紫草素逆轉(zhuǎn)由肝細胞生長因子誘導(dǎo)的肺癌吉非替尼耐藥*

路 京， 陳子龍， 閔 朕， 衛(wèi)延明， 趙 麗， 呂 倩， 熊 山

(1渭南市食品藥品檢驗所， 陜西 渭南 714000； 2山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所， 山東 濟南 250062)

近年來肺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，并且低齡化趨勢也越來越明顯。肺癌的臨床治療手段包括手術(shù)、放療、化療、分子靶向治療、免疫治療以及中醫(yī)藥的輔助治療等[1]。傳統(tǒng)的治療方式缺乏特異性，且不良反應(yīng)嚴重，近年來腫瘤的分子靶向治療為腫瘤治療開辟了新的方向[2]。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine enzyme inhibitors，EGFR-TKIs)，如吉非替尼(gefitinib,Gef)對有EGFR突變的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者有很好的臨床療效，但是，敏感突變患者在服用靶向藥物治療后1年左右不可避免地出現(xiàn)了耐藥，進而導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)和進展[3]，因此，臨床上迫切需要研發(fā)新的治療策略來克服吉非替尼耐藥。紫草素(shikonin)為中藥植物紫草中提取的萘醌類化合物。研究顯示，紫草素具有抗腫瘤、抑菌和免疫調(diào)節(jié)等作用[4-5]。然而，有關(guān)紫草素逆轉(zhuǎn)由肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)誘導(dǎo)的肺癌細胞吉非替尼耐藥尚未見報道。因此，本實驗重點研究紫草素逆轉(zhuǎn)由HGF誘導(dǎo)肺癌HCC827細胞的吉非替尼耐藥，并探討其可能的分子機制。

材 料 和 方 法

1 材料

人肺癌細胞株HCC827購自中國科學(xué)院上海細胞所。紫草素購自上海源葉生物科技有限公司；吉非替尼購自阿斯利康制藥有限公司；HGF和DMSO購自Sigma；胎牛血清購自Gibco；RPMI-1640培養(yǎng)基購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；MTT購自碧云天生物公司；抗E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、GAPDH、p-AKT及β-actin抗體購自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 肺癌HCC827細胞于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長良好，每3 d傳代1次。取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

2.2MTT法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期的HCC827細胞，調(diào)整細胞懸液的濃度為5.0×107/L，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL的細胞懸液，將培養(yǎng)板放置37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，第2天細胞貼壁后，加入藥物作用，平行設(shè)置6個復(fù)孔。放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，每孔加入20 μL MTT溶液(2 g/L)，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育4 h后終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL的DMSO，酶標儀于490 nm波長測定每孔的吸光度(A)值，實驗重復(fù)3次。

2.3Transwell小室實驗 取對數(shù)生長期的HCC827細胞，消化細胞于無血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞懸液的濃度為8.0×107/L，取200 μL加入含有不同藥物濃度的細胞懸液于Transwell小室的上室中，取600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基加入Transwell的下室中，每組平行設(shè)置3個復(fù)孔，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。實驗結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽擦掉Matrigel及上室未穿膜的細胞，PBS清洗3次后，用甲醇固定10 min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，最后在100倍鏡下隨機選取5個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)目，實驗重復(fù)3次。

2.4Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達 收集藥物作用后的HCC827細胞，將6孔板中的細胞用4 ℃的PBS洗滌2次后，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 細胞裂解液于冰上裂解30 min。收集細胞到EP管中，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，然后用BCA蛋白定量法測定各組蛋白濃度。將配好的蛋白取15 μg上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE后，利用濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% BSA封閉1 h，加入I抗(抗p-AKT、β-actin、E-cadherin、vimentin和GAPDH抗體，均1 ∶1 000稀釋)， 4 ℃搖床孵育過夜，然后用TBST洗膜3次后，室溫下加入對應(yīng)的II抗搖床孵育1 h后，用TBST洗膜3次，最后用ECL發(fā)光試劑盒顯影后分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗均重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 紫草素對HCC827細胞活力的影響

向接種好的HCC827細胞中加入不同濃度(0、 0.5、 1、 2、4和8 μmol/L)的紫草素作用24 h后，MTT法檢測細胞活力，結(jié)果顯示HCC827細胞的生長抑制率分別為1.12%、8.84%、19.51%、41.13%、58.26%和73.52%，計算紫草素的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)為3.06 μmol/L，說明隨著紫草素給藥劑量的增加，其對HCC827細胞的生長抑制率顯著上升，且呈一定的劑量依賴關(guān)系(P<0.05,P<0.01),見圖1。

Figure 1. The effect of shikonin on cell viability in different group after 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖1不同濃度的紫草素對HCC827細胞活力的影響

2 HGF誘導(dǎo)HCC827細胞對吉非替尼耐藥

HCC827細胞株對吉非替尼敏感，實驗中采用MTT法檢測吉非替尼的藥物敏感性，其IC50為0.51 μmol/L。在本實驗過程中，我們通過加入不同濃度的HGF作用HCC827細胞，發(fā)現(xiàn)20 μg/L的HGF作用48 h對HCC827細胞吉非替尼耐藥最為明顯，其IC50為12.71 μmol/L，見圖2。

Figure 2. The effects of HGF on the gefitinib resistance to HCC827 cells by measuring the cell viability. Mean±SD.n=3.

圖2HGF對HCC827細胞吉非替尼耐藥的影響

3 紫草素逆轉(zhuǎn)由HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥

由上述實驗結(jié)果可知，20 μg/L的HGF能誘導(dǎo)HCC827細胞吉非替尼耐藥。為驗證紫草素是否能逆轉(zhuǎn)由HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥，我們選擇0.5 μmol/L的紫草素作為實驗濃度(對細胞活力抑制率小于10%)，用于紫草素聯(lián)合吉非替尼的作用。吉非替尼(0.1～32 μmol/L)與紫草素(0.5 μmol/L)聯(lián)合作用于由HGF誘導(dǎo)吉非替尼耐藥的HCC827細胞時，紫草素可恢復(fù)HCC827細胞對吉非替尼的敏感性，吉非替尼的IC50值為7.36 μmol/L，見圖3。說明紫草素可逆轉(zhuǎn)由HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥。

Figure 3.The effects of shikonin on the gefitinib resistance to HCC827 cells by measuring the cell viability. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHGF group.

圖3紫草素逆轉(zhuǎn)由HGF誘導(dǎo)的HCC827細胞吉非替尼耐藥

4 紫草素聯(lián)合吉非替尼對HCC827細胞侵襲能力的影響

本研究前期實驗結(jié)果顯示，由于紫草素在濃度高于0.5 μmol/L時，可明顯抑制HCC827細胞的活力，因此在本實驗中我們選擇0.5 μmol/L作為檢測其抗侵襲能力的實驗濃度，以消除其抗增殖能力對實驗結(jié)果的影響。Transwell小室實驗結(jié)果顯示,與對照組相比，HGF組能顯著提高HCC827細胞的侵襲能力；而在HGF存在的情況下，與吉非替尼組相比，紫草素聯(lián)合吉非替尼(1 μmol/L)組則明顯抑制HCC827細胞的侵襲能力(P<0.01)，見圖4。

5 紫草素對HCC827細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影響

用Western blot法檢測shikonin對HGF誘導(dǎo)的HCC827細胞EMT標志物E-cadherin和vimentin的影響,實驗結(jié)果顯示，HGF可顯著下調(diào)HCC827細胞中E-cadherin 蛋白的表達，而上調(diào)vimentin的蛋白表達(P<0.01)；加入shikonin作用后則可逆轉(zhuǎn)由HGF誘導(dǎo)的HCC827細胞E-cadherin 蛋白表達下調(diào)和vimentin蛋白表達的上調(diào)(P<0.01)，見圖5。

Figure 4.The effect of shikonin on HGF-induced resistance to gefitinib in HCC827 cells was determined by Transwell assay (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsGef+HGF group.

圖4紫草素對由HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥HCC827細胞侵襲能力的影響

6 紫草素對由HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥HCC827細胞p-AKT蛋白水平的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示，用20 μg/L的HGF刺激處理后可激活A(yù)KT蛋白磷酸化，使HCC827細胞中p-AKT蛋白水平升高(P<0.05)；紫草素聯(lián)合吉非替尼作用于HGF誘導(dǎo)的HCC827細胞后，與吉非替尼單獨作用組相比，能明顯抑制由HGF激活的AKT蛋白磷酸化水平，使細胞中p-AKT蛋白表達平降低(P<0.05)，見圖6。

討 論

近年來我國肺癌的發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢，而且年輕化趨勢也越來越明顯。早期肺癌發(fā)病較為隱匿，不易被察覺，患者往往在確診時已是晚期，因而失去最佳治療時機[6]。然而，近年來腫瘤的分子靶向治療取得了十分顯著的療效，為晚期肺癌患者提供了一種不錯的治療途徑，其中，以吉非替尼的應(yīng)用最為廣泛。吉非替尼為口服可逆性小分子酪氨酸激酶抑制劑，可競爭性結(jié)合于表皮生長因子受體酪氨酸激酶催化區(qū)域上Mg2+-ATP結(jié)合位點，抑制EGFR自身磷酸化，從而起到抗腫瘤的作用[7]。在近十年的上市應(yīng)用中，吉非替尼對EGFR突變的非小細胞肺癌患者有較好的臨床療效，但是初始有效的患者經(jīng)過一段時間的治療后，也都不可避免地發(fā)生了獲得性耐藥。因此，探討吉非替尼耐藥發(fā)生的分子機制，從而尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物是目前急需解決的關(guān)鍵問題。由于中草藥毒副作用較小，是逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的研究熱點。紫草素是從中藥紫草中提取的一類萘醌類化合物，研究表明其有抗腫瘤、抗炎、抑菌和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用。最近研究發(fā)現(xiàn)紫草素可逆轉(zhuǎn)某些腫瘤的細胞耐藥[8-10]，但是，有關(guān)紫草素是否可逆轉(zhuǎn)由肝細胞生長因子誘導(dǎo)的肺癌吉非替尼耐藥未見報道。

近年來研究表明，吉非替尼的耐藥機制主要有T790M突變[11]、c-met突變或擴增[12]、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[13]及非小細胞肺癌向小細胞肺癌轉(zhuǎn)化[14]等，其中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指腫瘤細胞由上皮表型向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的過程，從而獲得侵襲、遷移及耐藥的能力，主要表現(xiàn)為E-cadherin等上皮標志物蛋白表達下降和vimentin等間充質(zhì)標志物蛋白表達上調(diào)。詹建偉等[15]等報道HGF可誘導(dǎo)肺癌PC9細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，姜黃素則逆轉(zhuǎn)了HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；Tsai等[16]報道HGF可誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。然而，目前紫草素是否通過EMT途徑逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的肺癌吉非替尼的耐藥尚不清楚。

Figure 5.The protein levels of E-cadherin and vimentin in HGF-induced resistance to gefitinib in HCC827 cells treated with shikonin. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsGef+HGF group.

圖5紫草素對由HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥HCC827細胞EMT相關(guān)蛋白E-cadherin和vimentin表達水平的影響

Figure 6.The protein level of p-AKT in HGF-induced resistance to gefitinib in HCC827 cells treated with shikonin. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsGef+HGF group.

圖6紫草素對由HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥HCC827細胞p-AKT蛋白水平的影響

本實驗發(fā)現(xiàn)20 μg/L HGF對HCC827細胞的生長有明顯的促進作用，同時可誘導(dǎo)吉非替尼耐藥。紫草素聯(lián)合吉非替尼作用于HGF誘導(dǎo)耐藥的HCC827細胞時其存活率比吉非替尼單獨作用時明顯降低，說明紫草素能逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的肺癌吉非替尼耐藥。同時，紫草素還能削弱由HGF誘導(dǎo)的HCC827細胞的侵襲能力。檢測EMT標志物發(fā)現(xiàn)，上皮標志物E-cadherin蛋白表達下降，間充質(zhì)標志物vimentin蛋白表達上調(diào)，說明HGF誘導(dǎo)使肺癌細胞發(fā)生EMT。在實驗加入紫草素作用后，細胞中上皮標志物E-cadherin蛋白表達較對照組明顯上調(diào)，而間充質(zhì)標志物vimentin 蛋白表達則明顯下調(diào)。此外，HGF可明顯增加HCC827細胞中p-AKT蛋白水平的表達，而紫草素聯(lián)合吉非替尼作用組則明顯抑制由HGF激活的AKT磷酸化水平。而在本實驗中紫草素和HGF等實驗試劑同時在細胞培養(yǎng)液中，它們間是否會存在相互化學(xué)反應(yīng)從而影響各自的作用，使其誘發(fā)的耐藥性減弱，而并非逆轉(zhuǎn)已有的耐藥性，這是我們應(yīng)該注意的，也需要更加深入的研究來解釋這個問題。

綜上所述，本實驗初步表明紫草素作為一種天然存在的化合物能逆轉(zhuǎn)由HGF誘導(dǎo)HCC827細胞的吉非替尼耐藥，其分子機制可能通過逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和抑制HGF激活的AKT蛋白磷酸化有關(guān)，具體機制有待進一步研究。