構樹再生體系的建立及防褐變研究

武玉婷 石嶺 張建中

摘要：以構樹莖段為外植體，探究構樹再生體系中生長調節(jié)劑組合以及再生過程抗褐變劑種類和濃度對構樹再生的影響，結果表明，適宜構樹啟動培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L，構樹初代最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L和MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L。添加0.1 g/L抗壞血酸對構樹抗褐變效果最好，構樹繼代最適培養(yǎng)基配方為MS+IBA 0.1 mg/L+CPPU 1.0 mg/L+維生素C 0.1 mg/L。

關鍵詞：構樹;初代培養(yǎng);褐變研究;繼代培養(yǎng)

中圖分類號： S792.990.5 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）22-0061-04

構樹[Broussonetia papeyrifera（L.） Vent]又名褚樹、谷漿樹、野楊梅子等，屬被子植物門雙子葉植物綱，蕁麻目[1]?？疲∕oreceae）構樹屬（Broussonetia）多年生落葉喬木或灌木[2]，古稱“穀樹”，古幽州人稱“桑穀”[3]。構樹的葉、枝、皮、根皮、果實等都可以作藥用，構樹皮被廣泛用于制造禮品包裝紙、書畫紙等各種高檔紙型[4]，構樹果實含有豐富的營養(yǎng)物質，如氨基酸、糖類、礦物元素等[5]，具有抗氧化、美容、健身、緩解疲勞、提高人體免疫力等功能[6-7]，果實可生食和釀酒，有補腎、壯筋骨、健胃消腫之功效[8-9]。

褐變是指外植體在誘導脫分化或再分化過程中，從組織表面向培養(yǎng)基釋放分泌物質，氧化后使培養(yǎng)基逐漸變成褐色（或黑色），從而使外植體進一步變褐而死亡的現象[10-13]。影響褐變的主要因素有暗培養(yǎng)、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基狀態(tài)、組成、生長調節(jié)物質及組合等[14-16]。除此之外，可向培養(yǎng)基中加入一些化學添加劑如吸附劑[活性炭和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）[17]]、抗氧化劑[維生素C、檸檬酸、半胱氨酸（Cys）]及其鹽酸鹽、谷胱甘肽、硫代硫酸鈉、二硫蘇糖醇等[18]。

構樹在自然條件下生長周期較長，滿足不了社會的需求，近幾年來，構樹組培快繁技術發(fā)展較快，但對于構樹組培研究的資料較少，主要集中在構樹增殖方面，而對于構樹組織培養(yǎng)過程中發(fā)生的褐變現象目前還鮮有研究。因此，以構樹莖段為外植體，利用組織培養(yǎng)快速繁殖技術，對構樹增殖過程以及抗褐變條件進行系統(tǒng)研究，從而進行大量擴繁，以期解決構樹種苗大量需求的問題，為造紙、飼料等相關產業(yè)提供充足的苗木來源，在生產實踐及理論研究上具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采自內蒙古武川縣寶坤農業(yè)園區(qū)內生長旺盛的構樹嫩莖作為試驗材料，采集時間為2017年6月，在內蒙古農業(yè)大學新區(qū)實驗室進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 啟動培養(yǎng) 以MS+6-BA 1.0 mg/L為基礎培養(yǎng)基，添加不同濃度NAA（0.1、1.0 mg/L）和IBA（0.1、1.0 mg/L）組合共4個處理，接種1個/瓶，每個處理10瓶，3次重復，30 d后統(tǒng)計數據。

1.2.2 初代培養(yǎng) 以MS培養(yǎng)基上添加不同濃度6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）和IBA（0.1、0.2、0.5 mg/L）組合共9個處理，接種1個/瓶，每個處理10瓶，重復3次，30 d后統(tǒng)計數據。

1.2.3 褐變控制研究 以MS為基礎培養(yǎng)基，添加不同濃度活性炭（0.50、1.00、1.50 g/L）、抗壞血酸（0.10、0.50、1.00 g/L）和半胱氨酸（0.10、0.50、1.00 g/L），接種1個/瓶，每個處理10瓶，重復3次，30 d后統(tǒng)計褐變率、褐變等級。

1.2.4 繼代培養(yǎng) 以MS+0.1 g/L維生素C為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度細胞分裂素如6-BA、CPPU、生長素如NAA、IBA等，接種1個/瓶，每個處理10瓶，重復3次，30 d后統(tǒng)計數據。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度為25 ℃，在GTOP-280B光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照度為2 000 lx，光照時數為12 h/d。

2 結果與分析

2.1 啟動培養(yǎng)

由表1可知，A3處理的平均株高、分化率和增殖倍數均高于其他3個處理，且顯著高于A2和A4處理，但與A1處理無顯著性差異，A2和A4處理之間差異性不顯著，A3處理極顯著高于A2和A4處理。從試管苗生長狀態(tài)來看，A3與A1處理試管苗生長旺盛，分化率高，而A2處理下的試管苗分化植株較少，且試管苗生長緩慢，葉片較小，生長較弱。

2.2 初代培養(yǎng)

由表2可知，B5試管苗分化率最高，達到97%，B6和B8處理平均株高均在2.70 cm及以上，高于其他處理，各處理平均株高均在2.51～2.71 cm之間。增殖倍數顯著性差異分析結果顯示，B5、B6、B7和B8處理之間不存在顯著差異，B1～B4處理之間不存在顯著差異但都顯著低于B5處理;B5～B9處理之間差異不顯著，B5處理與B1～B4處理存在極顯著差異。從試管苗生長狀態(tài)來看，B5、B6處理下葉片顏色深綠，葉大而平展，植株生長發(fā)育良好，長勢旺;B6～B9處理下植株生長健壯;B1和B3處理下分化的植株少，植株矮小，生長緩慢，出現黃葉，少量植株因褐變死亡。

2.3 褐變控制研究

根據表3不同抗褐變劑對構樹褐變的影響顯著性差異結果分析可知，C3和C6處理褐變程度差異不顯著但顯著低于其他7個處理，C1、C4和C7處理之間不存在顯著差異，C2、C5、C8和C9處理之間差異不顯著;C1、C4和C7處理褐變度極顯著高于C3、C6和C9處理，C3、C6和C9處理抗褐變效果較好。

根據圖1分析可知，構樹褐變程度隨著抗褐變劑活性炭、維生素C以及半胱氨酸濃度的增加而降低，活性炭抗褐變效果強于其他2種抗褐變劑，但加入活性炭的構樹試管苗雖然葉片大而綠，但隨著培養(yǎng)時間的增加而出現枝條細軟、葉片下垂的現象，長勢越來越弱，影響增殖效果，因此在增殖階段不適合添加活性炭;在各個濃度下維生素C抗褐變效果均強于半胱氨酸，當維生素C濃度為0.1 g/L時，試管苗生長健壯并可以繼續(xù)增殖，但隨著維生素C和半胱氨酸濃度的增加，構樹試管苗均出現葉片發(fā)黃甚至死亡的現象，綜合考慮，最適宜的抗褐變劑為維生素C且濃度為0.1 g/L。

2.4 繼代培養(yǎng)

2.4.1 細胞分裂素種類和濃度對構樹增殖的影響 由表4可知，隨著6-BA濃度的增加，試管苗分化率和增殖倍數均增加;隨著CPPU濃度增加，試管苗的平均株高、分化率和增殖倍數呈增加趨勢;D6處理下構樹無菌苗平均株高最大，為2.75 cm，D3處理下無菌苗分化率達100%。增殖倍數顯著性差異分析結果顯示，在顯著水平為0.05水平時，D6處理顯著高于其他5個處理，D4處理下增殖倍數最小，顯著低于其他5個處理，D1和D5之間不存在顯著差異;在顯著水平為0.01水平時，D6處理極顯著高于其他處理，D4極顯著低于其他處理，D1、D2和D5之間差異不顯著，添加1 mg/L CPPU的試管苗平均株高和增殖倍數均高于其他組合，因此CPPU是最適宜試管苗增殖的細胞分裂素。

2.4.2 生長素種類和濃度對構樹增殖的影響 由表5分析可知，D12處理下試管苗分化率達到100%。增殖倍數顯著性差異分析結果顯示，在顯著水平為0.05水平時，D10和D12處理顯著高于D7～D9處理，二者之間差異性不顯著，D7、D8、D9和D11處理之間差異不顯著，在顯著水平為0.01水平時，D7、D10、D11和D12處理無顯著差異。從株高、分化率和增殖倍數綜合考慮，添加NAA的處理對構樹的作用效果好于IBA。

2.4.3 CPPU和IBA不同濃度組合對構樹增殖的影響 由表6分析可知，當IBA濃度為0.1 mg/L時，試管苗增殖倍數先升高后降低又略升高，D14處理試管苗分化率達到100%，平均株高3.11 cm;IBA濃度為0.2 mg/L時，試管苗分化率和增殖倍數均為先增加后減少。增殖倍數顯著性差異分析結果顯示，在顯著水平為0.05水平時，D14和D16處理顯著高于其他處理，D13、D15、D16、D17和D18之間差異不顯著;在顯著水平為0.01水平時，D14與D13、D17、D19和D20差異極顯著，與D15、D16和D18之間差異不顯著。當IBA為 0.1 mg/L、CPPU為1.0 mg/L時，試管苗分化率、增殖倍數最大，分別為100%、4.33。

3 結論與討論

3.1 啟動培養(yǎng)

通過對構樹進行不同濃度NAA和IBA處理，結果顯示，NAA和IBA對構樹的生長均有促進作用，這一作用會因各激素濃度不同而作用不同，IBA處理效果總體高于NAA，且濃度為0.1 mg/L的NAA和IBA處理效果強于濃度為 1.0 mg/L，這與萬文報道的高濃度生長素會使得雜交構樹組培苗的分化率下降研究結果[19]相一致，通過初代培養(yǎng)，篩選出了最適宜構樹啟動培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，為MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L。

3.2 初代培養(yǎng)

通過研究6-BA和IBA 2種生長調節(jié)劑對構樹初代培養(yǎng)的影響，結果表明，適當濃度的6-BA和IBA組合對構樹生長和增殖有促進作用。各處理之間增殖倍數顯著性差異分析結果顯示，當6-BA濃度為1.0 mg/L時，IBA濃度為0.2、0.5 mg/L，構樹試管苗增殖效果顯著，增殖倍數較高，分別為3.33、3.03，二者無顯著差異，試管苗生長狀況良好，葉綠，長勢旺盛，因此可得出構樹初代培養(yǎng)最適培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L和MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L。

3.3 褐變控制研究

在植物組織培養(yǎng)過程中，木本植物均存在著不同程度的褐變現象。添加抗褐變劑可有效防止褐變，本試驗研究了不同抗褐變劑以及不同濃度對構樹褐變的影響，選用活性炭（活性炭）、維生素C和半胱氨酸（Cys）3種抗褐變劑，試驗證明，隨著抗褐變劑濃度的增加，構樹試管苗褐變程度逐漸減輕，但高濃度抗褐變劑會對構樹生長造成影響。何瓊英等研究表明，維生素C對褐變的控制作用是有消耗性的，所以用維生素C作抗褐變添加物時，應適當減短轉接時間[20];活性炭的防褐變效果雖然好，但會吸附培養(yǎng)基中其他營養(yǎng)物質，對組培苗的生長造成一定的影響[18];半胱氨酸與醌類物質醌結合，能抑制多酚氧化酶活性[21]，因此可抑制組培苗褐變發(fā)生，當維生素C濃度為0.1 g/L時，防褐變效果最佳。

3.4 繼代培養(yǎng)

通過對構樹繼代培養(yǎng)的研究可知，生長素類的IBA和NAA對構樹增殖均有促進作用，但NAA作用效果好于IBA，這與初代培養(yǎng)中的結果存在差異，可能是由于二者濃度不同所造成的，須進一步探索;在培養(yǎng)基中添加CPPU試管苗的平均株高、分化率和增殖倍數普遍強于6-BA，有研究證明CPPU誘導桑樹下胚軸分化新梢的效果顯著好于BA[22]，這與本試驗結果一致。CPPU是近年來從苯脲衍生物中篩選出一種廉價細胞分裂素類物質，具有促進細胞分裂的作用[23]。本試驗中CPPU的作用效果主要表現在促進植株伸長以及側芽分化，且CPPU濃度越高，作用效果越明顯，但高濃度CPPU雖然對構樹株高有良好的促進作用，但會抑制構樹葉片生長，造成構樹葉片色淺、葉面積小、長勢較弱，所以使用CPPU濃度不宜太高。當IBA濃度為0.1 mg/L、CPPU濃度為 1.0 mg/L 時，試管苗平均株高3.11 cm，分化率100%，增殖倍數3.33，是繼代培養(yǎng)中效果最好的處理，因此，MS+IBA 01 mg/L+CPPU 1.0 mg/L+維生素C 0.1 mg/L為構樹繼代培養(yǎng)最佳配方。

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