超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜法分析茶葉中聯苯肼酯殘留與風險評估

鐘 青，羅逢健，陳宗懋，崔 璇，周 利，張新忠

(1.中國農業(yè)科學院茶葉研究所農產品質量安全研究中心，浙江 杭州 310008；2.天津農學院園藝園林學院，天津 300384)

聯苯肼酯(bifenazate，C17H20N2O3，CAS No.：149877-41-8)是一種由美國科聚亞公司研發(fā)，2008年在我國獲得部分登記的聯苯肼類殺螨劑，其化學結構式示于圖1。它可作用于螨類線粒體細胞色素b(cytb)和電子傳遞鏈cytb復合物Ⅲ的Q0位點，殺卵活性及擊倒優(yōu)勢良好，目前與其他殺螨劑無交互抗性，對螨類各個生長階段皆有效，且持效期長[1-2]。

圖1 聯苯肼酯的化學結構式Fig.1 Chemical structural formula of bifenazate

聯苯肼酯主要登記用于防治草莓[3]、柑橘[4]、桑樹[5]和蘋果[6]等水果，蔬菜和其他經濟作物上的害螨。近年來，研究結果表明，聯苯肼酯在茶樹上用于防治茶橙癭螨、茶葉癭螨、茶紅蜘蛛等螨類害蟲，效果很好[7-8]，可替代現有茶園里施用的常規(guī)藥劑。田間施用聯苯肼酯后，會造成農產品及環(huán)境中的殘留，我國規(guī)定啤酒花和薄荷中的聯苯肼酯最大殘留限量(MRL)值為20、40 mg/kg；規(guī)定棉籽、蔬菜、水果、堅果等的聯苯肼酯MRL值為0.2～7 mg/kg；歐盟、日本和韓國分別規(guī)定茶葉中聯苯肼酯MRL值為0.02、2、3 mg/kg[9]。然而，目前我國和食品法典委員會CAC暫無茶葉中聯苯肼酯MRL值的有關規(guī)定。

目前，研究人員多采用液相色譜-紫外檢測法或液相色譜-串聯質譜法分析聯苯肼酯在不同樣品基質中的殘留。如Park等[10]建立了液相色譜法分析谷子、蕓豆、柑橘、紫蘇葉和蘑菇等多種基質中的聯苯肼酯殘留，結果表明，在0.1～0.5 mg/kg添加水平下該方法的回收率為73.1%～104.3%，RSD為0.2%～9.7%，定量限為0.01 mg/kg；張月等[11]采用UPLC-MS/MS法檢測木瓜上聯苯肼酯及其代謝物的殘留量；張嬌嬌等[2]和歐陽文森等[12]研究了聯苯肼酯在柑橘上的消解動態(tài)；何建紅等[3]采用UPLC-MS/MS法研究了聯苯肼酯在草莓上的殘留降解動態(tài)；Satheshkuma等[13]采用HPLC-DAD法研究了熱帶氣候環(huán)境條件下紅茶樣品中聯苯肼酯消解動態(tài)，半衰期為1.03～1.36天，建議安全采收期PHI為16天，方法最低添加濃度為0.10 mg/kg，遠高于歐盟規(guī)定的茶葉中聯苯肼酯MRL值0.02 mg/kg；另有報道采用液相色譜-紫外檢測法進行聯苯肼酯原藥[14]和制劑分析[15]， 以及柑橘[16]和土壤[16]中聯苯肼酯的殘留分析。尚未見聯苯肼酯在茶園施用后，其殘留降解情況的相關報道。

為了評價聯苯肼酯在茶葉上的消解趨勢和殘留水平，明確其在茶葉生長過程中的降解規(guī)律，為聯苯肼酯在茶葉上的安全和合理用藥、茶葉應用安全性評價提供科學依據。本研究擬采用QuEChERS法凈化茶葉，超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜法(UPLC-MS/MS)檢測茶葉鮮葉和成茶中聯苯肼酯殘留量，利用該方法研究我國氣候條件下43%聯苯肼酯懸浮劑在湖南永定、福建松溪和浙江紹興三地茶園的殘留消解動態(tài)和最終殘留實驗，并進行相關風險評估。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

UPLC/Quattra Premier XE超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀：美國Waters公司產品，配有電噴霧電離源(ESI)，MassLynx 4.1質譜工作站；高速離心機：德國Sigma公司產品；電子分析天平(0.000 1 g 和0.01 g)：美國Mettler公司產品；R-210 BUCHI旋轉蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI Labortechnik A G公司產品；DFT-200食品粉碎機：溫嶺市林大機械有限公司產品；KQ-250DB超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產品；T18均質器：德國IKA公司產品；Vortex-2渦旋混合器：美國Scientific公司產品。

乙腈、無水硫酸鎂、氯化鈉：均為分析純，上海試四赫維化工有限公司產品；N-丙基乙二胺(PSA)填料(40～60 μm)，石墨化炭黑(GCB)填料(100～150目)：天津博納艾杰爾科技有限公司產品；純凈水：杭州娃哈哈公司產品；聯苯肼酯標準品(純度98%)：德國Dr.Ehrenstorfer公司產品。

1.2 殘留實驗

1.2.1茶鮮葉中消解動態(tài)實驗 選擇浙江紹興、福建松溪和湖南永定三地長勢均勻的茶園，在2013年和2014年的7～8月茶葉生長季節(jié)，以43%聯苯肼酯懸浮劑制劑以45 mL/畝(有效成分290.25 g/公頃)劑量，每畝兌水60 L，采用背負式噴霧器來回均勻葉面噴霧1次，施藥后間隔2 h(原始沉積量)、1、2、3、5、7、10、14、21、28天，采用隨機法15點采集1 kg茶葉鮮葉，混勻后，四分法取樣，用食品粉碎機磨碎，-18 ℃存放備用，分別測定鮮葉上聯苯肼酯殘留量，獲得對應的消解動態(tài)曲線和半衰期。設3個重復實驗，每重復小區(qū)面積為20 m2。采集施藥前的茶葉鮮葉樣品作為空白對照。

1.2.2最終殘留實驗 在1.2.1節(jié)的相同地點和相同時間，按照制劑30 mL/畝(有效成分193.5 g/公頃，推薦劑量)和制劑45 mL/畝(有效成分290.25 g/公頃)兩個劑量濃度，每畝兌水60 L，藥液質量濃度分別為215 mg/L和322.5 mg/L，采用手動背負式噴霧器施藥1～2次，施藥間隔7天，距最后一次施藥后5、7、10、14天，分別以隨機法15點采摘1 kg茶葉鮮葉一芽二葉、三葉，將鮮葉按照當地常規(guī)工藝方法加工制成成茶(浙江炒青綠茶、湖南烘青綠茶、福建紅茶)，用食品粉碎機粉碎后，-18 ℃存放備用，分別測定成茶茶葉中聯苯肼酯殘留量。每個樣品設3個重復實驗，每個重復小區(qū)面積為20 m2，并設空白對照。

1.3 實驗方法

1.3.1提取凈化 分別稱取磨碎后的樣品(5.00 g鮮葉，2.00 g干茶茶粉)，置于50 mL塑料離心管中，加入10 mL水渦旋混勻，30 min后，加入10 mL乙腈(其中，向鮮葉樣品加入20 mL乙腈)渦旋混勻，浸泡過夜；加入3 g NaCl混勻均質1 min，超聲10 min，以7 500 r/min離心5min；取1.50 mL上層(乙腈層)至裝有100 mg PSA+50 mg GCB+200 mg MgSO4凈化填料(鮮葉為100 mg PSA+25 mg GCB+200 mg MgSO4)的2 mL離心管中，渦旋混勻，以7 500 r/min離心5 min后，過0.22 μm濾膜至進樣瓶，向UPLC-MS/MS進樣5 μL，基質外標法測定。

1.3.2色譜條件 Acquity UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)；柱溫40 ℃；進樣量5 μL；樣品盤溫度8 ℃；流速0.25 mL/min；流動相：A為0.1%甲酸乙腈，B為10 mmol/L乙酸銨溶液；梯度洗脫程序：0～1.5 min(20%～30%A)，1.5～3.0 min(30%～55%A)，3.0～7.0 min(55%～90%A)，7.0～8.0 min(90%～98%A)，8.0～9.5 min(98%A)，9.5～9.8 min(98%～70%A)，9.8～10.6 min(70%～20%A)，保持1.4 min。聯苯肼酯的保留時間為5.8 min。

1.3.3質譜條件 電噴霧電離正離子多反應監(jiān)測模式(ESI+-MRM)；電噴霧毛細管電壓3.0 kV；離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；錐孔反吹氣(N2)流速50 L/h；脫溶劑氣(N2)流速600 L/h；碰撞氣(Ar)流速0.25 mL/min；電子倍增器倍增電壓650 V；二級質譜母離子駐留時間 0.040 s；錐孔電壓 15 V；定量離子對：母離子m/z301.2，子離子m/z198.1，碰撞裂解電壓10 eV；定性離子對：母離子m/z301.2，子離子m/z170.1，碰撞裂解電壓20 eV。

1.4 標準溶液配制與標準曲線

稱取0.010 g聯苯肼酯標準品于50 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，配制成200 mg/L標準儲備液，-18 ℃保存。將聯苯肼酯標準儲備液用乙腈-水溶液(5∶5,V/V)稀釋成1.00、0.50、0.250、0.10、0.050、0.0250、0.010、0.005、0.002 5 mg/L系列標準工作溶液，UPLC-MS/MS進樣5 μL，每個濃度測定3次，以濃度為橫坐標(x)，峰面積平均值為縱坐標(y)，獲得聯苯肼酯標準曲線和線性相關系數。

1.5 添加回收率與精密度

稱取經測定不含聯苯肼酯的茶鮮葉、綠茶和紅茶空白樣品，分別添加相當于0.020、0.20、2.0 mg/kg添加水平的標準溶液，渦旋混勻后放置2 h，以更接近于實際樣品農藥殘留情況，然后按照1.3.1節(jié)方法加入水和乙腈進行提取凈化測定，每個濃度重復6次；同時將處理后得到的空白茶鮮葉(綠茶、紅茶)樣品溶液，加入相應濃度的標準溶液后定容，配制成基質標準溶液進行測定，計算添加回收率、相對標準偏差、方法的檢測限和定量限。

2 結果與討論

2.1 前處理方法的優(yōu)化

分析聯苯肼酯殘留時，張月等[11]采用乙腈和0.25%乙酸溶液提取木瓜中的殘留藥物，再加入0.25%抗壞血酸衍生化；Satheshkuma等[13]采用0.1%甲酸乙腈溶液提取紅茶中聯苯肼酯殘留；也有直接采用乙腈提取草莓[3]、柑橘[16]和土壤[16]中聯苯肼酯殘留的報道。韓鳳等[16]比較了甲醇、乙酸乙酯、乙腈和二氧甲烷提取柑橘橘肉、果皮等的聯苯肼酯殘留，結果表明乙腈作為提取溶劑時，雜質較少，回收率穩(wěn)定。由于茶葉基質更復雜，成茶茶葉為干物質，人體通過飲用茶湯攝入農藥殘留。因此，本實驗采用茶葉加水充分浸泡后，再加入乙腈作為提取溶劑，以提取茶葉中的聯苯肼酯殘留。

QuEChERS是美國農業(yè)部Anastassiades 教授在2003年發(fā)明的一種前處理方法[17]，操作簡單、快速，廣泛應用于農藥殘留分析檢測中[18-20]。前期研究[21-22]表明：PSA 能有效去除茶葉樣品中的脂肪酸、糖類物質等極性基質；C18能去除部分非極性脂肪和脂溶性雜質；GCB能去除色素和固醇類雜質，降低雜質干擾與基質效應；加入MgSO4可吸收多余水分。因此，本實驗采用100 mg PSA+50 mg GCB+200 mg MgSO4凈化干茶，采用100 mg PSA+25 mg GCB+200 mg MgSO4凈化鮮葉。既能去除大部分雜質，又能保證農藥較好的回收率，且5.0 g鮮葉和2.0 g干茶分別僅需20、10 mL乙腈，節(jié)省了有機試劑的使用量，降低了實驗成本。

2.2 色譜質譜條件的優(yōu)化

茶葉中富含咖啡堿、色素等不同極性的雜質化合物，在紫外檢測中易造成嚴重的背景干擾，無法獲得更低的檢測限。因此，為了獲得良好的分離效果，采用0.1%甲酸乙腈和10 mmol/L乙酸銨溶液進行梯度洗脫，進一步降低雜質干擾和基質效應的影響。

本研究分別采用ESI+和ESI-電離分析聯苯肼酯，結果表明，在ESI+模式下，聯苯肼酯的離子化效果更好，能獲得更高的[M+H]+響應。在實驗過程中，進一步優(yōu)化了錐孔電壓(10、20、30、40、50 V)和噴霧電壓，發(fā)現錐孔電壓在20 V時的準分子離子峰[M+H]+(m/z301)響應最好。對準分子離子進行二級質譜裂解子離子掃描，不斷增大二級質譜的裂解碰撞電壓，得到碎片離子信息，并優(yōu)化碰撞裂解能量(5、10、15、20、30、40 eV)，聯苯肼酯準分子離子峰m/z301在5、10、20 eV下的二級質譜圖示于圖2。由圖2可見，m/z301主要生成碎片子離子m/z198和m/z170，推測二者均是由六元環(huán)重排裂解生成，隨著碰撞裂解電壓的變化，離子豐度有所不同。利用四極桿飛行時間質譜通過源內裂解生成m/z198后，對其進行二級質譜裂解驗證，發(fā)現m/z198的子離子為m/z152，未見m/z170。這進一步驗證了m/z170并非來自m/z198，而是隨著裂解能量的增強，由m/z301裂解生成，其主要碎片結構和裂解途徑示于圖3。最終優(yōu)化后的條件已列于1.3.2和1.3.3節(jié)，選擇子離子m/z198作為定量離子，m/z170用以輔助定性。

注：a.5 eV；b.10 eV；c.20 eV圖2 不同二級碰撞能量下，聯苯肼酯準分子離子峰m/z 301的二級質譜圖Fig.2 MS/MS spectra of m/z 301 at different collision energies

圖3 聯苯肼酯準分子離子及其主要碎片離子的裂解路徑Fig.3 Fragmentation pathway of the quasi-molecular ion of bifenazate

2.3 標準曲線、靈敏度、回收率與精密度

在優(yōu)化條件下，考察了方法的線性關系，在0.002 5～1.0 mg/L濃度范圍內，聯苯肼酯的線性方程為y=1 505 413x+43 050，相關系數r=0.994 2。

按照1.5節(jié)條件進行添加回收率實驗，同時配制相應濃度的基質標準溶液進行定量分析，回收率和相對標準偏差(RSD)列于表1。結果表明，在0.020、0.20、2.0 mg/kg 3個添加濃度下，綠茶中聯苯肼酯的平均回收率分別為79.3%、88.6%和103.4%，RSD分別為6.1%、5.9%和3.7%；紅茶中聯苯肼酯的平均回收率分別為79.3%、82.6%和103.3%，RSD分別為6.7%、4.5%和4.7%；茶鮮葉中聯苯肼酯的平均回收率分別為91.1%、94.4%和91.0%，RSD分別為4.3%、3.8%和7.6%。以最低添加濃度下方法檢出限(LOD，S/N=3)為1.5 μg/kg，計算S/N=10時的方法定量限(LOQ)，聯苯肼酯在茶鮮葉、綠茶和紅茶中的方法定量限為5 μg/kg。茶葉空白樣品、聯苯肼酯綠茶基質標準樣品和最低添加濃度樣品的色譜圖示于圖4。

表1 茶鮮葉、綠茶和紅茶中聯苯肼酯的添加回收率和相對標準偏差Table 1 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of bifenazate residue in fresh tea leaves, green tea and black tea samples

圖4 綠茶空白樣品(a)、聯苯肼酯綠茶基質0.004 mg/L標準樣品(b)和最低添加濃度0.02 mg/kg樣品(c)的色譜圖Fig.4 Chromatograms of green tea blank sample (a), bifenazate matrix standard solution (b) and spiked green tea sample (c)

2.4 聯苯肼酯在鮮葉上的消解動態(tài)

按照1.2.1節(jié)方法進行43%聯苯肼酯懸浮劑在茶鮮葉上的殘留消解動態(tài)實驗，按照1.3節(jié)方法測定茶鮮葉中聯苯肼酯的殘留量，結果列于表2，鮮葉中聯苯肼酯的消解動態(tài)曲線示于圖5。

結果表明：由于茶葉生長狀態(tài)不同，按實驗劑量施藥后，2013年茶葉鮮葉噴藥2 h后聯苯肼酯原始沉積量為21.291～54.789 mg/kg；噴藥5天后，浙江、湖南、福建三地茶鮮葉中聯苯肼酯消解均達到90%以上；三地茶鮮葉中聯苯肼酯殘留消解分別滿足一級反應動力學方程y=7.835 6×10-0.237 7x、y=11.227×10-0.332 3x、y=12.81×10-0.401 1x，相關系數R2分別為0.757 1、0.929 9、0.960 2，半衰期T1/2分別為2.9、2.1、1.7天。2014年茶鮮葉施藥2 h后聯苯肼酯原始沉積量為5.333～11.876 mg/kg，由于三地氣候等差別，噴藥5天后，浙江和福建兩地茶鮮葉中聯苯肼酯消解率均達到90%以上，而湖南地區(qū)在噴藥14天后茶鮮葉中聯苯肼酯消解率才達到90%以上。浙江、湖南、福建三地茶鮮葉中聯苯肼酯殘留消解分別滿足一級反應動力學方程y=3.714 0×10-0.338 6x、y=10.513 8×10-0.174 7x和y=3.196 8×10-0.486 6x，相關系數R2分別為0.892 0、0.982 5和0.869 9，半衰期T1/2分別為2.0、4.0、1.4天。

表2 43%聯苯肼酯懸浮劑在茶葉鮮葉上的消解動態(tài)數據Table 2 Average dynamic degradation data of 43% bifenazate suspending agent in fresh tea leaves

2013～2014年夏秋季43%聯苯肼酯懸浮劑在兩年三地實驗表明，聯苯肼酯在茶鮮葉上的半衰期為1.4～4.0天，屬于易降解農藥。

2.5 聯苯肼酯在茶葉中的最終殘留結果

按照1.2.2節(jié)方法進行43%聯苯肼酯懸浮劑在成茶茶葉中的最終殘留實驗，依照1.3節(jié)方法測定成茶中聯苯肼酯的殘留量。

結果表明，按照推薦劑量制劑30 g/畝(有效成分193.5 g/公頃)施藥1、2次，間隔5天后成茶中聯苯肼酯殘留量為0.010～8.243 mg/kg，平均值為2.835 mg/kg，殘留中值為1.725 mg/kg；間隔7天后成茶中聯苯肼酯殘留量為未檢出～4.518 mg/kg，平均值為1.486 mg/kg，殘留中值為1.025 mg/kg；間隔10天后成茶中聯苯肼酯殘留量為未檢出～3.991 mg/kg，平均值為1.061 mg/kg，殘留中值為0.480 mg/kg；間隔14天后成茶中聯苯肼酯殘留量為未檢出～1.769 mg/kg，平均值為0.546 mg/kg，殘留中值為0.340 mg/kg。

按照高劑量(1.5倍推薦劑量)制劑45 g/畝(有效成分290.25 g/公頃)施藥1、2次，間隔5天后成茶中聯苯肼酯殘留量為0.011～10.501 mg/kg，平均值為3.824 mg/kg，殘留中值為2.920 mg/kg；間隔7天后成茶中聯苯肼酯殘留量為0.006～5.977 mg/kg，平均值為1.819 mg/kg，殘留中值為1.316 mg/kg；間隔10天后成茶中聯苯肼酯殘留量為未檢出～4.547 mg/kg，平均值為1.164 mg/kg，殘留中值為0.690 mg/kg；間隔14天后成茶中聯苯肼酯殘留量為未檢出～2.038 mg/kg，平均值為0.701 mg/kg，殘留中值為0.390 mg/kg。

實驗表明，按照推薦劑量和1.5倍推薦劑量施藥1～2次，10天后成茶中的聯苯肼酯殘留量均小于5 mg/kg。

注：a.浙江2013年；b.浙江2014年；c.湖南2013年；d.湖南2014年；e.福建2013年；f.福建2014年圖5 43%聯苯肼酯懸浮劑在浙江、湖南和福建三地2013～2014年茶鮮葉上的消解動態(tài)曲線Fig.5 Degradation kinetic curves of 43% bifenanzate SC in tea fresh leaves in 2013-2014 at Zhejiang, Hunan and Fujian

2.6 茶葉中聯苯肼酯最大殘留限量建議及飲用安全性風險評估

聯苯肼酯的每日允許攝入量(ADI)值為0.01 mg/kg·d bw。如果以5 mg/kg設定為聯苯肼酯在茶葉中的MRL值標準，按照茶葉全部攝入體內(實際上還應該考慮浸出率，浸出率并非100%)計算人體最大攝入量為：

0.001 032(mg/kg·d bw)

其中：LP為世界上每人每天飲用茶葉的最高值(13 g/d)；HR-P為理論上應該取假定安全間隔期10天的成茶中聯苯肼酯最高殘留量4.547 mg/kg，小于建議MRL值，故此處按照建議MRL值5 mg/kg來計算；BW為成人平均體重(63 kg)。

計算獲得人體最大攝入量為0.001 032 mg/kg·d bw，該值僅為聯苯肼酯ADI值(0.01 mg/kg·d bw)的10.32%，此處計算并未考慮茶湯中浸出率，若引入浸出率數據，則風險值更小。該結果表明，聯苯肼酯在茶葉中的MRL值設定為5 mg/kg時，人體飲用安全系數大于10，可認為此條件下茶葉是安全的。

3 結論

本研究建立了QuEChERS分散固相萃取方法凈化，超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜法測定茶葉中聯苯肼酯殘留的分析方法，研究了43%聯苯肼酯懸浮劑在茶園茶葉中的殘留降解規(guī)律，并對其飲用安全性進行了風險評估。結果表明，按照風險評估制訂茶葉中聯苯肼酯殘留量MRL值為5 mg/kg對人體飲用是安全的，人體通過全部食用茶葉攝入的聯苯肼酯僅占每日允許攝入量(ADI)的10.32%。