靶向沉默IL-6對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響*

周偉杰， 王 聲， 夏書官， 田艷艷， 左永剛， 李 玥， 戶 莊

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院乳腺甲狀腺外科， 河南 開封 475000)

乳腺癌是一種嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率逐漸上升并趨于年輕化。乳腺癌患者發(fā)生全身轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其死亡率較高的主要原因，也是目前乳腺癌治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)[1-3]。白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)是目前發(fā)現(xiàn)的具有多種功能的細(xì)胞因子，可由機(jī)體中多種細(xì)胞分泌，參與機(jī)體免疫反應(yīng)、炎癥調(diào)節(jié)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[4-6]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，IL-6在乳腺癌患者血清中表達(dá)量顯著上調(diào)，并與患者預(yù)后等指標(biāo)顯著相關(guān)，對(duì)乳腺癌的進(jìn)展具有重要作用[7]。本研究旨在通過小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)技術(shù)沉默乳腺癌MCF-7細(xì)胞中IL-6基因的表達(dá)，觀察IL-6對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲能力的影響。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)主要試劑和儀器

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購(gòu)自ATCC；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone；Lipofectamine 2000、TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒購(gòu)自Invitrogen；鼠抗波形蛋白(vimentin)抗體和鼠抗上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體購(gòu)自Dako；鼠抗神經(jīng)鈣黏蛋白(N-cadhe-rin)抗體、抗基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloprotei-nase-2，MMP-2)抗體、抗基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9， MMP-9)抗體購(gòu)自Abcam；鼠抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司；兔抗信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)抗體和兔抗p-STAT3抗體購(gòu)自Cell Singaling Technology；MTT、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)和Matrigel購(gòu)自Sigma。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Forma；熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI；酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞的培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加入1×105U/L的青霉素和100 mg/L鏈霉素，常規(guī)放入37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，其濃度達(dá)到90%，加入0.25%胰酶消化進(jìn)行傳代。

2.2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 3條IL-6 siRNA序列由上海吉瑪生物有限公司合成，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出干擾效果最強(qiáng)的序列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。IL-6 siRNA正義鏈為5’-GGACAUGACAACUCAUCUCTT-3’，反義鏈為5’-GAGAUGAGUUGUCAUGUCCTG-3’。MCF-7細(xì)胞分為3組，空白對(duì)照(control)組、陰性對(duì)照(negative control, NC)組和IL-6 siRNA組。轉(zhuǎn)染前24 h，將MCF-7細(xì)胞密度調(diào)整為1.5×108/L,加入6孔板中，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中。采用無血清培養(yǎng)基分別與IL-6 siRNA或siRNA NC及Lipofectamine 2000混合均勻；然后充分混合，室溫孵育20 min；細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，加入上述混合物，混勻，37 ℃培養(yǎng)4～6 h后，更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.3qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞中IL-6 mRNA的表達(dá)量 通過TRIzol試劑提取各組細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用qPCR擴(kuò)增IL-6片段，引物由上海生工公司合成。IL-6的上游序列為5’-GGTACATCCTCGACGGCATCT-3’，下游引物序列為5’-GTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC-3’；β-actin的上游引物序列為5，-GGGAAATCGTGCGTGACA-3’，下游引物序列為5’-TCAGGAGGAGCAATGATC-3’。擴(kuò)增條件為: 95 ℃ 10 min； 95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法計(jì)算IL-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.4Western blot檢測(cè)IL-6和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin和vimentin的表達(dá)水平以及STAT3、p-STAT3、MMP-2和MMP-9的蛋白水平 棄去培養(yǎng)液，加入3 mL 磷酸鹽緩沖液(phosphate-buf-fered saline，PBS)洗滌細(xì)胞3次，棄去PBS，加入1 mL裂解液，冰浴中裂解20 min，收集含細(xì)胞碎片的裂解液，12 000 r/min離心5 min，收集上清，與適量5×十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)上樣緩沖液混勻，沸水加熱5～10 min。將清洗干凈的玻璃板放入玻璃夾中，將配制好的10%分離膠灌入，并加入甲醇封膠5 min后，棄去甲醇；灌入4%的濃縮膠，放入電泳槽，加入電泳液，上樣，電壓調(diào)整為80～120 V，電泳2～3 h，待藍(lán)色條帶到達(dá)膠底部，停止電泳。組裝轉(zhuǎn)膜裝置，250 mA轉(zhuǎn)膜1～2 h；將膜轉(zhuǎn)移至5%的封閉溶液中，搖床中孵育1 h；加入Tris-HCl緩沖鹽溶液+Tween(TBST)稀釋的 I 抗溶液，室溫孵育1～2 h，TBST漂洗3次，每次10 min，加入 II 抗稀釋液，室溫孵育1～2 h，TBST漂洗3次，每次10 min，避光，加入化學(xué)發(fā)光試劑，成像儀中拍照，Quantity One分析蛋白質(zhì)灰度值。

2.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活力 將各組細(xì)胞密度調(diào)整至1×104，種植于96孔板上，加入200 μL培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，每孔細(xì)胞加入20 μL 5 g/L MTT，37 ℃培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150μL DMSO，避光條件下振蕩10 min，置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)細(xì)胞在490 nm波長(zhǎng)下的吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6細(xì)胞的侵襲和遷移能力的檢測(cè) 將-20 ℃冰箱中的Matrigel膠放入4 ℃冰箱中過夜融化，與400 μL預(yù)冷培養(yǎng)基混勻，吸取40 μL Matrigel膠加入每個(gè)Transwell小室中，37 ℃培養(yǎng)箱中靜置30 min。收集各組對(duì)數(shù)期細(xì)胞，加入無血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)接種于小室上層，吸取500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基加入下室，37 ℃培養(yǎng)24 h；濕棉簽擦去小室底部表面細(xì)胞和Matrigel，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下取5個(gè)區(qū)域拍照、計(jì)數(shù)，取平均值表示細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞的遷移能力檢測(cè)過程中Transwell小室中不加入Matrigel，其余與侵襲相同。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較使用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組細(xì)胞中IL-6的水平

qPCR和Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而siRNA IL-6組細(xì)胞中IL-6 mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The relative expression of IL-6 at mRNA and protein levels in the breast cancer MCF-7 cells transfected withIL-6 siRNA. A: the mRNA expression of IL-6 detected by qPCR; B: the protein expression of IL-6 determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖1轉(zhuǎn)染IL-6siRNA后乳腺癌MCF-7細(xì)胞中IL-6表達(dá)水平的變化

2 沉默IL-6對(duì)細(xì)胞活力的影響

MTT法結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞活力的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，siRNA IL-6組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The effect ofIL-6 silencing on the viability of breast cancer MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖2沉默IL-6對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞活性的影響

3 沉默IL-6對(duì)細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

Transwell結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞侵襲和遷移能力變化的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，IL-6 siRNA組細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.05)，見圖3。

4 沉默IL-6對(duì)EMT的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白變化的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，IL-6 siRNA組細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白水平顯著增加(P<0.05)，間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和vimentin蛋白水平較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，見圖4。

5 沉默IL-6對(duì)STAT3、p-STAT3、MMP-2和MMP-9蛋白水平的影響

與對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞中STAT3、p-STAT3、MMP-2和MMP-9蛋白水平變化的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，IL-6 siRNA組細(xì)胞中STAT3蛋白水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，p-STAT3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，MMP-2和MMP-9蛋白水平顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖5。

討 論

研究表明，炎性因子可通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡以及侵襲等生物學(xué)特性，從而參與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[8-10]。研究表明，炎性因子不僅可作為乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的早期診斷指標(biāo)，還可為乳腺癌患者的預(yù)后以及復(fù)發(fā)提供新的策略[11]。IL-6是由多種細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞等產(chǎn)生的具有廣泛作用的細(xì)胞因子，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和抑制其凋亡的作用。乳腺癌機(jī)體內(nèi)IL-6主要由腫瘤來源的免疫細(xì)胞和纖維母細(xì)胞產(chǎn)生。已有研究證實(shí)IL-6與腫瘤的演進(jìn)具有密切關(guān)系，其可通過細(xì)胞的信號(hào)通路參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、周期和遷移等過程[12-15]。研究發(fā)現(xiàn)IL-6與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有顯著相關(guān)性。在本研究中，qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，siRNA IL-6組細(xì)胞中IL-6的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平顯著降低，表明轉(zhuǎn)染成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。MTT實(shí)驗(yàn)和Transwell法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默IL-6的表達(dá)顯著抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的活力，阻礙細(xì)胞的侵襲和遷移能力，表明沉默IL-6能抑制乳腺癌MCF-7的生長(zhǎng)、侵襲和遷移，對(duì)乳腺癌的進(jìn)程具有重要的作用。研究表明，在乳腺癌中，IL-6能顯著抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)其凋亡[16]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

Figure 3. The effect ofIL-6 silencing on invasion and migration of MCF-7 cells. A: number of migratory cells; B: number of invasive cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖3沉默IL-6對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

Figure 4. The effect ofIL-6 silencing on the expression of EMT-related proteins in breast cancer MCF-7 cells. Mean±SD.n= 3.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖4沉默IL-6對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Figure 5.The effect ofIL-6 silencing on the protein levels of STAT3, p-STAT3, MMP-2 and MMP-9 in breast cancer MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖5沉默IL-6對(duì)STAT3、p-STAT3、MMP-2和MMP-9蛋白水平的影響

EMT是指機(jī)體上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞的現(xiàn)象，對(duì)惡性腫瘤的演進(jìn)以及腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移過程發(fā)揮關(guān)鍵作用。EMT是乳腺癌患者發(fā)生惡化以及腫瘤組織發(fā)生轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤EMT的分子靶點(diǎn)對(duì)于突破腫瘤治療現(xiàn)狀具有重要意義[17]。EMT的發(fā)生受多種細(xì)胞因子、基因和信號(hào)通路的影響[18-19]。STAT3是STAT3細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵因子，對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡和分化發(fā)揮重要作用[20]。STAT3蛋白的持續(xù)激活和表達(dá)調(diào)控包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。STAT3主要通過調(diào)節(jié)機(jī)體癌基因表達(dá)量的增加，降低腫瘤細(xì)胞的凋亡率，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[21-23]。IL-6可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MMPs，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的降解，其中MMP-2和MMP-9是MMPs中的關(guān)鍵因子[24]。研究表明STAT3異常活化可直接結(jié)合于基因啟動(dòng)子,調(diào)節(jié)MMP-2的表達(dá)量[25]。因此，STAT3磷酸化水平的增加可能參與了IL-6對(duì)MMP-2和MMP-9蛋白的調(diào)節(jié)，從而影響乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。因此本文通過Western blot檢測(cè)了細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白、STAT3、STAT3、p-STAT3、MMP-2和MMP-9蛋白的水平，結(jié)果顯示沉默IL-6表達(dá)后，IL-6 siRNA組細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白水平顯著增加，間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和vimentin蛋白水平較對(duì)照組顯著降低，STAT3蛋白水平無顯著變化，p-STAT3、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量顯著降低，表明沉默IL-6表達(dá)可能通過抑制EMT、降低STAT3的磷酸化水平進(jìn)而抑制MMP-2和MMP-9的分泌，從而阻礙乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

綜上所述，本研究證實(shí)沉默IL-6可抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。該作用可能與抑制細(xì)胞的EMT過程和STAT3的磷酸化水平進(jìn)而調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的分泌有關(guān)。這為IL-6在乳腺癌中的作用研究提供了理論依據(jù)。