動脈粥樣硬化中CARHSP1基因的表達對缺氧誘導的血管內皮細胞活力凋亡及免疫因子的影響*

蔣娟莉， 劉愛東， 楊 杰

(成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經內科， 四川 成都 610500)

動脈粥樣硬化(artherosclerosis，AS)是一種涉及多基因遺傳、免疫和血管管壁細胞等多階段、多發(fā)性共同長期發(fā)展的復雜疾病，冠狀AS繼續(xù)發(fā)展可造成管腔狹窄和血流量減少，從而使心肌發(fā)生缺血死亡，最終引起進行心肌梗死、猝死、心絞痛和心律失常等疾病[1]。目前在細胞水平上對AS的研究還缺乏確定的細胞系，已得到深度認可的細胞水平的研究報道較為少見，多采用細胞模型構建方法研究在細胞水平上對AS的影響[2]。人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)常被用來觀察和驗證在AS過程中血管內皮細胞的一系列病理變化[3]。鈣調節(jié)熱穩(wěn)定蛋白 1 (calcium-regulated heat stable protein 1，CARHSP1)是一種胞質蛋白，主要存在于外分泌體及P小體中，已被證實是一種蛋白質鈣調磷酸酶的生物底物，近年來的研究顯示CARHSP1是使腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的mRNA保持穩(wěn)定的一種強化劑，而TNF-α可引起血管內皮細胞損傷[4]。有研究顯示，抑制CARHSP1的表達可降低動脈粥樣硬化泡沫細胞中TNF-α的釋放，而激活CARHSP1的表達反之[5]。目前CARHSP1對動脈粥樣硬化血管內皮細胞活力和凋亡的影響及機制研究還未清楚。因此，本研究通過將CARHSP1-siRNA或CARHSP1過表達質粒轉染人臍靜脈內皮細胞，檢測細胞活力及凋亡的變化，并研究其可能的分子機制，為動脈粥樣硬化的分子靶向治療提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 一般資料

收集成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2015年3月～2016年8月經血管造影確診為動脈粥樣硬化患者，共50例，其中男性患者24例，女性患者26例，年齡為50～79歲，平均年齡為(67.4±10.1)歲。所有患者排除曾患有心絞痛、心肌梗死及糖尿病病史。造影診斷指標參照中華醫(yī)學會發(fā)布的《非ST段抬高急性冠狀動脈綜合征診斷和治療指南》及中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā)布的《WS319冠狀動脈粥樣硬化性心臟病診斷標準2010》進行診斷，在進行手術時切除后期患者的斑塊組織。另選擇50例性別和年齡等相匹配的體檢正常志愿者血管組織作為對照組，其中男25例，女25例，年齡47～78歲，平均年齡(66.7±9.1)歲，均符合入選標準。組織標本采集后即可放入液氮罐中保存。本研究通過成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準，與所有的研究對象簽訂知情同意書。

2 主要試劑和儀器

ECM培養(yǎng)基和LipofectamineTM2000轉染試劑盒均購自Gibco；CCK-8細胞活力試劑盒購自碧云天生物技術研究所；膜聯蛋白V(Annexin V)-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細胞凋亡試劑盒購自BD；抗CARHSP1、caspase-3、cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax抗體均購自Abcam。酶標儀購自BioTek；流式細胞儀購自BD。

3 方法

3.1Western blot檢測動脈粥樣硬化斑塊中CARHSP1的蛋白表達 從液氮罐中取出動脈粥樣硬化斑塊及正常組織，加入適量的裂解液充分裂解，離心后收集蛋白，考馬斯亮藍法對蛋白濃度進行測定。取等量蛋白行SDS-PAGE分離，電泳結束后電轉移至PVDF膜，PVDF膜置于封閉液(5%的脫脂奶粉)中封閉1～2 h，加入 I 抗(CARHSP1及內參照GAPDH抗體均按照說明書稀釋)，4 ℃搖擺過夜，洗膜，孵育 II 抗和顯影液，置于室溫環(huán)境中避光30 min，洗膜，以GAPDH為內參照，暗室中ECL顯影。蛋白表達水平以目的條帶灰度值與GAPDH的灰度值比值表示。

3.2細胞培養(yǎng) 人臍靜脈內皮細胞購自ATCC，細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中用ECM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后更換成新的培養(yǎng)液以去除未貼壁的細胞，此后每2 d換液 1 次，直至細胞達到生長融合。選擇生長至對數期的細胞用于實驗研究。

3.3CARHSP1-siRNA和CARHSP1過表達質粒轉染HUVECs HUVECs在轉染前接種于6孔板，細胞達80%生長融合時進行轉染。細胞分別轉染CARHSP1-siRNA和pcDNA3.1-CARHSP1，并分別設置siRNA陰性對照 (negative control siRNA, NC-siRNA)組和空載體組(pcDNA 3.1組)，只加入培養(yǎng)基的為空白對照(blank)組。轉染參照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明。收集轉染48 h的細胞，參照方法3.1檢測各組細胞中CARHSP1的蛋白表達。

3.4CCK-8法檢測細胞活力 內皮細胞缺氧培養(yǎng)模型的建立采用AnaeroPack-Anaero厭氧培養(yǎng)產氣袋。將HUVECs分為正常培養(yǎng)(normal culture)組、缺氧(hypoxia)組、缺氧+CARHSP1-siRNA(hypoxia+CARHSP1-siRNA)組和缺氧+pcDNA3.1-CARHSP1(hypoxia+pcDNA3.1-CARHSP1)組。HUVECs進行缺氧培養(yǎng)48 h，收集細胞，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育4 h。酶標儀測定570 nm吸光度(A)值，以A值反映細胞活力。實驗重復3次。

3.5流式細胞術檢測各組細胞凋亡率 各組細胞凋亡率的檢測采用Annexin V-FITC/PI雙染法，具體操作參照Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡試劑盒操作說明。實驗重復3次。

3.6RT-PCR檢測白細胞介素6(interleukin-6, IL-6)和C-反應蛋白(C-reactive protein,CRP)的mRNA表達 總RNA提取試劑盒提取各組細胞中的總RNA，逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，20 μL反應體系進行擴增。反應程序為：95 ℃預變性5 min； 95 ℃ 15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)。每孔設置3個復孔。 IL-6的上游引物序列為5’-CTTCGGTCCAGTTGCCTTCT-3’， 下游引物序列為5’-GTGAGTGGCTGTCTGTGTG-3’；CRP的上游引物序列為5’-GGTCTTGACCAGCCTCTCTC-3’， 下游引物序列為5’-CTTCGTTAACGGTGCTTTGA-3’；內參照GAPDH 的上游引物序列為5’-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3’， 下游引物序列為5’-CTCCACGACGTACTCAGCG-3’。實驗重復3次。

3.7Western blot檢測CARHSP1和凋亡相關蛋白的表達 將HUVECs按方法3.4分組并進行相應處理，采用Western blot法檢測各組細胞中caspase-3、cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax的蛋白表達，方法同3.1。

4 統(tǒng)計學處理

所有實驗數據采用SPSS 21.0軟件進行分析，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 CARHSP1蛋白在動脈粥樣硬化斑塊中的表達

從動脈粥樣硬化斑塊提取蛋白，Western blot檢測斑塊中 CARHSP1的蛋白表達量，結果顯示，CARHSP1在動脈粥樣硬化斑塊中的表達顯著高于對照組(P<0.05)，見圖1。

2 CARHSP1 siRNA和CARHSP1過表達質粒轉染HUVECs的效果

與空白組比較，NC-siRNA組和pcDNA3.1組的CARHSP1蛋白表達差異無統(tǒng)計學顯著性；CARHSP1-siRNA組的CARHSP1蛋白表達顯著低于空白組(P<0.05)，CARHSP1-pcDNA3.1組的CARHSP1蛋白表達顯著高于空白組(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.The protein expression of CARHSP1 in the atherosclerotic plaques. Mean±SD.n=50.*P<0.05vscontrol group.

圖1CARHSP1蛋白在動脈粥樣硬化斑塊中的表達

Figure 2.The effects of CARHSP1-siRNA and CARHSP1 over-expression plasmid on the protein expression of CARHSP1 in the HUVECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖2CARHSP1-siRNA和CARHSP1過表達質粒轉染HUVECs的效果觀察

3 CARHSP1基因對缺氧誘導的HUVECs活力和凋亡的影響

缺氧組HUVECs活力顯著低于正常培養(yǎng)組(P<0.05)，凋亡率顯著高于正常培養(yǎng)組(P<0.05)；與缺氧組比較，缺氧+CARHSP1-siRNA組細胞活力顯著升高(P<0.05)，凋亡率顯著降低(P<0.05)，缺氧+pcDNA3.1-CARHSP1組細胞活力顯著降低(P<0.05)，凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The effects ofCARHSP1 gene on the viability (A) and apoptosis (B) of HUVECs induced by hypoxia. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal culture group;#P<0.05vshypoxia group.

圖3CARHSP1基因對缺氧誘導的HUVECs細胞活力和凋亡的影響

4 CARHSP1基因對缺氧誘導的HUVECs中IL-6和CRP mRNA表達的影響

缺氧組細胞的IL-6和CRP表達顯著高于正常培養(yǎng)組(P<0.05)；與缺氧組比較，缺氧+CARHSP1-siRNA組細胞的IL-6和CRP表達均顯著降低(P<0.05)，缺氧+pcDNA3.1-CARHSP1組細胞的IL-6和CRP表達均顯著升高(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The effects ofCARHSP1 gene expression on IL-6 and CRP mRNA expression in HUVECs induced by hypoxia. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal culture group;#P<0.05vshypoxia group.

圖4CARHSP1基因對缺氧誘導的HUVECsIL-6和CRPmRNA表達的影響

5 CARHSP1基因對缺氧誘導的HUVECs中CARHSP1、caspase-3、cleaved caspase-3、 Bcl-2和Bax蛋白水平的影響

缺氧可明顯誘導CARHSP1表達升高(P<0.05);正常培養(yǎng)組、缺氧組、缺氧+CARHSP1-siRNA組和缺氧+pcDNA3.1-CARHSP1組間caspase-3蛋白水平的差異無統(tǒng)計學顯著性。缺氧組的cleaved caspase-3及Bax蛋白表達顯著高于正常培養(yǎng)組(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著低于正常培養(yǎng)組(P<0.05)；缺氧+CARHSP1-siRNA組的cleaved caspase-3及Bax蛋白水平顯著低于缺氧組(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表達顯著高于缺氧組(P<0.05)；缺氧+pcDNA3.1-CARHSP1組的cleaved caspase-3及Bax的蛋白水平顯著高于缺氧組(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表達顯著低于缺氧組(P<0.05)，見圖5。

Figure 5. The effects ofCARHSP1 gene expression on the protein levels of CARHSP1, caspase-3, cleaved caspase-3, Bcl-2 and Bax in the HUVECs induced by hypoxia. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal culture group;#P<0.05vshypoxia group.

圖5CARHSP1基因表達對缺氧誘導的HUVECs中CARHSP1、caspase-3、cleavedcaspase-3、Bcl-2和Bax蛋白水平的影響

討 論

研究發(fā)現，缺氧可促發(fā)動脈粥樣硬化，血管內皮細胞的功能障礙及損傷是脈粥樣硬化發(fā)生的關鍵因素[6-7]，缺氧可加速血管內皮細胞自由基的產生，而自由基的產生可引起細胞的損傷[8]，因此本研究通過缺氧誘導血管內皮細胞，以此研究CARHSP1對動腦粥樣硬化的影響。本研究發(fā)現CARHSP1在AS斑塊中的表達高于正常者，通過在體外建立HUVECs的缺氧模型，并將CARHSP1-siRNA和CARHSP1過表達質粒轉染HUVECs，發(fā)現缺氧可抑制HUVECs的活力，誘導細胞凋亡，而抑制CARHSP1表達可促進細胞活力，抑制細胞凋亡，過表達則反之。CARHSP1對AS的影響目前還未明確。研究發(fā)現，miR-155可通過靶向抑制CARHSP1表達影響TNF-α的穩(wěn)定性，使炎癥反應減輕，從而對AS起到保護作用[9]。本研究從CARHSP1對HUVECs細胞活力及凋亡的影響方面說明其對AS的保護作用。

在AS過程中有多個炎癥分子參與其中，如IL-6、TNF-α和CRP等[10]。在炎癥反應過程中IL-6起到核心調節(jié)作用，是引起炎癥反應的一個重要介質，在血管內皮細胞和心肌細胞等多種人體細胞都能產生IL-6[11]。研究發(fā)現，在AS形成過程中，血管內皮細胞受到損傷后可引起TNF-α的釋放，TNF-α又可增加IL-6的釋放。目前，IL-6已被認為是心血管事件預測的一個獨立危險因子[12]。CRP可調節(jié)炎癥反應，是組織炎癥及感染一個非特異性但有敏感性的標志物，其在健康人表達升高與心血管事件危險性有密切的聯系[13-14]。本研究發(fā)現缺氧組IL-6和CRP的表達均顯著升高，而抑制CARHSP1表達可降低IL-6和CRP表達，過表達CARHSP1則反之。這提示CARHSP1在AS中可通過負向調節(jié)IL-6和CRP而降低炎癥反應，從而對血管起保護作用。

細胞凋亡受到多種基因如caspase家族和Bcl-2家族的調控。Caspase-3是caspase家族中的一員，研究發(fā)現，在AS不穩(wěn)定斑塊中剪切后的caspase-3的表達升高，血管內皮細胞中剪切后的caspase-3的活化可誘導細胞的凋亡[15-17]。Bcl-2家族有促凋亡和抗凋亡蛋白，Bcl-2為抗凋亡蛋白，Bax為促凋亡蛋白，Bcl-2表達降低，Bax表達升高，可引起細胞發(fā)生凋亡，多種研究中均用Bcl-2和Bax比例衡量細胞的凋亡情況[18-20]。研究發(fā)現，在缺氧誘導的血管內皮細胞中可通過調節(jié)Bcl-2和Bax表達促進或抑制細胞的凋亡[21-22]。本研究結果顯示，缺氧可上調cleaved caspase-3及Bax的水平，下調Bcl-2表達，抑制CARHSP1表達可降低cleaved caspase-3及Bax的水平，促進Bcl-2表達，過表達CARHSP1則反之。這提示CARHSP1對血管內皮細胞凋亡可通過調節(jié)caspase家族和Bcl-2家族相關蛋白發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究證實在AS斑塊中CARHSP1表達升高，抑制CARHSP1表達可提高HUVECs的細胞活力，降低細胞凋亡，下調免疫因子IL-6和CRP表達；而過表達CARHSP1則反之。本研究提示CARHSP1可能作為AS分子診斷及靶向治療標志，但本研究所涉及的內容有限，還需更多研究支持。