)增加，包括Actinomyces、Clostridium sensu stricto、unclassified Lachnospiraceae和Megamonas；27個(gè)OTUs減少，包括Alistipes、 Asaccharobacter、Bacteroides、Butyricimonas、Clostridium IV、 Escherichia/Shigella、Parabacteroides、 Ruminococcus、unclassified Bacteria、unclassified Clostridiales、Unclassified Coriobacteriaceae、 unclassified Enterobacteriaceae、unclassified Lachnospiraceae和unclassified Ruminococcaceae等。

另有研究在患有乙型肝炎病毒感染的患者中，應(yīng)用定量PCR和免疫學(xué)技術(shù)，研究糞便參數(shù)，包括糞便占主導(dǎo)地位的細(xì)菌數(shù)量，以及從大腸桿菌、脆弱擬桿菌、梭狀芽胞桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌以及一些免疫學(xué)參數(shù)[5]。數(shù)據(jù)分析表明，16 S rRNA基因拷貝數(shù)為柔嫩梭菌、糞腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸菌(乳酸菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬和魏斯氏菌屬)，在乙肝肝硬化患者的腸道中顯示出明顯的變異。雙歧桿菌和腸桿菌科(B/E)比值，表明腸道菌群的定植抗力，從健康對(duì)照組(1.15±0.11)、無(wú)癥狀攜帶者(0.99±0.09)，慢性乙型肝炎患者(0.76±0.08)，到肝硬化失代償患者(0.64±0.09)依次顯著降低(P<0.01)；表明(B/E)比值可以反映肝臟疾病進(jìn)展過(guò)程中腸道微生態(tài)的失調(diào)。致病基因增加表明在肝臟疾病惡化過(guò)程中，致病因子的多樣性增加。在失代償乙肝肝硬化患者中，糞便SIgA和腫瘤壞死因子的水平高于其他組，表明機(jī)體試圖通過(guò)復(fù)雜的自我調(diào)節(jié)系統(tǒng)達(dá)到新的腸道微生態(tài)平衡。

我國(guó)學(xué)者[6]設(shè)計(jì)了一項(xiàng)通過(guò)糞菌移植(FMT)治療經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期NA治療后HBeAg仍未轉(zhuǎn)陰的慢性乙型肝炎患者的病例對(duì)照、開(kāi)放標(biāo)簽的前瞻性研究。該研究納入了18例經(jīng)恩替卡韋或替諾福韋治療3年以上但仍未實(shí)現(xiàn)HBeAg消失的慢性乙型肝炎患者?；颊咴诶^續(xù)接受抗病毒治療的同時(shí)，5例接受了FMT，13例作為對(duì)照。FMT治療組患者接受經(jīng)胃鏡FMT治療，每4周1次，直到HBeAg消失。4例患者接受了1～7次治療，1例患者在第5次FMT治療后退出了試驗(yàn)。隨訪結(jié)束時(shí)，F(xiàn)MT組患者的HBeAg滴度較基線水平有顯著下降，且每次FMT治療后逐步下降。2例患者在接受了1次FMT后即實(shí)現(xiàn)HBeAg清除，還有1例在2次FMT治療后清除HBeAg。相反，對(duì)照組沒(méi)有1例患者清除HBeAg。

最近研究表明[7]，腸道微生物群的改變可能與丙型肝炎病毒誘發(fā)慢性肝病(CHC)的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。HCV患者腸道微生物群的組成在肝臟疾病階段是穩(wěn)定的，不同于非酒精性脂肪肝、乙型病毒性肝炎、艾滋病毒和丙肝病毒共同感染患者的腸道微生態(tài)的不穩(wěn)定性。丙型肝炎病毒感染對(duì)腸道滲透性的影響，可導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)開(kāi)始、進(jìn)行以及促炎作用，直至發(fā)展成肝硬化和肝癌。根除HCV消除了腸道微生物群不平衡對(duì)肝臟疾病發(fā)展的影響，并可能對(duì)益生菌的使用產(chǎn)生影響，從而改變肝硬化進(jìn)展的自然歷史。

二、 腸道微生態(tài)與肝炎肝硬化

Wei等[8]招募了120名乙肝肝硬化患者和120名健康對(duì)照組患者，通過(guò)對(duì)完整的元基因組DNA和生物信息學(xué)方法的高通量測(cè)序，對(duì)20例乙肝肝硬化患者及20個(gè)健康對(duì)照組進(jìn)行了比較，分析了糞便微生物群落和功能。發(fā)現(xiàn)兒童Child-Turcotte-Pugh 評(píng)分和擬桿菌(P<0.01)呈負(fù)相關(guān)，而和腸桿菌科及韋榮氏球菌呈正相關(guān)(P<0.01)。對(duì)另外200個(gè)糞便微生物群樣本的分析表明，腸道微生物標(biāo)記可能有助于區(qū)分正常人群和肝硬化患者。與對(duì)照組相比，在肝硬化患者的糞便微生物群功能多樣性顯著降低。肝硬化病人的糞便微生物群顯示在谷胱甘肽、糖異生、支鏈氨基酸、氮和脂質(zhì)的代謝方面增加(P<0.05),而芳香族氨基酸、膽汁酸的代謝以及與新陳代謝相關(guān)的細(xì)胞周期減少(P<0.05)。研究提示肝硬化患者糞便微生物群有廣泛差異和代謝潛力，腸道微生物群落可以作為調(diào)節(jié)人體新陳代謝平衡的獨(dú)立器官，并影響肝硬化患者的預(yù)后。

三、 腸道微生態(tài)與酒精性肝病

研究者[9]對(duì)在兩種不同的動(dòng)物設(shè)施中的ALD進(jìn)行了不同的處理，以測(cè)試兩種互補(bǔ)策略(糞便微生物群移植和益生菌治療)的有效性，以逆轉(zhuǎn)不正常生活和防止ALD的發(fā)生。在兩種不同的動(dòng)物設(shè)施中，老鼠被喂食酒精，并使用Lieber DeCarli的飲食(一種酒精性脂肪肝造模飼料)。用對(duì)酒精抵抗的供體老鼠的新鮮糞便移植到對(duì)酒精敏感的老鼠，每周三次。另一組老鼠在喂食酒精期間給予了果膠。結(jié)果顯示：對(duì)酒精敏感的小鼠，酒精引起脂肪變性和肝臟炎癥，與腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)破壞有關(guān)，對(duì)酒精抵抗的小鼠則不然。腸道菌群分析表明，在酒精敏感的小鼠中，擬桿菌屬的比例顯著減少(P<0.05)。分析顯示，酒精敏感和抵抗小鼠的腸道菌群聚集方式不同。果膠療法引起了對(duì)腸道菌群的重大改變，糞菌移植可以使對(duì)酒精敏感的小鼠與酒精抵抗小鼠的腸道菌群非常接近，這兩種方法都防止了脂肪變性、炎癥和恢復(fù)腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)。提示對(duì)酒精性肝病的敏感性是由老鼠的腸道微生物群引起的，可以用酒精抵抗的供體老鼠糞菌移植到對(duì)酒精敏感的老鼠或用益生元來(lái)治療酒精誘發(fā)的肝損傷。

有研究證實(shí)腸道微生物群會(huì)影響個(gè)體對(duì)酒精性肝病的易感性[10]：接受嚴(yán)重酒精性肝炎患者糞菌移植的老鼠比接受沒(méi)有酒精性肝炎的酗酒者糞菌移植的老鼠出現(xiàn)更嚴(yán)重的肝臟炎癥、肝T淋巴細(xì)胞亞群和自然殺傷T淋巴細(xì)胞(NKT) 數(shù)量增加、更多的肝細(xì)胞壞死、腸道通透性增加和更多的細(xì)菌易位；同樣，CD45+淋巴細(xì)胞在內(nèi)臟脂肪組織中增加，在腸系膜淋巴結(jié)中CD4(+)T和NKT淋巴細(xì)胞增多；嚴(yán)重酒精性肝炎和無(wú)酒精性肝病的腸道菌群的細(xì)菌豐度和成分存在差異；嚴(yán)重酒精性肝炎的腸道菌群主要是有害細(xì)菌，而無(wú)酒精性肝病的腸道菌群主要是腸球菌屬，熊去氧膽酸也更豐富。提示個(gè)體對(duì)ALD的敏感性在很大程度上是由腸道菌群驅(qū)動(dòng)的，因此可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群來(lái)預(yù)防和管理ALD。

為研究益生菌(培養(yǎng)乳酸菌/鏈球菌)對(duì)酒精性肝炎治療的影響，一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照的多中心研究提示7 d口服補(bǔ)充乳酸菌、鏈球菌可以重建腸道菌群和改善患者的內(nèi)毒素(LPS)水平[11]。從2010年9月到2012年4月，有117例患者(益生菌60和安慰劑57)被前瞻性隨機(jī)分配，接受7 d的培養(yǎng)乳酸菌/鏈球菌(1 500 mg/d)或安慰劑。通過(guò)糞便培養(yǎng)，對(duì)肝功能試驗(yàn)、促炎細(xì)胞因子、LPS和菌落形成單位進(jìn)行了研究和比較。結(jié)果顯示兩組中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶/丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、膽紅素、凝血酶原時(shí)間均顯著改善。在益生菌組(基線和之后)，白蛋白[(35±7)和(37±6) g/dL,P=0.038]和腫瘤壞死因子[(121±244)和(71±123) pg/mL,P=0.047]顯示出差異。此外，大腸桿菌的菌落形成單位數(shù)量顯著減少[(435±287)和(168±210),P=0.002]。在安慰劑組中，LPS的水平[(1.7±2.8)和(2.0±2.7) EU/mL]顯著增加。在組間比較中，各組間觀察到腫瘤壞死因子(P=0.042)和LPS(P=0.028)的顯著差異。

通過(guò)白介素-22、粒細(xì)胞集落刺激因子或法尼酯X受體激動(dòng)劑、抑制細(xì)胞凋亡、早期肝移植和通過(guò)抗生素或糞便移植方法調(diào)節(jié)腸道微生物群來(lái)促進(jìn)肝再生，是目前臨床研究的新課題。抑制氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)腸道菌群以及刺激祖細(xì)胞增殖和促炎途徑，將是今后的研究方向[12]。

四、 腸道微生態(tài)與非酒精性肝病

非酒精性脂肪肝(NASH)的發(fā)生發(fā)展包括基因差異、脂肪堆積、胰島素抵抗和腸道微生物群的變化等多方面因素，其中腸道微生物群被認(rèn)為起著重要作用，會(huì)影響肝臟疾病的肝硬化前期和肝硬化，這可能會(huì)為診斷、治療和研究帶來(lái)新的策略[13]。

非酒精性脂肪肝(NAFLD)出現(xiàn)的進(jìn)展性纖維化是肝臟死亡的最重要預(yù)測(cè)因素。在一項(xiàng)前瞻性研究中[14]，研究者用從糞便樣本中提取的DNA全基因組測(cè)序來(lái)描述腸道微生物組的組成。這項(xiàng)研究包括86例經(jīng)過(guò)肝活檢證實(shí)的NAFLD患者，其中72例有輕/中度(0～2纖維化)NAFLD，14例晚期纖維化(3級(jí)或4級(jí)纖維化)，發(fā)現(xiàn)了一組40個(gè)特征(P<0.006)，其中包括37種細(xì)菌，被用來(lái)構(gòu)建一個(gè)隨機(jī)的森林分類模型，以區(qū)分出輕/中度的NAFLD與晚期纖維化。該模型具有較強(qiáng)的診斷準(zhǔn)確性(AUC 0.936)，用于檢測(cè)晚期纖維化，為通過(guò)糞便微生物宏基因組學(xué)特征來(lái)檢測(cè)肝纖維化進(jìn)展提供了初步的證據(jù)。

五、 腸道微生態(tài)與肝細(xì)胞癌

近年研究表明，腸道菌群作為門靜脈內(nèi)毒素的主要來(lái)源可能在肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[15]。Grat等[16]納入15例肝癌患者和15例非肝癌但因肝硬化及晚期肝病而行肝移植的患者，對(duì)其進(jìn)行了肝移植MELD評(píng)分，對(duì)其腸道微生物概況的分析是基于從移植前階段收集的糞便樣本。結(jié)果顯示有無(wú)肝細(xì)胞癌的患者在年齡(P=0.506)、性別(P=0.700)、丙型肝炎病毒(P=0.999)和乙型肝炎病毒(P=0.715)感染狀況、酒精性肝病(P=0.999)和MELD評(píng)分(P=0.337)等方面相似。值得注意的是，HCC的存在與顯著增加的大腸桿菌的排泄物數(shù)量有關(guān)(P=0.025)?；诖竽c桿菌計(jì)數(shù)的HCC存在的預(yù)測(cè)與接受者-操作曲線下的面積為0.742(95%可信區(qū)間，0.564～0.920)相關(guān)聯(lián)，最佳截點(diǎn)為17.728(每1克糞便的菌落形成單位的自然對(duì)數(shù))。確定的截點(diǎn)的敏感性和特異性比率分別為66.7%和73.3%。由此認(rèn)為，腸道微生物群與肝細(xì)胞癌的存在有關(guān)，其特點(diǎn)是增加糞便大腸桿菌的數(shù)量，大腸桿菌的腸道過(guò)度生長(zhǎng)可能導(dǎo)致肝癌發(fā)生。

六、 腸道微生態(tài)與自身免疫性肝病

為探討自身免疫性肝炎(AIH)患者腸道滲透、細(xì)菌易位和腸道菌群的變化、并評(píng)估這些變化與疾病分期的相關(guān)性，Lin R等[17]招募了24名自身免疫性肝炎患者和8名健康志愿者，通過(guò)對(duì)十二指腸活檢標(biāo)本的免疫組織化學(xué)分析，對(duì)腸內(nèi)緊密連接的完整性進(jìn)行了評(píng)估，16 S rDNA定量PCR腸道微生物群的變化，使用ELISA通過(guò)脂多糖水平分析細(xì)菌易位，發(fā)現(xiàn)腸道通透性增加、微生態(tài)紊亂、細(xì)菌易位與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)，提示自身免疫性肝炎與腸道和腸道微生態(tài)失調(diào)有關(guān)，受損的腸道屏障可能在AIH的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)攜帶HLA-DR3轉(zhuǎn)基因AIH小鼠的腸道菌群多樣性和豐度下降，無(wú)菌鼠對(duì)刀豆蛋白A誘發(fā)的肝損傷有拮抗作用，而腸道抗原則誘導(dǎo)激活自然殺傷T細(xì)胞，參與到肝損傷中，提示了微生物群和AIH之間的密切關(guān)系[18]。

回顧自身免疫性肝炎的發(fā)病機(jī)制和治療，發(fā)現(xiàn)了腸道微生態(tài)在先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)方面的作用，從而促進(jìn)系統(tǒng)免疫介導(dǎo)性疾病的發(fā)展[19]。腸道菌群組成的改變會(huì)擾亂腸道和系統(tǒng)的免疫耐受。腸內(nèi)的toll樣受體可以識(shí)別相關(guān)的分子模式，并形成T輔助淋巴細(xì)胞的子集，這些淋巴細(xì)胞可以與宿主產(chǎn)生抗原交叉反應(yīng)(分子模仿)。激活的腸道衍生的淋巴細(xì)胞可以遷移到淋巴結(jié)，而由腸道衍生的微生物抗原可以轉(zhuǎn)移到腸道外的地方。炎癥因子可以在肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞內(nèi)形成，并且可以驅(qū)動(dòng)促炎癥、免疫介導(dǎo)性和纖維化反應(yīng)。飲食、益生菌、維生素補(bǔ)充劑、抗生素、減少腸道滲透性的藥物，以及阻斷信號(hào)通路的分子干預(yù)，可能會(huì)成為補(bǔ)充常規(guī)免疫抑制管理的輔助療法。

盡管許多研究表明益生菌對(duì)慢性肝病有益，但還是有爭(zhēng)議。有國(guó)外學(xué)者研究探討益生菌療法在緩解慢性肝病的腸道細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)(SIBO)和通透性方面的功效[20]：53例慢性肝病患者被隨機(jī)分為益生菌治療或安慰劑，使用了6種細(xì)菌：雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和嗜熱鏈球菌，4周后研究糞便細(xì)菌、SIBO、腸道通透性和臨床癥狀的變化。結(jié)果提示：益生菌治療組(P<0.001)的糞便中增加了6種益生菌中的3種，而在安慰劑組中，糞便微生物群沒(méi)有發(fā)生變化。在許多益生菌治療組中SIBO消失了，但在安慰劑組一個(gè)都沒(méi)有消失(24%比0%，P<0.05)；一般的胃腸道癥狀在益生菌組中也有改善，腸道通透率的提高在益生菌組比安慰劑組稍微多一些(50%比31.3%，P=0.248)；糞便中乳酸菌的數(shù)量與腸道通透率負(fù)相關(guān)(P為趨勢(shì)<0.05)；兩組中肝臟生化學(xué)并沒(méi)有顯著改善。由此認(rèn)為，慢性肝病的短期益生菌管理對(duì)緩解SIBO和臨床癥狀有效，但對(duì)改善腸通透性和肝功能無(wú)效。

隨著人們對(duì)腸-肝軸認(rèn)識(shí)的深入以及系統(tǒng)生物學(xué)的進(jìn)步，腸道微生態(tài)在慢性肝病的發(fā)生發(fā)展中的作用已越來(lái)越受到重視，但腸道微生態(tài)紛繁復(fù)雜，慢性肝病多種多樣，要進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制和管理策略，尚需深入的基礎(chǔ)研究和大樣本的隨機(jī)對(duì)照臨床研究。