基于特征性子離子和中性丟失快速篩查和識(shí)別食品中唑類和有機(jī)磷類農(nóng)藥

郭天洋，李 楊，董益陽，白 樺，馬 強(qiáng)

(1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048；3.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029)

農(nóng)產(chǎn)品在種植過程中，通常會(huì)噴灑農(nóng)藥以預(yù)防病蟲害，但如果噴灑時(shí)機(jī)不適宜，或超范圍、超劑量使用農(nóng)藥，則容易產(chǎn)生農(nóng)藥殘留問題[1]。根據(jù)作用類型，農(nóng)藥可分為唑類、有機(jī)磷類等。唑類農(nóng)藥用途廣，可作為殺蟲劑、殺真菌劑、除藻劑、植物生長(zhǎng)延緩劑等[2-3]，包括三唑類、咪唑類、吡唑類等。其中，三唑類含有三唑基團(tuán)；咪唑類和吡唑類分別含有咪唑基團(tuán)和吡唑基團(tuán)，二者互為同分異構(gòu)體。有機(jī)磷類農(nóng)藥包括磷酸酯類和硫代磷酸酯類，大多具有劇毒和高毒，少數(shù)低毒，常被用作殺菌劑、殺蟲劑、滅鼠劑等[4-5]。

質(zhì)譜技術(shù)靈敏度高、特異性好、分析速度快、專屬性強(qiáng)，近年來發(fā)展迅速。對(duì)于已知的農(nóng)藥組分，傳統(tǒng)的質(zhì)譜定性、定量分析方法通常使用農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[6]。但對(duì)于未知農(nóng)藥組分，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)很難及時(shí)獲取，定性、定量難度較大，亟需尋求新的解決方案[7-8]。

2004年，Cooks教授[9]提出電噴霧解吸電離(desorption electrospray ionization, DESI)；2005年，Cody博士[10]提出實(shí)時(shí)直接分析(direct analysis in real time, DART)。這兩項(xiàng)具有里程碑意義的敞開式離子化質(zhì)譜技術(shù)(ambient ionization mass spectrometry, AIMS)[11]為質(zhì)譜快速檢測(cè)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。2010年，Cooks和Ouyang教授[12]提出紙噴霧電離(paper spray, PS)，將敞開式離子化技術(shù)簡(jiǎn)單化，無需色譜分離，大大提高了分析效率。近年來，AIMS的應(yīng)用范圍日益廣泛，涵蓋了食品安全[13]、臨床醫(yī)學(xué)[14]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[15]、工業(yè)品分析[16]、法醫(yī)化學(xué)[17]等眾多領(lǐng)域。

具有相似的官能團(tuán)或化學(xué)結(jié)構(gòu)的同一類待測(cè)物，在二級(jí)質(zhì)譜碎裂過程中表現(xiàn)出相似的行為特征。通過歸納這些特征，有助于識(shí)別該類未知物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。有研究人員采用不同的敞開式離子化質(zhì)譜技術(shù)基于中性丟失開展了相關(guān)研究。例如，He等[18]采用DART-MS基于共同的中性丟失CH3OH研究了甲基化的皂甙和低聚糖；Wang等[19]應(yīng)用大氣壓固體分析探針(atmospheric pressure solids analysis probe, ASAP)，根據(jù) H2O、CH2O、CO、CH3OH、CO2等中性丟失，分析煤相關(guān)的模型化合物。也有研究人員根據(jù)子離子信息開展相關(guān)研究，例如，Oradu等[20]使用PS-MS根據(jù)子離子磷酸膽堿研究極性脂質(zhì)。為提高定性分析的準(zhǔn)確性，除了可以采用二級(jí)或多級(jí)質(zhì)量分析器來增加質(zhì)譜碎裂次數(shù)，還可使用飛行時(shí)間(time-of-flight, TOF)或靜電場(chǎng)軌道阱(Orbitrap)質(zhì)量分析器以提高質(zhì)譜分辨率[21]。四極桿與靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)量分析器的聯(lián)用(quadrupole-Orbitrap, Q-Orbitrap)不僅可以得到高分辨的一級(jí)質(zhì)譜信息，同時(shí)還可以得到對(duì)應(yīng)的高分辨二級(jí)質(zhì)譜信息，由此區(qū)分質(zhì)荷比相似的待測(cè)物，從而排除假陽性和假陰性信息，提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性[22]。

本研究擬建立基于中性丟失和子離子的敞開式離子化技術(shù)結(jié)合高分辨二級(jí)質(zhì)譜的分析方法，用于識(shí)別和篩查食品中唑類和有機(jī)磷類農(nóng)藥，希望為食品中農(nóng)藥檢測(cè)提供新方法和新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Q Exactive四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀：美國Thermo公司產(chǎn)品，配有TraceFinder Version 4.0數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)；DART敞開式離子源：美國IonSense公司產(chǎn)品，接口與Q Exactive質(zhì)譜儀配套，配有12位玻璃棒進(jìn)樣模塊和10孔篩網(wǎng)透射進(jìn)樣模塊；PS離子源：自行搭建，由一個(gè)鱷魚形銅夾和一片三角形色譜紙(長(zhǎng)12 mm×高18 mm)組成，通過連接鱷魚形銅夾與高壓電源，將噴霧溶劑施加于三角形色譜紙底部。

將Q Exactive質(zhì)譜儀的質(zhì)量分析器每周用調(diào)諧液調(diào)諧一次。在使用DART之前，質(zhì)譜離子源接口換成自帶VAPUR接口，連接真空泵，安裝之后識(shí)別成NSI源。使用PS之前，需要連接電阻模塊，以便識(shí)別成NSI源。質(zhì)譜數(shù)據(jù)分別在正離子模式和負(fù)離子模式下進(jìn)行采集。

1.2 主要材料與試劑

甲醇、乙腈、丙酮、甲苯：色譜純，美國Fisher Scientific公司產(chǎn)品；咪唑類、吡唑類、三唑類、有機(jī)磷類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：均為德國Dr. Ehrenstorfer公司產(chǎn)品，于-20 ℃儲(chǔ)存；用于DART載氣的高純氦氣和用于質(zhì)譜干燥氣的高純液氮：北京氦普北分氣體工業(yè)有限公司產(chǎn)品；Whatman 1ET色譜紙：美國GE公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1離子化條件 毛細(xì)管溫度：320 ℃；微掃描次數(shù)：1；PS噴霧電壓：3.5 kV；反向干燥氣流速：2 L/min ；默認(rèn)電荷態(tài)：1；DART載氣溫度：350 ℃；載氣流速：2.7 L/min；泵吸力：-90 kPa；DART口與陶瓷管入口間距：25 mm；陶瓷管出口與質(zhì)譜毛細(xì)管入口間距：1 mm。

1.3.2質(zhì)譜采集條件 全掃描(full scan, FS)模式：分辨率70 000；自動(dòng)增益控制(AGC target)：1×106；離子最大注入時(shí)間50 ms；質(zhì)量掃描范圍m/z50～750。全離子碎裂(all-ion fragmentation, AIF)模式：分辨率70 000；自動(dòng)增益控制1×106；離子最大注入時(shí)間50 ms；質(zhì)量掃描范圍m/z50～750；階梯(歸一化)碰撞能量(stepped (N)CE)25、35、45 eV。二級(jí)質(zhì)譜(MS2)參數(shù)：分辨率35 000；自動(dòng)增益控制2×105；離子最大注入時(shí)間50 ms；循環(huán)次數(shù)為1；TopN為10；隔離窗口m/z0.4；階梯(歸一化)碰撞能量25、35、45 eV。數(shù)據(jù)依賴采集設(shè)定參數(shù)：最小自動(dòng)增益控制1×104；觸發(fā)值2×105；動(dòng)態(tài)排除120 s。

1.4 基于子離子和中性丟失的識(shí)別和篩查

子離子和中性丟失均是待測(cè)物在質(zhì)譜中的特征反應(yīng)，大部分農(nóng)藥的母離子和對(duì)應(yīng)的子離子通常都帶有1個(gè)電荷。此時(shí)，中性丟失的質(zhì)量數(shù)是母離子和子離子質(zhì)量數(shù)的差值，即母離子失去1個(gè)中性丟失得到子離子，中性丟失不帶電。研究子離子和中性丟失，可以在數(shù)據(jù)采集或處理過程中實(shí)現(xiàn)。

在數(shù)據(jù)采集過程中，可使用三重四極桿(triple quadrupole, QqQ)質(zhì)量分析器檢測(cè)，分別采用子離子掃描模式和中性丟失掃描模式得到特征子離子和中性丟失信息。但QqQ質(zhì)量分析器的分辨率較低，容易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。Q-Orbitrap作為高分辨質(zhì)量分析器，可以完成更精準(zhǔn)的中性丟失篩選。具體操作為：使用TraceFinder軟件自帶的FS MS/AIF/NL dd-MS2組合模式，先進(jìn)行全掃描，再進(jìn)行全離子碎裂;然后，根據(jù)FS和AIF的差值自動(dòng)選擇符合中性丟失規(guī)則的母離子，若無，則為陰性,若有，則為陽性;最后，通過dd-MS2模式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。

在數(shù)據(jù)處理過程中，可利用敞開式離子源無需色譜分離的特點(diǎn)，通過FS和AIF模式得到所有待測(cè)物的母離子和子離子。通過軟件處理，可以得到所有的中性丟失，并排除不符合要求的中性丟失。根據(jù)子離子和中性丟失可以實(shí)現(xiàn)已知農(nóng)藥的篩查和未知農(nóng)藥的識(shí)別。

1.5 不同樣品的敞開式離子化方式

不同類型的食品樣品可采用不同的敞開式離子化方式。若使用DART-Q-Orbitrap HRMS檢測(cè)，液體樣品需要進(jìn)行液-液萃取，如果基質(zhì)較復(fù)雜，可使用QuEChERS制樣方式；粉末固體樣品需要通過乙腈溶劑進(jìn)行固-液萃取，或者壓片后直接進(jìn)行DART檢測(cè)；塊狀固體樣品可用DART直接檢測(cè)，必要時(shí)配合適宜的解吸附方法，如加熱、溶劑噴霧、激光輔助等；氣體樣品可通過固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)吸附，然后進(jìn)行DART檢測(cè)；氣溶膠樣品可噴到DART篩網(wǎng)上進(jìn)樣分析。若使用PS-Q-Orbitrap HRMS檢測(cè)，液體樣品可以直接進(jìn)樣或者經(jīng)稀釋萃取后加樣至三角形紙基上進(jìn)樣分析，也可以利用色譜紙介質(zhì)吸附基質(zhì)，先點(diǎn)樣于紙基上，干燥后加入解吸溶劑進(jìn)樣分析；固體和半固體樣品可涂抹于三角形紙基上，加入解吸溶劑進(jìn)樣分析；塊狀固體可剪出尖，滴加解吸溶劑噴霧進(jìn)樣分析；氣溶膠樣品可噴至三角形紙基上，滴加解吸溶劑噴霧進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

本研究提到的中性丟失包括共性特征中性丟失(如唑環(huán))、輔助定性中性丟失(如甲基)和農(nóng)藥特有中性丟失(待測(cè)物高響應(yīng)的子離子對(duì)應(yīng)的中性丟失)；子離子包括共性特征子離子(如質(zhì)子化的唑環(huán))、輔助定性子離子(如質(zhì)子化的甲基)和農(nóng)藥特有子離子(待測(cè)物高響應(yīng)對(duì)應(yīng)的子離子)。

2.1 唑類農(nóng)藥特征子離子和中性丟失

唑類結(jié)構(gòu)是含有氮原子和至少1個(gè)非碳原子(氮、硫、氧)的五元雜環(huán)，含有2個(gè)雙鍵，包括只含氮的咪唑、吡唑、三唑等，含有氮和氧的惡唑、異惡唑、惡二唑，以及含有氮和硫的噻唑、異噻唑、噻二唑等。農(nóng)藥中常見的咪唑、吡唑和三唑結(jié)構(gòu)示于圖1。

圖1 咪唑(a)、吡唑(b)、1,2,3-三唑(c)和1,2,4-三唑(d)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of imidazole (a), pyrazole (b), 1,2,3-triazole (c) and 1,2,4-triazole (d)

三唑類農(nóng)藥均含有三唑基團(tuán)，其分子式為C2H3N3，精確分子質(zhì)量為69.032 70，質(zhì)子化的三唑([M+H]+)為C2H4N3+，精確質(zhì)荷比為70.039 97。在高分辨二級(jí)質(zhì)譜中，大部分三唑類農(nóng)藥均產(chǎn)生質(zhì)子化的三唑離子([M+H]+)，少數(shù)三唑類農(nóng)藥產(chǎn)生三唑(M)中性丟失。因此，根據(jù)共性特征子離子m/z70.039 97和共性特征中性丟失69.032 70即可對(duì)三唑類農(nóng)藥進(jìn)行篩查和識(shí)別，結(jié)果列于表1。此外，含有三唑環(huán)的同系物也有類似的共性特征中性丟失，即C2H3N3(CH2)m，據(jù)此可間接推算三唑類農(nóng)藥的歸屬。

咪唑和吡唑互為同分異構(gòu)體，分子式均為C3H4N2，精確分子質(zhì)量為68.037 45，質(zhì)子化的咪唑和吡唑([M+H]+)均為C3H5N2+，精確質(zhì)荷比為69.044 72。同理，根據(jù)共性特征子離子m/z69.044 72和共性特征中性丟失 68.037 45即可對(duì)咪唑或吡唑類農(nóng)藥進(jìn)行篩查。

表1 唑類農(nóng)藥的共性特征中性丟失和子離子Table 1 Common characteristic neutral losses and product ions of azole pesticides

注：*為同系物的中性丟失/子離子增加(CH2)m，精確質(zhì)量/質(zhì)荷比增加14.015 10m，m=0,1,2…

此外，本研究整理了三唑、咪唑、吡唑類農(nóng)藥的其他常見中性丟失結(jié)構(gòu)，這些信息可用于未知唑類農(nóng)藥的輔助定性，相關(guān)基團(tuán)包括苯基、氯苯基、二氯苯基、氟苯基、硅烷基等，結(jié)果列于表2。

表2 唑類農(nóng)藥的輔助定性子離子Table 2 Auxilliary qualitative product ions of azole pesticides

2.2 有機(jī)磷類農(nóng)藥特征子離子和中性丟失

有機(jī)磷類農(nóng)藥包括磷酸酯類和硫代磷酸酯類，其分子式為(P=Z)(OR1)(OR2)X，結(jié)構(gòu)示于圖2。其中，Z為氧或硫，一般R1和R2相同，多為甲氧基(—OCH3)或乙氧基(—OC2H5)，也可為丙氧基(—OC3H7)、甲硫基(—SCH3)或乙硫基(—SC2H5)等，X為烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫或其他取代基團(tuán)。磷連接的基團(tuán)不同，通常毒性也不同。例如，乙氧基比甲氧基毒性強(qiáng)，強(qiáng)酸根比弱酸根毒性強(qiáng)，氧原子比硫原子毒性強(qiáng)。

圖2 有機(jī)磷農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structure of organophosphorus pesticides

在二級(jí)質(zhì)譜模式下，有機(jī)磷農(nóng)藥可能產(chǎn)生多種共性特征中性丟失和子離子，如PO4H3(CH2)m、PO3SH3(CH2)m、PO2S2H3(CH2)m、PO3H(CH2)m、PO2SH(CH2)m、POS2H(CH2)m、POSH(CH2)m等，結(jié)果列于表3。其中，質(zhì)子化的磷酸根離子[PO4H3+H]+(m/z98.984 17)是大部分生物組分的二級(jí)子離子，不是有機(jī)磷農(nóng)藥的特有離子，予以排除。值得注意的是，有些子離子比較特殊，如子離子m/z171.023 93可能是[(P=S)(EtO)2OH+H]+、[(P=O)(EtO)2SH+H]+，或由[(P=S)(EtO)2SH+H]+氧化得到。

此外，還整理了有機(jī)磷類農(nóng)藥常見的輔助定性中性丟失和子離子，結(jié)果列于表4，這些結(jié)構(gòu)可以輔助定性未知有機(jī)磷農(nóng)藥。中性丟失包括同系物(CH2)m、H2O(CH2)m、H2S(CH2)m、NH3(CH2)m，子離子包括C6H5CH2+、C6H5S+、C6H5OH+等。

表3 有機(jī)磷類農(nóng)藥的共性特征中性丟失和子離子Table 3 Common characteristic neutral losses and product ions of organophosphorus pesticides

注：*為同系物的中性丟失/子離子增加(CH2)m，精確質(zhì)量/質(zhì)荷比增加14.015 10m，m=0,1,2…

表4 有機(jī)磷類農(nóng)藥的輔助定性中性丟失和子離子Table 4 Auxilliary qualitative neutral losses and product ions of organophosphorus pesticides

注：*為同系物的中性丟失/子離子增加(CH2)m，精確質(zhì)量/質(zhì)荷比增加14.015 10m，m=0,1,2…

圖3 唑類農(nóng)藥(腈菌唑)的全碎裂質(zhì)譜圖Fig.3 Full ion fragmentation spectrum of azole pesticide (myclobutanil)

2.3 篩查和識(shí)別唑類和有機(jī)磷類農(nóng)藥

建立了唑類農(nóng)藥和有機(jī)磷類農(nóng)藥的共性特征子離子和中性丟失庫，以及輔助定性子離子和中性丟失庫，用于子離子和中性丟失的檢索。

本實(shí)驗(yàn)在數(shù)據(jù)處理過程中研究子離子和中性丟失。數(shù)據(jù)采集分為兩個(gè)階段：一是全掃描階段，得到全部待測(cè)物的母離子；二是全離子碎裂階段，得到全部待測(cè)物的全部子離子。每個(gè)時(shí)間段至少有10個(gè)采樣點(diǎn)，保證待測(cè)物檢測(cè)的重現(xiàn)性[23]。PS持續(xù)進(jìn)樣分析，DART可持續(xù)進(jìn)樣或勻速進(jìn)樣模塊取出峰位置的平均值。對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)樣品，可按質(zhì)量范圍分段進(jìn)行。

將采集的高分辨一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Python軟件進(jìn)行處理。首先，將得到的全掃描數(shù)據(jù)去掉重同位素峰，只保留輕同位素峰；去掉多聚體峰，只保留單體；將[M+Na]+、[M+K]+和[M+NH4]+的母離子全部轉(zhuǎn)化為[M+H]+。然后，將得到的母離子和子離子逐對(duì)相減，分別得到中性丟失。將全部子離子和中性丟失在對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)庫中檢索，篩查已知農(nóng)藥，識(shí)別未知農(nóng)藥。

代表性的唑類農(nóng)藥腈菌唑的全碎裂質(zhì)譜圖示于圖3。其最高響應(yīng)強(qiáng)度子離子m/z70.040 66為質(zhì)子化的唑環(huán)，次高響應(yīng)強(qiáng)度子離子m/z125.015 19為輔助定性子離子，符合相關(guān)規(guī)律。

9種有機(jī)磷類農(nóng)藥的全掃描和全碎裂質(zhì)譜圖示于圖4。由圖可見，有機(jī)磷類農(nóng)藥的母離子多為[M+H]+和[M+Na]+，子離子包含共性特征和輔助定性子離子，m/z114.961 28、127.015 25、142.992 22出現(xiàn)頻次較高，符合相關(guān)規(guī)律。相似地，中性丟失包含共性特征和輔助定性中性丟失，m/z136.028 38、141.984 80出現(xiàn)頻次較高，符合相關(guān)規(guī)律。

按照上述流程，根據(jù)質(zhì)譜庫識(shí)別了不同食品樣品(葡萄酒、蘋果、大米)中的農(nóng)藥，結(jié)果表明，未發(fā)現(xiàn)已知農(nóng)藥和未知農(nóng)藥。

注：1.甲胺磷；2.氧化樂果；3.敵敵畏；4.樂果；5.甲拌磷；6.水胺硫磷；7.喹硫磷；8.二嗪農(nóng)；9.馬拉硫磷；“’”表示相應(yīng)的子離子圖4 9種有機(jī)磷類農(nóng)藥的全掃描(a)和全碎裂(b)質(zhì)譜圖Fig.4 Full scan spectrum (a) and all-ion fragmentation spectrum (b) of 9 organophosphorus pesticides

3 結(jié)論

本研究基于待測(cè)物在敞開式離子化高分辨二級(jí)質(zhì)譜中的子離子和中性丟失，建立了篩查已知農(nóng)藥和識(shí)別未知農(nóng)藥的快速分析方法。通過歸納唑類農(nóng)藥(三唑類、咪唑、吡唑)和有機(jī)磷類農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)及質(zhì)譜碎裂行為，得到兩類農(nóng)藥的數(shù)據(jù)庫，包括共性特征子離子和中性丟失庫，以及輔助定性子離子和中性丟失庫。將敞開式離子化技術(shù)與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用，可快速得到待測(cè)物的母離子、子離子和中性丟失信息，經(jīng)數(shù)據(jù)處理，篩查和識(shí)別農(nóng)藥成分。該方法準(zhǔn)確可靠，適用于食品中農(nóng)藥的篩查識(shí)別。