己糖激酶2通過抑制線粒體凋亡通路減少LPS引起的人肺上皮BEAS-2B細(xì)胞凋亡*

李淑芬， 宋卓慧， 李 婷， 孫 婧， 范毅敏， 劉 燕△

(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院 1生理學(xué)教研室， 2機(jī)能綜合實(shí)驗(yàn)室， 山西 長(zhǎng)治 046000)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是一種嚴(yán)重的臨床疾病，主要以炎癥和急性呼吸衰竭為特征[1]，由于其常伴有多器官衰竭以及較高的死亡率，因此該疾病備受關(guān)注[2]。炎癥反應(yīng)的失調(diào)、白細(xì)胞和血小板的異常招募和激活以及肺上皮細(xì)胞通透性的改變等均是ARDS的核心病理事件，它們協(xié)同作用造成炎癥反應(yīng)的爆發(fā)以及凋亡的發(fā)生，從而導(dǎo)致呼吸膜的形態(tài)和功能損傷[3-4]。盡管很多臨床試驗(yàn)對(duì)一些藥理學(xué)干預(yù)手段進(jìn)行了評(píng)估，但是至今仍沒有有效藥物能顯著減少該疾病的死亡率[5]。因此，對(duì)于該疾病的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行深入探討顯得尤為重要。

近來年，越來越多研究表明代謝酶除了發(fā)揮已知的代謝功能，還具有其它新的作用[6-8]。而其中，作為糖酵解途徑的第一個(gè)限速酶，己糖激酶(hexokinase，HK)的研究也日益引起人們的關(guān)注。在哺乳動(dòng)物中，己糖激酶有4個(gè)家族成員[9]，其中HK1在各組織內(nèi)廣泛表達(dá)，而HK2的表達(dá)主要是在一些胰島素敏感的組織和腫瘤中[10]。不同于其它糖酵解過程中的酶，HK主要定位于線粒體[11]。除了在糖酵解過程中的經(jīng)典作用，HK2被證明還可以通過抗氧化、抑制線粒體依賴的凋亡事件以及促進(jìn)自噬過程等多種途徑對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用[9]。在肺上皮細(xì)胞方面，Ahmad等[12]研究表明，過表達(dá)HK2通過保護(hù)線粒體而抑制缺氧/復(fù)氧造成的肺上皮樣細(xì)胞A549氧化應(yīng)激損傷；Yao等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Dicer通過調(diào)節(jié)miRNAs表達(dá)，進(jìn)一步上調(diào)HK2表達(dá)，逆轉(zhuǎn)低氧誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡。由此我們可以看到，HK將能量產(chǎn)生、細(xì)胞生存途徑、線粒體穩(wěn)態(tài)維持、免疫反應(yīng)等多種反應(yīng)有效整合起來，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。

脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)來源于革蘭氏陰性細(xì)菌，是造成感染性休克的主要原因之一[14]，同時(shí)也可造成肺損傷和肺泡細(xì)胞的凋亡[1, 15-16]。由于炎癥反應(yīng)在ARDS的發(fā)生和發(fā)展中是一重要病理因素，因此在本研究中我們將LPS作用于人肺上皮細(xì)胞BEAS-2B，觀察LPS對(duì)細(xì)胞活力和凋亡的作用，以及HK2是否可以對(duì)該過程產(chǎn)生影響。我們期待本研究能為ARDS的分子機(jī)理提供新的解釋，并為ARDS治療提供潛在靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B購(gòu)自于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection， ATCC)。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS; Gibco，10099-141)；高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，11965-084)；胰蛋白酶(Thermo Fisher Scientific，25200056)；CCK-8染色液和抗細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)抗體(碧云天)；Annexin V/PI染色試劑盒(BioTools，B32117)；抗HK2抗體(Santa Cruz，sc-6521)；抗凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor,AIF)抗體(Abcam，ab220215)；抗Bax和Bcl-2抗體(Cell Signaling Technology，2772和4223)；抗α-tubulin抗體(Bioworld，AP0064)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) BEAS-2B細(xì)胞生長(zhǎng)于含有10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，使用含有EDTA的0.25% 胰蛋白酶將細(xì)胞消化，用培養(yǎng)基重懸后接種于不同器皿中進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 細(xì)胞按照每孔4 000個(gè)的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，給予相應(yīng)處理結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK-8染色液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h后，在450 nm處測(cè)定各孔吸光度(A)值。

2.3Hoechst 33342染色鑒定細(xì)胞凋亡 細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后給予各種處理。處理至相應(yīng)時(shí)間后加入Hoechst 33342溶液，工作液終濃度為50 mg/L。染色30 min后去除上清，使用PBS緩沖液洗滌3次,每次5 min。洗滌結(jié)束后利用尼康熒光顯微鏡進(jìn)行成像以觀察細(xì)胞核染色狀況。

2.4Annexin V/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)處理結(jié)束后以胰蛋白酶消化利用PBS緩沖液重懸獲取單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×109/L，根據(jù)說明書利用Annexin V/PI染色試劑避光染色30 min后，立即用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀況并進(jìn)行分析。

2.5Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中給予相應(yīng)處理至相應(yīng)時(shí)間。結(jié)束后，利用真空泵去除上清并以預(yù)冷PBS緩沖液洗滌細(xì)胞。徹底去除PBS，加入200 μL細(xì)胞裂解液。利用BCA法將各組樣品定量至相同濃度后，取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至甲醇預(yù)活化的PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件為恒壓100 V，時(shí)間為2 h。之后利用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h并孵育相應(yīng)抗體， 4 ℃過夜；次日，以TBST洗滌后室溫孵育相應(yīng) II 抗，1 h后利用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。

2.6免疫熒光法檢測(cè)HK2亞細(xì)胞定位 BEAS-2B細(xì)胞接種于confocal專用8連孔中，處理結(jié)束后加入MitoTracker probes染色20 min進(jìn)行線粒體定位。染色結(jié)束后利用PBS洗滌5 min后使用4%多聚甲醛在室溫下進(jìn)行固定15 min，之后使用PBST洗滌3次,每次5 min。接下來使用0.1% Triton進(jìn)行穿孔，同上再次洗滌。按照說明書推薦濃度加入相應(yīng)抗體，4 ℃孵育過夜。次日孵育結(jié)束后，加入相應(yīng) II 抗在37 ℃孵育1 h,利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像。

2.7BEAS-2B細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HK2過表達(dá)質(zhì)粒 細(xì)胞接種于6孔板中，貼壁后利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染攜帶eGFP的HK2過表達(dá)質(zhì)粒，24 h后更換為新鮮培養(yǎng)基。根據(jù)說明書具體操作如下，首先在250 μL Opti-MEM中加入Lipofectamine 3000 5 μL；其次在250 μL Opti-MEM中加入質(zhì)粒1 μg和P3000 3 μL，混合均勻；將上述質(zhì)粒DNA混合物加入Lipofectamine 3000混合物中，室溫下孵育5 min再加入細(xì)胞2.5 mL培養(yǎng)基中。

2.8提取線粒體以檢測(cè)線粒體和細(xì)胞漿的Cyt C以及AIF蛋白 將BEAS-2B細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，給予LPS或者在HK2過表達(dá)后給予LPS處理，之后消化細(xì)胞室溫下100×g離心10 min以收集細(xì)胞。按照線粒體提取試劑盒說明書(碧云天，C3601)進(jìn)行操作提取線粒體。保留線粒體和去除線粒體成分的細(xì)胞漿提取物進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)Cyt C和AIF蛋白的亞細(xì)胞分布。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，并利用GraphPad Prism軟件進(jìn)行后續(xù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)于兩組定量資料和多組定量資料的比較，數(shù)據(jù)在滿足正態(tài)分布和方差齊的條件下，分別采用雙側(cè)t檢驗(yàn)和單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LPS刺激導(dǎo)致肺上皮BEAS-2B細(xì)胞活力下降

用不用濃度(0、1、10和100 mg/L)的LPS處理BEAS-2B細(xì)胞，24 h后檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，LPS可以呈現(xiàn)劑量依賴性地使BEAS-2B細(xì)胞活力下降。當(dāng)LPS濃度為10 mg/L和100 mg/L時(shí)，細(xì)胞活力分別為對(duì)照組的69.36%和41.37%，較對(duì)照組顯著降低(P<0.01)。另選取100 mg/L LPS分別作用于BEAS-2B細(xì)胞12、24和48 h，在經(jīng)過不同處理時(shí)間后，細(xì)胞活力隨作用時(shí)間延長(zhǎng)顯著下降(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. LPS decreased the viability of BEAS-2B cells in a dose- and time-dependent manner. Mean±SD.n=4.##P<0.01vs0 mg/L group;*P<0.05,**P<0.01vs0 h group.

圖1LPS劑量和時(shí)間依賴性地抑制BEAS-2B細(xì)胞活力

2 LPS誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞凋亡

BEAS-2B細(xì)胞給予LPS (100 mg/L)處理24 h后，細(xì)胞核出現(xiàn)明顯固縮和碎裂的形態(tài)(圖中箭頭所示)，見圖2A。使用Annexin V/PI雙染法對(duì)細(xì)胞凋亡狀況進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，在LPS處理后，Annexin V染色陽性的細(xì)胞由2.89%增加至42.4%(圖中右上象限和右下象限之和)(P<0.01)，見圖2、2C。這些結(jié)果提示LPS可以誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞凋亡。

Figure 2.LPS induced BEAS-2B cell apoptosis. A: Hoechst 33342 staining (nuclear pyknosis and nuclear lysis shown by the white arrows，×400); B: flow cytometry with Annexin V/PI double staining. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2LPS刺激誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生凋亡

3 LPS可通過線粒體依賴途徑誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞凋亡

為辨別LPS引起的BEAS-2B細(xì)胞凋亡是通過細(xì)胞外在凋亡途徑還是線粒體凋亡途徑，在LPS刺激之前，我們對(duì)BEAS-2B細(xì)胞分別給予20 μmol/L z-IETD-fmk(caspase 8特異性抑制劑)或z-LEHD-fmk(caspase-9特異性抑制劑)預(yù)孵育1 h。結(jié)果顯示，z-LEHD-fmk顯著抑制LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞活力下降(P<0.01)；而z-IETD-fmk對(duì)該過程卻沒有影響，見圖3A。鑒于caspase-9是介導(dǎo)線粒體凋亡的執(zhí)行分子，我們初步推斷LPS可通過線粒體依賴通路誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞凋亡。Western blot結(jié)果顯示,在給予100 mg/L LPS處理BEAS-2B細(xì)胞12、24和48 h后，線粒體凋亡通路關(guān)鍵分子AIF與促凋亡蛋白Bax的蛋白表達(dá)逐漸增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2的蛋白表達(dá)隨之下降(P<0.01)，提示LPS可通過線粒體依賴通路誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞的凋亡,見圖3B。

4 HK2的表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞凋亡過程

為鑒定HK2是否參與了LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞凋亡過程，首先對(duì)HK2的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，隨著LPS作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HK2的表達(dá)顯著減少(P<0.01)，見圖4A。在BEAS-2B細(xì)胞中轉(zhuǎn)染攜帶eGFP的HK2過表達(dá)質(zhì)粒，48 h后檢測(cè)過表達(dá)效果。結(jié)果顯示，在HK2過表達(dá)之后，細(xì)胞相對(duì)活力由(43.68±8.52)%增加至(88.39±7.25)%(P<0.05),見圖4B、C。

5 HK2通過抑制線粒體依賴通路減少LPS引起的人肺上皮細(xì)胞凋亡

HK2過表達(dá)之后其線粒體定位(圖中紅色和綠色重疊為黃色的部分)相較于LPS單獨(dú)處理組明顯增加，見圖5A。在LPS處理后，BEAS-2B細(xì)胞線粒體提取物中Cyt C和AIF顯著減少，釋放至細(xì)胞漿中增加；而HK2過表達(dá)可使得該過程被逆轉(zhuǎn)(P<0.01)，見圖5B。

討 論

ARDS是一種死亡率極高的疾病，但目前有效干預(yù)策略十分有限，這使得我們迫切需要重新審視或者更加深入認(rèn)識(shí)該疾病的發(fā)生發(fā)展過程。在ARDS的病理過程中，肺上皮細(xì)胞的異常凋亡增加是主要病理表現(xiàn)之一。因此，本研究我們以LPS刺激肺上皮細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞模擬其肺損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，給予LPS刺激后，BEAS-2B存活率降低。有研究表明，細(xì)胞在凋亡過程中伴隨著細(xì)胞核固縮和Annexin V陽性細(xì)胞增加[17-18]。為研究LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B存活率降低，是否與凋亡相關(guān)，本研究采用Hoechest 33342染核和Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)LPS引起了細(xì)胞核固縮和細(xì)胞凋亡，且本研究進(jìn)一步確認(rèn)了LPS可通過線粒體途徑誘導(dǎo)的BEAS-2B凋亡。

Figure 3.LPS induced mitochondria-dependent apoptosis in the BEAS-2B cells. A: z-LEHD-fmk, the specific inhibitor of caspase-9, reversed the pro-apoptotic effect of LPS, whereas caspase-8 inhibitor z-IETD-fmk did not; B: LPS enhanced the expression of AIF and Bax, and suppressed the expression of Bcl-2. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsLPS group;△△P<0.01vs0 h group.

圖3LPS誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞呈現(xiàn)線粒體依賴的凋亡

大量研究表明HK2定位于線粒體，通過維持線粒體結(jié)構(gòu)的完整性從而抑制凋亡事件的發(fā)生[19-21]。為研究HK2是否參與LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞凋亡進(jìn)程，本研究首先檢測(cè)了在LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞凋亡進(jìn)程HK2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的進(jìn)展HK2表達(dá)逐漸降低；而過表達(dá)HK2能逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的活性降低。因已有報(bào)道HK2定位于線粒體[19-21]，本研究針對(duì)線粒體途徑介導(dǎo)凋亡過程的觀察發(fā)現(xiàn)HK2的過表達(dá)可以有效逆轉(zhuǎn)該過程。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生線粒體依賴的凋亡時(shí)，位于線粒體間隙的細(xì)胞色素C和AIF等分子被釋放至細(xì)胞漿中，從而誘發(fā)下游效應(yīng)分子發(fā)生效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，HK2過表達(dá)可阻斷AIF以及細(xì)胞色素C等分子從線粒體釋放至細(xì)胞漿的過程，因此推測(cè)過表達(dá)HK2可以使HK2重新分布于線粒體以維持其結(jié)構(gòu)的完整性從而發(fā)揮了抗凋亡效應(yīng)。越來越多的研究表明，己糖激酶是炎性小體激活過程中的重要調(diào)控子[22]，而失調(diào)的炎癥反應(yīng)也是ARDS的重要病理過程，我們有理由相信HK2可通過多途徑在ARDS或者肺損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。以往研究表明，在LPS誘導(dǎo)的肺損傷過程中，同時(shí)存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)依賴的凋亡，炎性小體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等事件[17, 23-24]。因此，HK2是否可以通過其他途徑發(fā)揮其抵抗LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞凋亡也值得我們進(jìn)一步探討。

Figure 4.HK2 was involved in LPS induced-apoptosis of BEAS-2B cells. A: LPS treatment caused the down-regulation of HK2 in a time-dependent manner; B: after transfection with HK2-ORF plasmid, the expression level of HK2 was determined by Wes-tern blot; C: the results of CCK-8 assay showed that HK2 over-expression reversed the decreased cell viability induced by LPS. Mean±SD.n=4.***P<0.01vs0 h group;##P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsLPS group.

圖4HK2參與LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞凋亡

本研究表明，HK2表達(dá)下調(diào)是LPS誘導(dǎo)BEAS-2B進(jìn)行線粒體依賴性凋亡的必要條件，過表達(dá)HK2可使得HK2重新分布于線粒體從而發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)。本研究為ARDS的分子病理機(jī)制提供了新的解釋，并為其治療提供了潛在的可行靶點(diǎn)。

Figure 5.HK2 over-expression reversed mitochondria-dependent apoptosis of the BEAS-2B cells induced by LPS. A: the distribution of HK2 in mitochondria (the yellow part) was involved in its anti-apoptotic effect (×1 000); B: LPS treatment induced the release of Cyt C and AIF from mitochondrion to cytoplasm, which was reversed by HK2 over-expression. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsLPS group.

圖5HK2過表達(dá)通過抑制線粒體依賴通路逆轉(zhuǎn)LPS引起的BEAS-2B細(xì)胞凋亡