響應(yīng)面法優(yōu)化無花果果汁酶解提取工藝研究

孫小華，馬艷弘，崔 晉，韓德果，程 果，竇泓喆，楊國慧 (東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 50030； 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 004)

[摘 要] 【目的】 研究雙酶法提取無花果汁的最佳工藝參數(shù)，為制備無花果汁、釀造無花果酒奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?以無花果為材料，以出汁率為考察指標(biāo)，通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗，研究纖維素酶和果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時間4個因素及其交互作用對無花果岀汁率的影響，利用響應(yīng)面試驗結(jié)果建立回歸方程，并對回歸方程進(jìn)行顯著性和方差分析，得到無花果果汁酶解提取最佳工藝參數(shù)并進(jìn)行試驗驗證。【結(jié)果】 通過單因素試驗得到的無花果果汁最佳酶解提取條件為：纖維素酶添加量1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，果膠酶添加量0.3%，酶解溫度55 ℃，酶解時間90 min。根據(jù)單因素試驗結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面試驗分析得出，無花果果汁的最佳酶解提取工藝條件為：纖維素酶添加量1.56%，果膠酶添加量0.28%，酶解溫度53 ℃，酶解時間90 min；在此條件下無花果的岀汁率為72.15%，與理論值(73.99%)基本吻合，且比未處理無花果出汁率提高了75.46%。纖維素酶添加量與酶解溫度和酶解時間、果膠酶添加量與酶解溫度和酶解時間、酶解溫度與酶解時間的交互作用均可在較大程度上影響無花果的岀汁率?！窘Y(jié)論】 通過響應(yīng)面試驗得到了雙酶法提取無花果汁的最佳工藝參數(shù)，該工藝可以大幅提高無花果出汁率。

無花果(FicuscaricaL.)，別名天仙果、明目果、映日果、奶漿果[1]，為桑科無花果屬多年生木本植物，其根、莖、葉、果實均可入藥，為典型的藥食兩用型水果，具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值，被譽為“生命之果”、“神圣之果”[2]。無花果不僅含有多種維生素、糖類、蛋白質(zhì)、脂肪、粗纖維等營養(yǎng)成分，還富含多酚類物質(zhì)、花青素、活性多糖等成分，具有很強的抗氧化、抗衰老、保護(hù)心血管、抗癌、增強免疫力等藥理保健功效[3]，在國內(nèi)外市場極其暢銷。無花果為呼吸躍變型果實，成熟衰老快，皮薄汁多，含糖量高，耐貯藏性差，貨架期短，極易腐爛變質(zhì)[4]。采用現(xiàn)代生物加工技術(shù)，開發(fā)營養(yǎng)保健的無花果果酒、果汁飲料等高附加值產(chǎn)品,成為解決無花果產(chǎn)業(yè)發(fā)展瓶頸的主要途徑[5]。

王鵬[6]以新疆當(dāng)?shù)氐孽r無花果為原料，采用果膠酶酶解技術(shù)，利用單因素試驗結(jié)合正交試驗優(yōu)化無花果酶解工藝，最佳條件為：果膠酶添加量0.6%,酶解溫度50 ℃,酶解時間60 min。這是目前國內(nèi)外僅有的關(guān)于無花果酶解工藝的研究報道，但該研究僅利用果膠酶來酶解無花果，且研究對象僅是新疆當(dāng)?shù)氐臒o花果。江蘇太湖作為果業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)，具有不同于新疆的無花果品種，且人口眾多，產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景廣闊。在無花果加工取汁時，由于其果漿中含有大量纖維素和果膠，使得果漿黏度增加[7-8]，導(dǎo)致出現(xiàn)原料壓榨性能差、利用率低、果酒生產(chǎn)成本高等問題。據(jù)報道，利用生物酶解技術(shù)能有效分解細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的纖維素和果膠等物質(zhì)，降低果漿黏度，進(jìn)而提高果品出汁率，降低果酒生產(chǎn)成本[9]?；诖?，本研究以江蘇蘇州西山國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園的“瑪斯義陶芬”無花果為原料，以果膠酶和纖維素酶酶解為技術(shù)手段，以出汁率為考察指標(biāo)，通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗，研究纖維素酶和果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時間等因素對無花果出汁率的影響以及各因素之間的交互作用，確定酶解制備無花果果汁適宜的工藝條件，以期為無花果的加工利用尤其是果酒開發(fā)提供理論依據(jù)和試驗參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試材：無花果采摘于江蘇蘇州西山國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園區(qū)有限責(zé)任公司無花果種植基地，品種為“瑪斯義陶芬”，八成熟，采摘后置于-20 ℃冰箱中備用。

試劑：纖維素酶(活力≥400 U/mg)、果膠酶(活力≥500 U/g)，均購于上海瑞永生物科技有限公司。

儀器：MJ-BL15U11型打漿機，廣東美的生活電器制造有限公司；ML204型電子分析天平，梅特勒-托利多(上海)有限公司；DK-8D型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；TGL-16B臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 無花果果汁酶解提取的單因素試驗和響應(yīng)面試驗

1.2.1 單因素試驗 取適量無腐爛、無破損、成熟程度一致的無花果解凍后洗凈，打漿成無花果漿后，以纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時間為因素進(jìn)行試驗，考察其對無花果出汁率的影響。

(1)纖維素酶添加量的影響。將無花果漿分裝成7等份，每份50 g，均加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的果膠酶，再分別添加0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)的纖維素酶并攪拌，45 ℃水浴鍋中酶解90 min，90 ℃水浴鍋中滅酶5 min，4 500 r/min離心20 min，取上清液，計算出汁率。

(2)果膠酶添加量的影響。將無花果漿分裝成7等份，每份50 g，均添加2.0%的纖維素酶，再分別添加0，0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%，1.1%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)的果膠酶并攪拌，45 ℃水浴鍋中酶解90 min，90 ℃水浴鍋中滅酶5 min，4 500 r/min離心20 min，取上清液，計算出汁率。

(3)酶解溫度的影響。將無花果漿分裝成7等份，每份50 g，均添加2.0%的纖維素酶和0.5%的果膠酶，分別在35，40，45，50，55，60，65 ℃水浴鍋中酶解90 min，90 ℃水浴鍋中滅酶5 min，4 500 r/min離心20 min，取上清液，計算出汁率。

(4)酶解時間的影響。將無花果漿分裝成7等份，每份50 g，均添加2.0%的纖維素酶和0.5%的果膠酶，在45 ℃水浴鍋中分別酶解30，60，90，120，150，180 min，90 ℃水浴鍋中滅酶5 min，4 500 r/min離心20 min，取上清液，計算出汁率。

1.2.2 響應(yīng)面試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時間為因素，以岀汁率為響應(yīng)值，采用Box-Benhnken中心組合設(shè)計進(jìn)行四因素三水平試驗[10-11]，其因素與水平見表1。采用Design-Expert 8.0.6軟件對響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定最佳酶解條件。

表1 無花果果汁酶解提取工藝的響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of RSM test for enzymolysis extraction of fig juice

1.3 數(shù)據(jù)處理

無花果出汁率=(無花果上清液質(zhì)量/無花果果漿質(zhì)量)×100%[6]。

所有試驗均做3次平行，結(jié)果取平均值，試驗數(shù)據(jù)采用EXCEL軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 無花果果汁酶解提取工藝的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 纖維素酶添加量的影響 如圖1所示，當(dāng)纖維素酶添加量在0～1.5%時，無花果出汁率隨著纖維素酶添加量的增大而升高，且在纖維素酶添加量為1.5%時出汁率最高，達(dá)到70.8%；當(dāng)纖維素酶添加量大于1.5%時，出汁率變化趨于穩(wěn)定。這可能是因為一定量的纖維素酶酶解破壞了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)容物溶出，導(dǎo)致出汁率提高[12]；但當(dāng)纖維素酶添加量達(dá)到最佳值后，細(xì)胞內(nèi)容物已經(jīng)充分溶出，出汁率達(dá)到最大，再繼續(xù)提高加酶量時，出汁率也不再提高[13]。因此，確定1.5%為適宜的纖維素酶添加量。

2.1.2 果膠酶添加量的影響 如圖2所示，果膠酶添加量在0～0.3%時，無花果出汁率隨著果膠酶添加量的增大而升高，且在果膠酶添加量為0.3%時出汁率達(dá)到最高(67.71%)；當(dāng)果膠酶添加量大于0.3%時，出汁率隨著纖維素酶添加量的增加而緩慢下降。這可能是因為當(dāng)果膠酶添加量達(dá)到最佳值時，細(xì)胞內(nèi)容物已經(jīng)充分溶出，出汁率達(dá)到最大，此時繼續(xù)提高加酶量，出汁率不再提高[14]。因此，確定果膠酶添加量以0.3%為宜。

圖1 纖維素酶添加量對無花果岀汁率的影響Fig.1 Effect of cellulase addition amount on fig juice yield

2.1.3 酶解溫度的影響 如圖3所示，當(dāng)酶解溫度在35～55 ℃時，無花果出汁率隨著溫度的升高而增加，且在55 ℃時出汁率最高(71.09%)；當(dāng)溫度高于55 ℃時，出汁率隨著溫度升高而下降。這是由于纖維素酶和果膠酶的活性具有最適合的溫度，在一定溫度范圍內(nèi)，酶活性會隨著溫度升高而提高；到最適溫度時，酶活性最高,催化能力最強[15]；當(dāng)溫度高于最適溫度時，酶活性降低，酶解反應(yīng)受到抑制，致使岀汁率有所降低[14]。因此，確定酶解溫度以55 ℃為宜。

2.1.4 酶解時間的影響 如圖4所示，當(dāng)酶解時間在30～90 min時，無花果出汁率隨著時間的延長而升高，且在90 min時出汁率最高(68.12%)；超過90 min時，出汁率隨著時間的延長而下降。這可能是因為隨著時間延長，酶活力得到充分發(fā)揮，酶解反應(yīng)較完全，出汁率不斷升高；在最適宜的時間酶促反應(yīng)徹底，出汁率達(dá)到最高值；超過最適宜時間則纖維素果膠類物質(zhì)基本分解完畢，酶解反應(yīng)基本結(jié)束，出汁率不再增加而逐漸趨于平緩甚至略微下降[15]。因此，確定90 min為適宜的酶解時間。

圖3 酶解溫度對無花果岀汁率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on fig juice yield

2.2 無花果果汁酶解提取工藝的響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與模型建立 在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6中的Box-Benhnken中心組合設(shè)計無花果酶解工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗，試驗結(jié)果如表2所示。對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到以出汁率(Y)為響應(yīng)值的回歸方程：

式中：Y為出汁率，X1、X2、X3、X4分別為纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時間的變量值。

表2 無花果果汁酶解提取工藝的響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Design and results of RSM test for enzymolysis extraction of fig juice

表2(續(xù)) Continued table 2

表3 無花果果汁酶解提取工藝回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis on regression equations for enzymolysis extraction of fig juice

2.2.3 響應(yīng)面分析 由圖5可以看出，在6個交互項中，任何2個交互因素的響應(yīng)面都存在最高點，纖維素酶添加量(X1)與酶解溫度(X3)、纖維素酶添加量(X1)與酶解時間(X4)、果膠酶添加量(X2)與酶解溫度(X3)、果膠酶添加量(X2)與酶解時間(X4)、酶解溫度(X3)與酶解時間(X4)的響應(yīng)面曲面坡度均較陡峭，說明兩者的交互作用對無花果出汁率的影響極顯著。

圖5 因素的交互作用對無花果出汁率的影響Fig.5 Effect of the interaction of factors on the juice yield of figs

2.2.4 驗證試驗 通過軟件Design Expert 8.0.6求解回歸方程，得出最優(yōu)的理論酶解條件為：纖維素酶添加量1.56%、果膠酶添加量0.28%、酶解溫度53.37 ℃、酶解時間89.54 min，此條件下無花果的理論岀汁率為73.99%。為了檢驗工藝的可靠性，考慮到實際操作方便，將最優(yōu)酶解條件適當(dāng)修正為：纖維素酶添加量1.56%，果膠酶添加量0.28%，酶解溫度53 ℃，酶解時間90 min，進(jìn)行3次平行試驗，得出無花果的實際岀汁率為72.15%，與理論預(yù)測值吻合，說明根據(jù)該模型得到的最優(yōu)酶解條件是可行的。經(jīng)測未經(jīng)酶解處理的無花果岀汁率為41.12%，酶解最佳工藝條件下的理論岀汁率較之高79.94%，實際岀汁率較之高75.46%，說明該酶解工藝可以有效地提高無花果岀汁率。

3 討 論

本研究系統(tǒng)分析了纖維素酶和果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時間對無花果岀汁率的影響，結(jié)果表明，隨著纖維素酶和果膠酶添加量的增加、酶解溫度的升高和酶解時間的延長，無花果岀汁率總體上呈先增長后持平的趨勢。主要原因如下：其一，纖維素與果膠作為纖維素酶和果膠酶的底物，它們是構(gòu)成無花果細(xì)胞壁的重要成分，因此不斷添加纖維素酶和果膠酶會破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)容物不斷溶出直至溶出幾乎完畢，從而導(dǎo)致出汁率由不斷增大到不再上升；其二，在適宜的溫度范圍內(nèi)，酶具有高活性，超越了適宜溫度范圍時，則高活性受到抑制，因此酶解反應(yīng)中出汁率亦會出現(xiàn)先增長后持平的現(xiàn)象；其三，在適宜時間內(nèi)酶解反應(yīng)高效，時間太久時反應(yīng)幾乎會消耗所有的底物，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物基本釋放完畢，酶解反應(yīng)趨于結(jié)束。在單因素試驗基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面試驗建立了可靠的預(yù)測模型，優(yōu)化了最佳的酶解工藝，在最佳條件下的出汁率與理論值擬合度很高，說明此工藝參數(shù)可靠。與不經(jīng)過酶解的無花果相比，利用優(yōu)化的酶解工藝岀汁率提高了75.46%。本研究與王鵬[6]的研究結(jié)果存在一定的差異，其原因在于不同的無花果品種及其特性不同，且受生態(tài)環(huán)境的影響；另外，酶活力規(guī)格不同，研究結(jié)果也會有所差異。

在無花果的酶解工藝優(yōu)化研究領(lǐng)域中，本研究使用了纖維素酶和果膠酶2種酶優(yōu)化無花果的酶解工藝，打破了前人僅利用果膠酶進(jìn)行酶解工藝研究的局限性。由于纖維素酶和果膠酶均為特異性酶，造成無花果細(xì)胞可破解的多糖種類增加，這不但有利于提高出汁率，而且增加了酵母酒精發(fā)酵可利用的碳源，一定程度上提高了酒精度，有利于無花果的釀酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展[17]；另外，利用纖維素酶協(xié)同果膠酶酶解無花果可以更大程度地保證食物的消化吸收[18]。

4 結(jié) 論

本研究通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化雙酶法提取無花果汁的工藝條件，得出其酶解最優(yōu)工藝條件為：纖維素酶添加量1.56%、果膠酶添加量0.28%、酶解溫度53 ℃、酶解時間90 min。此條件下無花果的出汁率高達(dá)72.15%，比未經(jīng)酶解處理的無花果出汁率提高了75.46%，可見利用雙酶法可顯著提高無花果出汁率，有利于降低無花果的加工成本。