離子色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定奶粉中氟乙酸鈉

張秀堯，蔡欣欣，張曉藝，李瑞芬

(溫州市疾病預(yù)防控制中心，浙江 溫州 325001)

氟乙酸鈉是有機(jī)氟類殺鼠劑，屬A級(jí)劇毒物，大鼠口服半致死量為0.22 mg/(kg·bw), 人體口服半致死量為0.1～10 mg/(kg·bw)。由于氟乙酸鈉對(duì)人和動(dòng)物的毒性極強(qiáng)、起效快、致死率高，并容易引起二次中毒，我國(guó)于1982年就明令禁止其生產(chǎn)、銷售和使用[1]，但在新西蘭、澳大利亞、以色列和美國(guó)仍允許使用[2]。

目前，氟乙酸鈉的檢測(cè)方法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[3]、離子色譜法[4]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[1, 5-6]等。其中，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法需要將樣品衍生化后才能測(cè)定，操作較繁瑣；離子色譜法靈敏度低，定性能力較弱，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)時(shí)，由于氟乙酸鈉在反相色譜柱上保留較弱，易受基質(zhì)成分干擾[1]，若進(jìn)行衍生化，產(chǎn)率受樣品基質(zhì)影響，且操作復(fù)雜耗時(shí)[5]，也有采用反相和強(qiáng)陰離子交換固相萃取柱(PAX)進(jìn)行凈化的報(bào)道，但因柱容量有限，易被樣品基質(zhì)飽和而影響氟乙酸鈉回收率[6]。奶粉中氟乙酸鈉的測(cè)定方法主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]和液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法[8]。前者將奶粉樣品用丙酮溶液提取，再將提取液過(guò)自填的AG 1-X8強(qiáng)陰離子樹(shù)脂固相萃取柱，用0.2 mol/L HCl溶液洗脫，用3-硝基苯胺衍生氟乙酸鈉，衍生物經(jīng)Oasis HLB固相萃取柱凈化，樣品前處理比較繁瑣。后者先用正己烷脫脂，再用6 mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH<1，用乙腈超聲提取，NaCl和MgSO4鹽析，氮吹濃縮，雖然步驟簡(jiǎn)化但凈化效果不佳。

本研究擬建立離子色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用方法檢測(cè)奶粉中氟乙酸鈉。采用高氯酸沉淀去除樣品中蛋白和脂肪等雜質(zhì)，叔丁基甲醚萃取凈化，借助于離子色譜分離，三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)，穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法定量分析，希望為檢測(cè)奶粉中氟乙酸鈉提供新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

離子色譜系統(tǒng)：美國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品，由Dionex ICS-1100離子色譜儀、淋洗液自動(dòng)發(fā)生器(RFC-30)、電解再生抑制器(ASRS 500)和自動(dòng)進(jìn)樣器(DV-AS)組成，由變色龍工作站(7.22版)控制；QTRAP 6500三重四極桿/復(fù)合線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)AB SCIEX公司產(chǎn)品，由Analyst 1.6.2軟件控制；Multi Reax數(shù)顯型多管旋渦混合器：德國(guó)Heidolph公司產(chǎn)品；3-30K高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；N-EVAP氮吹儀(24孔)：美國(guó)Organomation公司產(chǎn)品；2510超聲波清洗機(jī)：美國(guó)Branson公司產(chǎn)品；Gradient A10 Mill-Q 超純水器：法國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

叔丁基甲醚、丙酮：均為HPLC級(jí)，德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；高氯酸：上海桃浦化工廠產(chǎn)品；親水性聚丙烯(GHP)濾膜針式過(guò)濾頭(直徑13 mm，孔徑0.2 μm)：美國(guó)Pall公司產(chǎn)品；氟乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度97%)：德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；13C2-氟乙酸鈉同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：新西蘭BDG Synthesis公司產(chǎn)品。分別用水溶解氟乙酸鈉、13C2-氟乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并稀釋，得到1.30 g/L氟乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液和130 mg/L13C2-氟乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，使用時(shí)用水稀釋至合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1樣品前處理 稱取0.50 g奶粉試樣于15 mL塑料具塞離心管中，加入100 μL 1.3 mg/L13C2-氟乙酸鈉同位素內(nèi)標(biāo)液和2.0 mL水，旋渦10 s，再加入4.0 mL 3%高氯酸，旋渦10 s，超聲提取5 min，于6 ℃以10 000 r/min離心5 min，取約4 mL(pH 0.5～1.0)中間清液于15 mL具塞離心管中。向其中加入5.0 mL叔丁基甲醚，于多管旋渦混合器中旋渦3 min，以10 000 r/min離心2 min，移取上清液，用5.0 mL叔丁基甲醚重復(fù)提取殘?jiān)?次，合并2次提取液。向提取液中加入100 μL 1%氨水丙酮溶液，混勻，于45 ℃氮吹至近干，加入1.0 mL 0.1%氨水溶液，旋渦10 s，過(guò)0.2 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.3.2色譜條件 IonPac AS 19 型色譜柱(2 mm×250 mm×7.5 μm)，AG19保護(hù)柱(2 mm×50 mm)；ASRS 500陰離子抑制器(2 mm，外接水模式)；KOH淋洗液由RFC-30自動(dòng)在線產(chǎn)生；梯度淋洗程序：0～7 min(5 mmol/L KOH)，7～8 min(5～50 mmol/L KOH)，8～14 min(50 mmol/L KOH)，14～20 min(5 mmol/L KOH)；淋洗液流速0.30 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL。

1.3.3質(zhì)譜條件 電噴霧電離(ESI)負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；離子化電壓(IS)-4 500 V；離子源溫度650 ℃；氣簾氣壓強(qiáng)277 kPa；噴霧氣壓強(qiáng)345 kPa；輔助加熱氣壓強(qiáng)345 kPa；碰撞氣設(shè)為Medium；氟乙酸鈉定量離子對(duì)為m/z77.0>57.0，去簇電壓-40 V，碰撞能量-15 eV；13C2-氟乙酸鈉的定量離子對(duì)為m/z79.0>59.0，去簇電壓-40 V，碰撞能量-15 eV；質(zhì)譜峰駐留時(shí)間均為1 000 ms。

進(jìn)樣運(yùn)行開(kāi)始時(shí)，離子色譜柱流出液經(jīng)六通切換閥切換至廢液，5.50 min切換至離子源，質(zhì)譜同時(shí)采集數(shù)據(jù)，直到8.00 min六通切換閥又將柱流出液切換至廢液中。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

圖1 氟乙酸鈉子離子掃描譜圖Fig.1 Product ion scan spectrum of sodium monofluoroacetate

在ESI-模式下，優(yōu)化檢測(cè)氟乙酸鈉(M)的質(zhì)譜條件，Q1掃描時(shí)出現(xiàn)[M-Na]-峰，以[M-Na]-為母離子進(jìn)行碰撞解離，通過(guò)子離子掃描，得到碎片離子m/z57.0[M-Na-HF]-和m/z33.0[M-Na-COO]-，示于圖1。然后，優(yōu)化去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)，使子離子的信號(hào)達(dá)到最強(qiáng)，優(yōu)化后的結(jié)果顯示：m/z33.0碎片離子響應(yīng)值較低，約為m/z57.0的10%，且基線較高，檢測(cè)實(shí)際樣品時(shí)干擾峰較多，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)僅選擇m/z77.0>57.0作為定量離子對(duì)。同時(shí)設(shè)定合適的峰駐留時(shí)間以確保色譜峰的采樣點(diǎn)數(shù)在15～20之間，以得到較好的定量重復(fù)性。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見(jiàn)1.3.3節(jié)。

2.2 離子色譜條件優(yōu)化

氟乙酸鈉為弱酸鹽，lgKow為-3.89，水溶性強(qiáng)，使用常規(guī)反相色譜柱不能保留，文獻(xiàn)中有采用反相機(jī)理的Waters Aquity CSH Fluoro-Phenyl色譜柱進(jìn)行分離[1]，也有采用親水相互作用色譜(Hilic)機(jī)理的Waters Atlantis Hilic色譜柱進(jìn)行分離[7]，但氟乙酸鈉的保留均不理想，且易受樣品基質(zhì)影響，保留時(shí)間不穩(wěn)定[9]。離子色譜適用于氟乙酸鈉的分離[10-11]，采用高容量AS19陰離子交換色譜柱，先用5 mmol/L KOH對(duì)樣品中氟乙酸鈉進(jìn)行分離，然后用50 mmol/L KOH對(duì)色譜柱進(jìn)行淋洗以去除強(qiáng)保留成分，色譜柱流出液經(jīng)陰離子抑制器去除K+，流動(dòng)相中KOH轉(zhuǎn)化成水，直接進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。采用0.5 mL帶濾頭的自動(dòng)進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣前先用1 mL水清洗進(jìn)樣管路，進(jìn)樣1 300 μg/L氟乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液后，再進(jìn)一針空白，結(jié)果表明，無(wú)氟乙酸鈉殘留。優(yōu)化后的色譜條件見(jiàn)1.3.2節(jié)。

2.3 樣品前處理方法優(yōu)化

2.3.1提取劑的選擇 氟乙酸為弱酸性水溶化合物，pKa 2.73[8]，在pH<2的酸性條件下可被乙酸乙酯萃取[12-13]。奶粉樣品富含蛋白、乳糖、脂肪和礦物質(zhì)等，選擇3%高氯酸作為提取劑對(duì)奶粉進(jìn)行超聲提取，經(jīng)低溫高速離心后取中間層提取液，可去除大部分蛋白和脂肪等雜質(zhì)，此時(shí)提取液的pH值為0.5～1.0；此條件下氟乙酸呈分子狀態(tài)，易被有機(jī)溶劑萃取，在萃取液中加入100 μL 1%氨水丙酮溶液，使氟乙酸生成氟乙酸銨鹽，避免其在氮?dú)獯蹈蛇^(guò)程中損失，再用0.1%氨水溶解殘?jiān)?，?jīng)0.2 μm濾膜濾除脂溶性雜質(zhì)。稱取0.50 g奶粉樣品，加標(biāo)10 ng氟乙酸鈉，測(cè)定氟乙酸鈉的響應(yīng)值，再與0.50 g奶粉樣品處理液加標(biāo)10 ng氟乙酸鈉的響應(yīng)值進(jìn)行比較，計(jì)算出高氯酸作為提取劑的提取率約為86%。

2.3.2萃取劑的選擇 稱取0.50 g奶粉樣品，加標(biāo)10 ng氟乙酸鈉，分別用5.0 mL叔丁基甲醚和乙酸乙酯萃取。結(jié)果表明，叔丁基甲醚作為萃取劑的氟乙酸鈉響應(yīng)值比乙酸乙酯作為萃取劑的響應(yīng)值高20%，故選擇叔丁基甲醚作為萃取劑。

2.3.3提取液pH值的優(yōu)化 取7份奶粉的高氯酸提取液，用高氯酸或氨水調(diào)pH值分別為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0和5.0，再加入20 ng氟乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，用5.0 mL叔丁基甲醚萃取2次后測(cè)定，繪制pH值-氟乙酸鈉響應(yīng)曲線，示于圖2。結(jié)果表明，在pH 0.5～1.0范圍內(nèi)，氟乙酸鈉的響應(yīng)值最高，故選擇提取液pH值范圍為0.5～1.0。

圖2 pH值對(duì)叔丁基甲醚萃取氟乙酸鈉的影響Fig.2 Effect of pH on sodium monofluoroacetate extracted by methyl tert-butyl ether

2.3.4萃取次數(shù)的選擇 將處于pH 0.5～1.0的高氯酸提取液加標(biāo)10 ng氟乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，用5.0 mL叔丁基甲醚萃取3次，測(cè)定每次氟乙酸鈉的萃取量，通過(guò)除以3次萃取總量計(jì)算每次的萃取率。第1次叔丁基甲醚的萃取率約為60%，第2次約為30%，兩次的總萃取率約為90%，最終選擇采用5.0 mL叔丁基甲醚萃取2次。

2.3.5鹽析效應(yīng) 本實(shí)驗(yàn)考察了鹽析效應(yīng)對(duì)氟乙酸鈉萃取率的影響，在高氯酸提取液中加標(biāo)10 ng氟乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入2.0 g氯化鈉后測(cè)定，并與不加氯化鈉的結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)鹽析效應(yīng)對(duì)氟乙酸鈉的萃取率無(wú)明顯影響，故實(shí)際樣品萃取時(shí)無(wú)需加入氯化鈉進(jìn)行鹽析。

2.3.6基質(zhì)效應(yīng) 本實(shí)驗(yàn)采用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，可有效校正樣品中的基質(zhì)效應(yīng)。取空白嬰幼兒配方奶粉得到空白處理液，加入氟乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/L)，與溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/L)相比評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)[14]，嬰幼兒配方奶粉中氟乙酸鈉的基質(zhì)抑制效應(yīng)約為33%。

2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限

將氟乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成濃度分別為0.3、1.0、5.0、50.0、100、600、1 300 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(含130 μg/L13C2-氟乙酸鈉同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液)，采用MultiQuant定量軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以定量離子對(duì)與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(y)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列濃度(x，μg/L)進(jìn)行線性回歸(權(quán)重取1/x)，回歸方程為y=0.016 7x+0.002 55，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，線性關(guān)系良好、線性范圍較寬。

向空白奶粉中加入低濃度氟乙酸鈉溶液，以分子離子對(duì)信噪比S/N≥3的樣品濃度作為檢出限(LOD)，以S/N≥10的樣品濃度作為定量限(LOQ)，測(cè)得方法的檢出限和定量限分別為0.2、0.6 μg/kg，測(cè)定上限為2.6 mg/kg?？瞻缀图訕?biāo)氟乙酸鈉嬰幼兒配方奶粉的IC-MS/MS色譜圖示于圖3。

圖3 空白嬰幼兒配方奶粉(a,c)和0.6 μg/kg加標(biāo)水平嬰幼兒配方奶粉加標(biāo)樣品(b,d)的IC-MS/MS色譜圖Fig.3 IC-MS/MS chromatograms of blank infant formula (a,c) and infant formula added with sodium monofluoroacetate at 0.6 μg/kg (b,d)

2.5 加標(biāo)回收率和精密度

向空白嬰兒配方奶粉和全脂奶粉樣品中添加不同濃度的氟乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，放置1 h，使待測(cè)成分與樣品基體成分相互作用達(dá)到平衡，再按1.3.1節(jié)方法處理樣品，其回收率和精密度結(jié)果列于表1。結(jié)果表明：氟乙酸鈉的加標(biāo)回收率在89.7%～104%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.50%～11%范圍內(nèi)，符合痕量分析的要求。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用該方法檢測(cè)了5種進(jìn)口嬰幼兒配方奶粉和3種全脂奶粉，均未檢出氟乙酸鈉。

3 結(jié)論

本研究采用離子色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定奶粉中氟乙酸鈉。通過(guò)優(yōu)化樣品的前處理過(guò)程，達(dá)到了較好的樣品凈化效果，降低了基質(zhì)效應(yīng)；通過(guò)優(yōu)化離子色譜和質(zhì)譜條件，得到了較好的分離效果和檢測(cè)靈敏度；采用穩(wěn)定同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法定量分析，結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。本方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、線性范圍寬，可用于奶粉中氟乙酸鈉的日常檢測(cè)，也可應(yīng)用于相似基質(zhì)食品中氟乙酸鈉的測(cè)定。

表1 在不同添加水平下，奶粉中氟乙酸鈉的回收率和精密度(n=6)Table 1 Recoveries and RSDs of sodium monofluoroacetate at different spiked levels in dairy powders samples (n=6)