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    miR-140-3p通過靶向PD-L1抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的活力、遷移和侵襲*

    2019-01-21 12:28:54張宇軒李春偉毛文浩朱恪巖邵揚(yáng)謙鄧曉明
    中國病理生理雜志 2019年1期
    關(guān)鍵詞:螢光靶向活力

    張宇軒, 李春偉, 毛文浩, 朱恪巖, 邵揚(yáng)謙, 鄧曉明△

    (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1中西醫(yī)結(jié)合科, 2腫瘤科, 河南 鄭州 450052; 3河南省腫瘤醫(yī)院甲狀腺頭頸外科, 河南 鄭州 450008)

    非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌的80%~85%左右,由于其早期癥狀不明顯,患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已處于晚期[1-2]。目前,針對NSCLC的主要治療手段為手術(shù)、化療和放療[3-4]。然而與小細(xì)胞肺癌相比,NSCLC具有對放療和化療相對不敏感的特點(diǎn),盡管極大程度地發(fā)展放化療手段,患者5年存活率仍低于15%[5]。因此,需要大力推進(jìn)相關(guān)科學(xué)研究以提高對NSCLC的診斷以及治療水平。

    微小RNA(microRNA,miRNA,miR)是一種長度大約為22 nt的小分子單鏈非編碼RNA,可與下游靶基因mRNA的3’-UTR結(jié)合,從而促進(jìn)其發(fā)生降解或者抑制翻譯過程[6]。隨著對miRNA的深入研究,人們提出miRNA的異常表達(dá)模式可被作為具有特異性的臨床診斷和治療預(yù)后生物標(biāo)志物[7]。除此之外,miRNA還可以通過對靶基因的調(diào)控而影響致癌基因或腫瘤抑制因子的活性,與腫瘤的發(fā)生進(jìn)程息息相關(guān)[8]。文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-140-3p在多種腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)的現(xiàn)象,在肺癌組織中同樣表達(dá)下調(diào)[9-10]。程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)與機(jī)體免疫應(yīng)答息息相關(guān),在腫瘤免疫逃逸中扮演著重要角色。因此,本研究將探討miR-140-3p和PD-L1對NSCLC細(xì)胞活力、遷移和侵襲的影響及其具體作用機(jī)制,為后續(xù)研究NSCLC的診斷及治療提供科學(xué)依據(jù)。

    材 料 和 方 法

    1 材料

    人胚肺成纖維細(xì)胞HLF-1及肺癌細(xì)胞A549和H1299購自北京北納生物。pcDNA3.0質(zhì)粒購自淼靈生物;BCA定量、RNA提取和反轉(zhuǎn)試劑盒購自Thermo;TB Green定量試劑購自TaKaRa;胎牛血清和0.25%胰蛋白酶購自Gibco;MTT試劑盒購自上海歌凡生物;兔抗PD-L1和GAPDH單抗購自Abcam;HRP標(biāo)記的羊抗兔 II 抗購自Cell Signaling Technology;Lipofectamine 2000 購自Invitrogen;Transwell小室購自Corning;miR-140-3p模擬物(mimic)和抑制劑(inhibitor)購自上海吉瑪生物;引物由上海生工合成。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)于5% CO2、90%相對濕度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱,細(xì)胞貼合度為70%~80%使用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

    2.2RT-qPCR檢測細(xì)胞內(nèi)miR-140-3p和PD-L1的表達(dá)水平 取生長狀態(tài)良好的HLF-1、A549和H1299細(xì)胞,TRIzol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,RT-qPCR法檢測miR-140-3p和PD-LI mRNA的表達(dá)水平。PD-L1上游引物序列為5’-TGACGAGCACACTGAGAA-3’,下游引物序列為5’-AAGGC-AGAATAAGATGGC-3’; GAPDH的上游引物序列為5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3’,下游引物序列為5’-GGGGTCATTGATAACAACAATA-3’;U6的上游引物序列為 5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’,下游引物序列為5’-CGCTT CACGAATTTGCGTGTCAT-3’; miR-140-3p的上游引物序列為5’-ACACTCCAGCTGGGAGGC-3’,下游引物序列為5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’。以采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-140-3p的表達(dá)水平。

    2.3脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將A549細(xì)胞按每孔2×105個(gè)接種于6孔板,過夜貼壁后,按照Lipofectamine 2000操作說明書轉(zhuǎn)染miR-140-3p mimic、miR-140-3p inhibrtor及相應(yīng)的mimic control和inhi-bitor control,培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)構(gòu)建過表達(dá)PD-L1的pcDNA3.1質(zhì)粒,利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PD-L1及對照空載質(zhì)粒。

    2.4雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 以健康人DNA為模板,PCR擴(kuò)增miR-140-3p與PD-L1結(jié)合區(qū)域WT-3’-UTR和PD-L1-MUT-3’-UTR的DNA片段,將PCR產(chǎn)物分別與pMIR-REPORT luciferase報(bào)告載體分別用SpeⅠ和HindⅢ雙酶切后純化,連接,轉(zhuǎn)化,鑒定,獲得PD-L1的含WT-3’-UTR以及MUT-3’-UTR螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒。將其分別與miR-140-3p模擬物或抑制劑共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h,使用Promega公司雙螢光素酶活性檢測試劑盒按說明書在單光子檢測儀中檢測細(xì)胞螢光素酶活性。相對螢光素酶活性=螢火蟲螢光素酶活性值/海腎螢光素酶活性值。

    2.5Western blot分析 收集轉(zhuǎn)染miR-140-3p模擬物和抑制劑的A549細(xì)胞,加入裂解液在低溫條件下反應(yīng)1 h,之后12 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞上清液,使用BCA法檢測上清總蛋白濃度。加入5×loading buffer,沸水處理10 min,每個(gè)點(diǎn)樣孔中加入50 μg蛋白,90 V電泳30 min,120 V繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)條帶遷移至底部。100 V、低溫轉(zhuǎn)膜45 min,使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入1∶1 000稀釋比例的 I 抗4 ℃封閉過夜,加入1∶5 000濃度的 II 抗室溫反應(yīng)2 h,DAB法進(jìn)行顯色反應(yīng),并對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

    2.6MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力 取分別轉(zhuǎn)染了miR-140-3p模擬物和pcDNA3.0-PD-L1質(zhì)粒的A549細(xì)胞單懸液,按照每孔5×104個(gè)的密度接種于96孔板中,37 ℃培養(yǎng)24 h后加入20 μL 5 g/L的MTT,37 ℃孵育4 h。去除上清,加入150 μL DMSO溶液避光反應(yīng)10 min,使用酶標(biāo)儀于490 nm處檢測吸光度(A)值。

    2.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力 取轉(zhuǎn)染miR-140-3p模擬物和pcDNA3.0-PD-L1質(zhì)粒48 h后的A549細(xì)胞單懸液,加入無血清培養(yǎng)基后按照每孔5×103個(gè)的密度接種于上層腔室,在下層培養(yǎng)基中加入含有10%的胎牛血清的培養(yǎng)基。37 ℃孵育培養(yǎng)24 h后,使用棉簽從上層腔室中轉(zhuǎn)移未發(fā)生遷移和侵襲的細(xì)胞,其余細(xì)胞從下層腔室轉(zhuǎn)移。之后,將得到的細(xì)胞使用0.1%的結(jié)晶紫染液染色30 min,PBS沖洗3次后使用33%乙酸低溫孵育10 min,測量570 nm處的吸光度值并計(jì)算遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)在上層腔室加入無血清培養(yǎng)基稀釋過的終濃度為1 g/L的基質(zhì)膠100 μL,置于37℃培養(yǎng)箱中待其凝固,后續(xù)操作同遷移實(shí)驗(yàn)。每組3個(gè)重復(fù),與miRNA對照組相比較,計(jì)算細(xì)胞相對數(shù)值。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    本研究所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較使用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 miR-140-3p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中低表達(dá)

    RT-qPCR檢測了HLF-1、A549和H1299細(xì)胞中miR-140-3p的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與HLF-1細(xì)胞相比,非小細(xì)胞癌A549和H1299細(xì)胞中miR-140-3p表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05),見圖1。因此后續(xù)研究選擇A549細(xì)胞作為研究對象。

    Figure 1. The expression of miR-140-3p in different cell lines detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHLF-1.

    圖1RT-qPCR檢測miR-140-3p在不同細(xì)胞系的表達(dá)情況

    2 miR-140-3p靶向調(diào)控PD-L1

    在線軟件TargetScan分析發(fā)現(xiàn)PD-L1是miR-140-3p的潛在靶標(biāo),見圖2A。為驗(yàn)證兩者之間的靶向調(diào)控關(guān)系,本研究進(jìn)行了雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)并使用Western blot檢測了miR-140-3p對PD-L1蛋白表達(dá)的影響。將miR-140-3p模擬物或抑制劑與PD-L1 WT-3’-UTR或MUT-3’-UTR共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,36 h后檢測細(xì)胞的相對螢光素酶活性。結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染miR-140-3p模擬物和PD-L1 MUT-3’-UTR組相比,轉(zhuǎn)染miR-140-3p模擬物和PD-L1 WT-3’-UTR的螢光素酶活性顯著下調(diào)(P<0.05);與轉(zhuǎn)染miR-140-3p抑制劑和PD-L1 MUT-3’-UTR組相比,轉(zhuǎn)染miR-140-3p抑制劑和PD-L1 WT-3’-UTR的螢光素酶活性顯著上調(diào)(P<0.05),見圖2B。Wes-tern blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-140-3p模擬物后,A549細(xì)胞內(nèi)PD-L1的表達(dá)水平顯著下調(diào);轉(zhuǎn)染miR-140-3p抑制劑后,PD-L1表達(dá)量顯著回升(P<0.05),見圖2C。以上實(shí)驗(yàn)表明,PD-L1基因受到miR-140-3p的靶向負(fù)調(diào)控作用。

    3 過表達(dá)miR-140-3p抑制A549細(xì)胞的活力

    將miR-140-3p模擬物轉(zhuǎn)染進(jìn)入A549細(xì)胞,RT-qPCR檢測miR-140-3p模擬物效率,MTT法檢測其對細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示,與對照組相比,miR-140-3p模擬物組miR-140-3p相對表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05),見圖3A;并且miR-140-3p表達(dá)量的提高對A549細(xì)胞的生長具有抑制作用(P<0.05),見圖3B。

    4 過表達(dá)miR-140-3p抑制A549細(xì)胞遷移和侵襲

    A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-140-3p后,Transwell法檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。與轉(zhuǎn)染對照組相比,miR-140-3p模擬物組的細(xì)胞遷移和侵襲個(gè)數(shù)均顯著降低(P<0.05),由此可見,A459細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miR-140-3p能夠顯著抑制遷移和侵襲能力,見圖4。

    5 PD-L1阻斷miR-140-3p對A549細(xì)胞的抑制

    為明確miR-140-3p和PD-L1的具體作用機(jī)制以及對A549細(xì)胞的影響,將pcDNA3.0-PD-L1質(zhì)粒與miR-140-3p mimic共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,用MTT法檢測其對細(xì)胞活力的影響,Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與miR-140-3p mimic組和miR-140-3p mimic+vector組相比,miR-140-3p mimic+pcDNA3.0-PD-L1組的細(xì)胞遷移和侵襲個(gè)數(shù)均明顯增多(P<0.05),見圖5A。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與miR-140-3p mimic組相比,pcDNA3.0-PD-L1和miR-140-3p mimic共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞活力得到提高(P<0.05),見圖5B。以上結(jié)果說明了過表達(dá)PD-L1能夠阻斷miR-140-3p對A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

    Figure 2.Verification of the target relationship between miR-140-3p and PD-L1.A: TargetScan software prediction; B: dual-lucife-rase receptor assay comfirmed the target relationship; C: Western blot was performed to detect the protein level of PD-L1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic control group;#P<0.05vsinhibitor control group.

    圖2miR-140-3p與PD-L1靶向關(guān)系的驗(yàn)證

    Figure 3.The effect of over-expression of miR-140-3p on the viability of A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic control group.

    圖3過表達(dá)miR-140-3p對A549細(xì)胞活力的影響

    Figure 4.The effects of miR-140-3p over-expression on the migration (A) and invasion (B) abilities of A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic control group.

    圖4過表達(dá)miR-140-3p對A549細(xì)胞遷移和侵襲的影響

    討 論

    肺癌是常見致死腫瘤之一,其在我國的發(fā)病率和致死率均居首位,對國民健康有著巨大威脅[2,11]。非小細(xì)胞肺癌占肺癌總類型的80%以上,主要病理組織類型為腺癌和鱗癌[12]。目前,因發(fā)病的隱蔽性,大部分就診患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期,治療效果和預(yù)后差,5年生存率極低,因此急需提出一種新的治療手段提高患者生存率[13]。近些年來,關(guān)于腫瘤的免疫治療相關(guān)科學(xué)研究取得了巨大進(jìn)步,研究者發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)不僅能夠參與監(jiān)管和清除腫瘤細(xì)胞,而且在特定的階段還能夠促進(jìn)腫瘤發(fā)生免疫逃逸,因此在機(jī)體腫瘤發(fā)生進(jìn)程扮演重要角色[14]。

    PD-1是B7-CD28免疫球蛋白家族成員之一,在活化的CD4+T、CD8+T和B細(xì)胞等均有表達(dá),與機(jī)體的免疫應(yīng)答息息相關(guān)[9, 15-16]。正常情況下,效應(yīng)T細(xì)胞的活化需要TCR和APC表面的共刺激分子結(jié)合,而此時(shí)機(jī)體內(nèi)的共刺激分子和共抑制分子的水平保持在一定的平衡穩(wěn)態(tài),從而使T細(xì)胞的免疫功能維持在恰當(dāng)?shù)乃剑饶茏钃蹩乖那趾τ帜軠p少對機(jī)體自身的組織損傷。然而,腫瘤可通過異常的代謝調(diào)控共抑制分子和相關(guān)配體的表達(dá)活性,例如PD-1的配體PD-L1和PD-L2,從而抑制T細(xì)胞的免疫功能,造成腫瘤對免疫系統(tǒng)監(jiān)管的躲避,導(dǎo)致并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[15, 17-19]。研究表明,PD-L1在多種惡性腫瘤中均出現(xiàn)高表達(dá)[20-22],另外PD-L1 作為單獨(dú)的靶點(diǎn),其表達(dá)水平高低與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性以及腫瘤的預(yù)后存在相關(guān)性[23]。Thompson等[24]通過對196腎癌腫瘤組織樣品分析發(fā)現(xiàn),PD-L1的上調(diào)表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移能力并且能夠提高4.5倍的死亡風(fēng)險(xiǎn)。由此可見,PD-L1活性的抑制是阻礙腫瘤發(fā)生免疫逃避的重要手段之一。

    大量研究表明miRNA參與細(xì)胞分化、生長和凋亡等多種生物學(xué)過程[25],其中miR-140-3p被報(bào)道在多種癌癥中均出現(xiàn)下調(diào)表達(dá),包括非小細(xì)胞肺癌[26-28]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-140-3p在肺癌A549和H1299細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào),與上訴文獻(xiàn)報(bào)道一致。通過TargetScan分析發(fā)現(xiàn),PD-L1是miR-140-3p的潛在靶標(biāo),并且雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)了靶向關(guān)系。將miR-140-3p模擬物轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后,PD-L1表達(dá)下調(diào),對細(xì)胞活力和遷移侵襲能力具有抑制作用;將miR-140-3p模擬物和pcDNA3.0-PD-L1共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞發(fā)現(xiàn),miR-14-3p對細(xì)胞活力和遷移侵襲能力的抑制作用得到解除,表明PD-L1能夠阻斷miR-140-3p對A549細(xì)胞的抑制。

    綜上所述,miR-140-3p和PD-L1的異常表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌有著重要聯(lián)系,本研究主要探討了兩者之間的作用關(guān)系以及在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制,并證實(shí)了miR-140-3p可通過靶向PD-L1抑制A549細(xì)胞活力、遷移和侵襲。然而,本研究雖然從生物學(xué)現(xiàn)象上揭示了腫瘤細(xì)胞微環(huán)境下PD-L1對A549細(xì)胞遷移侵襲的影響和作用,為PD-L1靶點(diǎn)治療提供理論支持,但是關(guān)于PD-L1的參與遷移侵襲具體機(jī)制尚不清楚,仍需進(jìn)一步深入研究。

    Figure 5.The effects of PD-L1 over-expression on the viability, migration and invasion of A549 cells. A: the migration and invasion abilities were detected by Transwell assay; B: the cell viability was detected by MTT assoy. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-140-3p mimic group;#P<0.05vsmiR-140-3p+vector group.

    圖5過表達(dá)PD-L1對A549細(xì)胞活力、遷移和侵襲的影響

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