Perilipin 5在肝細胞癌中的表達及對HepG2細胞脂質(zhì)代謝和生物學(xué)行為的影響*

張 琎， 高 星， 曹開宇， 肖黎明， 趙元琳， 楊 瑩， 楊日升， 葉 菁

(空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室， 陜西 西安 710032)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝臟最常見的惡性腫瘤，占原發(fā)性肝癌的91.5%，其發(fā)病率和死亡率分別居惡性腫瘤的第5位和第3位[1]。肝細胞癌的發(fā)生與癌基因或抑癌基因表達異常、細胞代謝紊亂、慢性病毒感染和不良環(huán)境持續(xù)刺激等多種因素密切相關(guān)[2]。作為代謝活躍的器官，肝臟代謝紊亂導(dǎo)致中間產(chǎn)物和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)積累，其能夠誘發(fā)氧化應(yīng)激(oxidative stress)，并導(dǎo)致腫瘤相關(guān)的遺傳和表觀遺傳改變，被認為是肝細胞癌發(fā)生的重要危險因素。與正常細胞一樣，肝癌細胞的增殖也依賴于脂質(zhì)合成，并需要脂質(zhì)氧化分解提供能量。研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)脂肪酸和膽固醇合成代謝與肝細胞癌的遷移和侵襲密切相關(guān)[3]。

脂滴包被蛋白5(perilipin 5，Plin5)是包括脂滴包被蛋白(perilipin)、脂肪分化相關(guān)蛋白(adipose differentiation-related protein，ADRP)和47 kD尾連蛋白(tail-interacting protein of 47 kD，TIP47)的PAT家族的重要成員。Plin5特異性地表達于脂肪酸氧化速度較快的組織，如肝臟、心臟、骨骼肌和棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)等[4]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，Plin5缺失可以導(dǎo)致肝細胞ROS水平升高，誘發(fā)細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷[5]。但是，在肝細胞癌中Plin5表達水平的變化及其對腫瘤細胞生物學(xué)行為的影響尚不清楚。

細胞內(nèi)過量生成的ROS能夠?qū)е翫NA、脂質(zhì)和蛋白的異常修飾[6]，參與腫瘤的發(fā)生，并影響腫瘤的生物學(xué)行為[7]。本研究通過對臨床肝細胞癌組織分析，探究Plin5等脂滴相關(guān)蛋白的表達與肝細胞癌分化程度的關(guān)系，并通過在肝細胞癌HepG2中過表達Plin5，探討其對肝細胞癌氧化應(yīng)激和生物學(xué)行為的影響。

材 料 和 方 法

1 病例收集

實驗組石蠟包埋肝細胞癌組織來源于空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院2017年3月～2017年11月的手術(shù)標本，對照組正常肝組織主要來源于由外傷等因素導(dǎo)致的肝臟手術(shù)標本。根據(jù)HE染色結(jié)果對45例臨床病例進行分類，組織標本分為大致正常肝臟組織5例、低分化肝細胞癌11例、中分化肝細胞癌13例和高分化肝細胞癌16例，病理診斷均由2名以上高年資病理醫(yī)生逐一明確。所有病例均排除慢性肝炎病毒感染以及膽管細胞癌，本實驗符合空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。40例肝細胞癌患者臨床病理特點見表1。

表140例肝細胞癌患者臨床病理特點

Table 1.Clinicopathological characteristics of 40 hepatocellular carcinoma patients

Characteristics DataSex Male33 Female7Age (year)31～72Size of tumor <5 cm33 ≥5 cm7Pathological pattern Well-differentiated HCC16 Moderately-differentiated HCC13 Poorly-differentiated HCC11Site of primary tumor Left lobe9 Right lobe31Lymph node metastasis N06 N11 Nx33

2 實驗材料

石蠟包埋組織RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix Perfect Real-Time反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex Taq II購自TaKaRa；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒購自Cell Biolabs;甘油三酯測定試劑盒及膽固醇測定試劑盒購自Wako；抗鼠Plin5單克隆抗體和過表達Plin5的腺病毒由本實驗室制備；快捷型酶標羊抗鼠IgG抗體和DAB顯色試劑盒購自邁新公司；HepG2細胞培養(yǎng)采用DMEM細胞培養(yǎng)液(購自Gibco),含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS;購自ExCell Bio)、1×105U/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素(購自Solarbio)。

3 方法

3.1免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，并浸入Tris-EDTA緩沖液，采用高壓鍋進行抗原修復(fù)，自來水冷卻至室溫；滴加3% H2O2甲醇溶液室溫30 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶。采用羊血清37 ℃封閉1 h，滴加抗鼠Plin5抗體(1∶100)，4 ℃孵育過夜；室溫復(fù)溫1 h后，PBS洗滌切片3次；滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠 II 抗，室溫繼續(xù)孵育1 h；PBS洗滌切片3次后，采用DAB顯色，自來水流水清洗，蘇木精復(fù)染30 s，常規(guī)分化，切片經(jīng)脫水、透明和封片后，采用Olympus BX5顯微鏡觀察，并照相。染色強度評分標準：陰性(-)為0分，弱陽性(+)為1分，中等陽性(++)為2分，強陽性(+++)為3分。

3.2石蠟組織RNA提取及RT-qPCR分析 切取數(shù)片10 μm的石蠟包埋組織，放入1.5 mL的EP管中，加1 mL二甲苯，按照石蠟包埋組織總RNA提取試劑盒(天根)說明書進行后續(xù)操作。反轉(zhuǎn)錄使用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Master Mix Perfect Real-Time反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取1 μL cDNA作為模板采用熒光定量試劑SYBR Premix Ex Taq II進行qPCR反應(yīng)，以GAPDH作為內(nèi)參照。Plin5的上、下游引物分別為5’-GATCACTTCCTGCCCATGAC-3’和5’-CACCGAACCCACTTCAGG-3’, GAPDH的上、下游引物分別為5’-AAGGTGAA-GGTCGGAGTCAAC-3’和5’-GGGGTCATTGATGGCA-ACAATA-3’。每個基因設(shè)3個復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后，觀察擴增曲線及熔解曲線，記錄Ct值，根據(jù)2-ΔΔCt方法計算相對mRNA含量。

3.3BODIPY 493/503染色 在12孔板中先加入滅菌的蓋玻片，每孔接種1×105HepG2細胞，采用含10% FBS的高糖(4.5 g/L glucose)DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。分別采用表達Plin5的腺病毒(Ad-Plin5)和對照腺病毒(Ad-Null)感染HepG2細胞(MOI=50)。培養(yǎng)24 h后，加入終濃度200 μmol/L 油酸(oleic acid，OA; Sigma)促進細胞脂質(zhì)合成，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，PBS洗蓋玻片3次，4%多聚甲醛固定30 min。每孔加入BODIPY 493/503熒光染料(Invitrogen)至終濃度為0.1 mg/L，37 ℃避光染色5 min。PBS清洗3次,每次5min后，每孔加入Hoechst染料(Sigma)至終濃度為1 mg/L，37 ℃避光孵育2 min。PBS清洗后，采用熒光封片劑將蓋玻片封片于載玻片，Olympus BX71型熒光顯微鏡觀察并照相。

3.4細胞內(nèi)脂質(zhì)的定量分析 HepG2細胞接種60 mm培養(yǎng)皿，分別利用Ad-Plin5和Ad-Null感染細胞(MOI=50)，并采用200 μmol/L OA 處理24 h。采用1 mL PBS收集細胞，并利用正己烷/異丙醇(3∶2)溶液抽提細胞總脂類，氮氣干燥后，溶于200 μL含2% Triton X-100的PBS。細胞內(nèi)TG和Chol的定量采用試劑盒(Wako)，并按照試劑盒說明書進行。

3.5脂質(zhì)過氧化和SOD活性的分析 HepG2細胞的培養(yǎng)、感染和油酸處理同前。肝癌細胞中MDA和4-HNE含量，以及SOD活性測定依據(jù)相應(yīng)檢測試劑盒說明書進行。

3.6細胞劃痕實驗 采用細胞劃痕實驗測定Plin5對HepG2細胞遷移速度的影響。在6孔板中，每個孔接種3×105個細胞，使用Ad-Plin5和Ad-Null腺病毒(MOI=50)感染，37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)24 h。用加樣頭做直線劃痕，用PBS洗貼壁細胞3次，去除劃下的細胞，加入新鮮無血清的DMEM培養(yǎng)液；48 h后在Olympus BX53型顯微鏡下觀察并照相，對比細胞的遷移速度。

3.7Transwell小室實驗 分別采用無或有Matrigel的Transwell小室，分析Plin5對HepG2細胞遷移和侵襲的影響。選擇8.0 μm孔徑的Transwell小室，將Matrigel放于4 ℃溶解，每個小室底部加80 μL Matrigel，37 ℃使其凝固。將有或無Matrigel的小室置于24孔培養(yǎng)板中，下室加500 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，上室分別加入5×104個過表達Plin5或?qū)φ誋epG2細胞，培養(yǎng)液采用100 μL含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室，用無鈣的PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗2遍。0.1%結(jié)晶紫染色20 min，去除基質(zhì)膠和沒有侵襲的細胞，在倒置顯微鏡下觀察移至下室的細胞數(shù)量，在100倍視野下隨機計數(shù)6個視野的細胞數(shù)，再計算每個視野的平均細胞數(shù)，分析Plin5對HepG2細胞遷移和侵襲能力的影響。

3.8CCK-8實驗檢測細胞活力 HepG2細胞以每孔1×103的濃度接種到96孔板，常規(guī)培養(yǎng)12 h后，用過表達Plin5的腺病毒Ad-Plin5或陰性對照Ad-Null病毒感染細胞(MOI=50)。用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)，在37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)到指定的時間，每孔加入10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，利用酶標儀測定450 nm的吸光度(A)值，然后根據(jù)A值分析Plin5對HepG2細胞活力的影響。

4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，計量資料組間的統(tǒng)計學(xué)顯著性檢驗采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 人肝細胞癌組織中Plin5的表達水平

我們用免疫組織化學(xué)染色檢測了不同級別人肝細胞癌組織中Plin5的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常肝組織比較，肝細胞癌組織中的Plin5表達水平顯著下降，且低分化肝細胞癌表達水平最低(P<0.05或P<0.01)，見圖1A。同時，RT-qPCR結(jié)果也顯示，人肝癌組織中Plin5的mRNA含量降低，且隨著分化程度降低，Plin5的mRNA降低更為明顯(P<0.05)，見圖1B。以上結(jié)果說明，Plin5在人肝癌組織中表達水平降低。

Figure 1.The expression of Plin5 in human hepatocellular carcinoma (HCC) tissues. A: the sections of the human liver tissues were prepared and subjected to immunohistochemical staining for visualizing the expression of Plin5; B: the relative mRNA level of Plin5 in the human liver tissues was detected by RT-qPCR. Normal liver (n=5), well-differentiated HCC (n=16), moderately-differentiated HCC (n=13) and poorly-differentiated HCC (n=11) groups were included. Mean±SD.*P<0.05,**P<0.01vsnormal liver group.

圖1人肝癌組織中Plin5的表達水平

2 Plin5過表達對HepG2肝癌細胞活力、遷移和侵襲能力的影響

為了進一步研究Plin5對肝細胞活力的影響，我們通過腺病毒感染，在肝細胞癌HepG2中過表達Plin5，并利用CCK-8法檢測了過表達Plin5對HepG2細胞活力的影響。細胞生長曲線顯示， Plin5過表達48 h組較Ad-Null感染對照組生長速度降低(P<0.05)，過表達Plin5 72 h的HepG2細胞生長速度顯著降低(P<0.01)，見圖2。

細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，感染48 h后Ad-Plin5組較Ad-Null組細胞遷移面積顯著降低(P<0.01)，見圖3A，表明Plin5過表達能夠抑制HepG2細胞的遷移速度，Transwell小室實驗也同樣驗證了這一結(jié)論(P<0.05)，見圖3B。利用預(yù)鋪Matrigel的Transwell小室實驗，我們還發(fā)現(xiàn)Plin5過表達可降低肝癌細胞的侵襲能力(P<0.01)，見圖3B。這些結(jié)果表明，Plin5過表達可以抑制HepG2肝癌細胞的活力、遷移和侵襲。

Figure 2.The CCK-8 assay results showed the influence of Plin5 overexpression on the viability of HepG2 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vsAd-Null group.

圖2Plin5過表達對HepG2細胞活力的影響

3 Plin5過表達對HepG2肝癌細胞中脂質(zhì)含量和氧化應(yīng)激的影響

用Plin5過表達的腺病毒Ad-Plin5和對照腺病毒Ad-Null感染肝癌HepG2細胞，BODIPY 493/503染色結(jié)果顯示，Plin5過表達能夠增加HepG2細胞中脂滴的數(shù)量和體積，尤其是在利用200 μmol/L油酸刺激后，過表達Plin5的HepG2細胞中脂滴數(shù)量和體積增加更為明顯，見圖4A。同時，脂質(zhì)定量分析結(jié)果顯示，Plin5能夠顯著增加HepG2細胞中甘油三酯含量(P<0.05)，但對總膽固醇含量沒有顯著影響，見圖4B。這些結(jié)果提示，Plin5能夠促進肝癌細胞中脂質(zhì)的蓄積。

4 Plin5過表達對HepG2細胞中的氧化應(yīng)激水平的影響

Plin5過表達顯著抑制HepG2細胞MDA和4-HNE水平(P<0.05)，上調(diào)SOD活性(P<0.05)，表明Plin5過表達能夠抑制肝癌細胞氧化應(yīng)激水平，見圖5。

Figure 3.Plin5 overexpression attenuated the migration and invasion abilities of HepG2 cells. A: wound-healing assay was performed to illustrate the effect of Plin5 overexpression on the migration area of HepG2 cells. B: Transwell migration assay and invasion assay were performed to detect the migration and invasion abilities of HepG2 cells. The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsAd-Null group.

圖3Plin5過表達對HepG2細胞遷移和侵襲能力的影響

Figure 4.Plin5 overexpression increased the lipid content in HepG2 cells. A: BODIPY 493/503 staining; B: triglyceride and cholesterol levels. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsAd-Null group.

圖4Plin5過表達對HepG2細胞中脂質(zhì)蓄積的影響

Figure 5.The changes of MDA and 4-HNE relative levels and SOD activity in the Plin5-overexpressing HepG2 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsAd-Null group.

圖5Plin5過表達對HepG2細胞中MDA和4-HNE含量以及SOD活性的影響

討 論

脂質(zhì)代謝紊亂與肝細胞癌的發(fā)生密切相關(guān)，脂肪酸不僅能夠提供腫瘤細胞增殖所需的脂質(zhì)和能量，其代謝紊亂能夠影響肝癌細胞的生物學(xué)行為。在肝癌細胞中，脂質(zhì)代謝紊亂產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，能夠進一步促進肝癌的發(fā)生。在細胞發(fā)生氧化應(yīng)激的過程中，細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生過多，包括超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等，同時氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，能夠?qū)е录毎鞍?、DNA和RNA的大分子修飾異常，從而促進腫瘤的進展，影響化療藥物的作用。細胞內(nèi)也存在著抗氧化的機制，如SOD、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。在肝臟中，脂質(zhì)超負荷會引起嚴重的細胞氧化還原失衡，導(dǎo)致不同慢性肝病的惡化，主要是通過影響與肝細胞生長因子及其受體c-Met依賴性的谷胱甘肽穩(wěn)態(tài)損傷有關(guān)[8]。此外，膽固醇代謝異常造成的氧化應(yīng)激和細胞功能障礙也被認為是肝細胞癌的重要誘發(fā)因素[9]。

在細胞內(nèi)，過量的脂肪酸通常以甘油三酯的形式儲存在脂滴中。作為脂質(zhì)代謝活躍的器官，肝臟的肝細胞中存在大量的脂滴，這些脂滴在維持肝細胞正常生理功能具有重要的意義。Plin5是perilipin家族的重要成員，是調(diào)控肝細胞脂質(zhì)代謝的重要分子。在Plin5缺失的肝細胞中，脂滴表面的脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)活性顯著增加，導(dǎo)致細胞內(nèi)游離脂肪酸含量增加，促進了脂肪酸的氧化速度，導(dǎo)致大量ROS的產(chǎn)生，從而誘發(fā)肝臟脂毒性(lipotoxicity)損傷[5]。相對于正常肝細胞，肝癌細胞中的脂滴數(shù)量顯著減少，但其發(fā)生機制尚不清楚。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在肝細胞癌組織中Plin5表達顯著降低，提示了Plin5的降低可能與肝細胞癌中脂質(zhì)減少有關(guān)。為了明確Plin5對肝細胞癌脂質(zhì)代謝的影響，我們發(fā)現(xiàn)過表達Plin5能夠增加HepG2肝癌細胞中的脂滴數(shù)量和脂質(zhì)含量。目前研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)代謝過程與肝細胞癌的增殖和遷移密切相關(guān)[3]，脂質(zhì)代謝過程中的關(guān)鍵分子，如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白、脂肪酸合成酶、ATP檸檬酸裂解酶、乙酰輔酶A羧化酶、甲羥戊酸激酶和3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶等，均能夠顯著促進致瘤過程，并增加腫瘤的侵襲性[10-11]。我們的研究結(jié)果還顯示，Plin5的過表達可以抑制肝癌細胞的遷移和增殖，可能是與Plin5的過表達降低肝臟脂質(zhì)水解水平，維持脂滴穩(wěn)態(tài)，抑制脂肪酸氧化有關(guān)，但Plin5調(diào)控的脂質(zhì)代謝過程對肝細胞癌生物學(xué)行為的影響和機制仍需進一步研究。

此外，我們研究發(fā)現(xiàn)Plin5能夠降低MDA和4-HNE含量，增加SOD的活性，說明Plin5可以促進脂質(zhì)蓄積，防止脂質(zhì)過氧化，從而降低肝癌細胞的氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激水平的提高可以促進腫瘤的遷移和增殖。目前研究發(fā)現(xiàn)，H2O2可以促進血管內(nèi)皮生長因子表達，促進腫瘤的趨化和轉(zhuǎn)移[12]。ROS還可以激活ERK1/2和JNK-NF-κB通路，促進基質(zhì)金屬蛋白酶9上調(diào)，促進細胞遷移[13]。細胞中的氧化還原狀態(tài)同代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)密切相關(guān)，細胞中持續(xù)增高的ROS水平通過代償性上調(diào)抗氧化酶類，從而促進細胞增殖。ROS能夠通過PI3K/Akt通路激活A(yù)kt，從而影響腫瘤細胞的細胞周期，促進腫瘤細胞增殖[14]。