駿棗果實(shí)成熟過(guò)程中果膠和纖維素代謝及其基因表達(dá)

李 歡，張舒怡，張 鐘，張春梅，李新崗

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西省林業(yè)綜合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100；2 四川攀枝花蘇鐵國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，四川 攀枝花 617000)

棗(ZiziphusjujubaMill.)是我國(guó)原產(chǎn)特有果樹(shù)，按照用途主要分為制干和鮮食兩大類(lèi)[1]。與鮮食棗相比，制干棗果實(shí)有一個(gè)變軟和后熟的過(guò)程(完熟期)，因此具有較長(zhǎng)的成熟期。駿棗是我國(guó)栽培面積最大的制干棗品種，主要分布在包括新疆南疆、甘肅、寧夏、陜西在內(nèi)的西北棗區(qū)和山西駿棗原產(chǎn)區(qū)[2-4]。果實(shí)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和物質(zhì)組成對(duì)于果實(shí)質(zhì)地變化及成熟軟化具有直接影響，特別是由果膠、纖維素、半纖維素構(gòu)成的細(xì)胞壁骨架的改變和含量影響較大[5]。因此，研究駿棗果實(shí)成熟過(guò)程中的質(zhì)地變化、細(xì)胞壁代謝及其基因表達(dá)特性，對(duì)棗果適時(shí)采收和采后處理具有重要的指導(dǎo)意義。

果實(shí)成熟和質(zhì)地變化與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及多糖物質(zhì)(如果膠、纖維素、半纖維素等)的變化、降解密切相關(guān)，而細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的改變則與一些水解酶或調(diào)控酶，如多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠酯酶(PE)以及纖維素酶(Cx)、半纖維素酶等的活性直接相關(guān)[6-7]。果實(shí)成熟早期，主要是半纖維素降解，細(xì)胞壁空隙增大，水解酶擴(kuò)散加快，果實(shí)硬度降低；果實(shí)成熟后期(軟化)，主要是果膠物質(zhì)(多聚半乳糖醛酸)降解，其中PG、PE等酶的共同作用可使不溶性果膠溶液化[5]。目前，對(duì)于棗果實(shí)成熟和軟化的研究主要集中在冬棗、梨棗等少數(shù)鮮食棗品種采后的細(xì)胞壁代謝相關(guān)物質(zhì)和酶類(lèi)變化等方面，而有關(guān)采前棗果實(shí)發(fā)育和成熟生理及其基因組、轉(zhuǎn)錄組的研究還較少。有研究發(fā)現(xiàn)，棗果實(shí)的質(zhì)地變化與細(xì)胞壁多糖降解相關(guān)[8-9]，果實(shí)成熟和采后軟化與PG、果膠甲酯酶(PME)和纖維素酶等細(xì)胞壁代謝酶類(lèi)的作用密切相關(guān)[10-11]。前人已從冬棗和梨棗中克隆出木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶(XTH)基因和β-半乳糖苷酶基因，這2類(lèi)基因與棗果實(shí)質(zhì)地和采后軟化相關(guān)[12-13]。對(duì)棗轉(zhuǎn)錄組的研究也發(fā)現(xiàn)，一些細(xì)胞壁修飾酶基因，如β-半乳糖苷酶、XTH、內(nèi)切葡聚糖酶和PG等的基因家族參與了棗果實(shí)成熟調(diào)控[14]。但是，棗果實(shí)成熟和軟化的關(guān)鍵因子及其基因調(diào)控機(jī)制還不清楚。

為探究制干棗果實(shí)成熟過(guò)程中細(xì)胞壁物質(zhì)和相關(guān)酶類(lèi)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，探明棗果實(shí)成熟和軟化的關(guān)鍵因子，本研究以制干棗品種駿棗為材料，測(cè)定果實(shí)成熟過(guò)程中果實(shí)硬度、含水量、可溶性固形物含量、細(xì)胞壁物質(zhì)(果膠、纖維素等)含量和相關(guān)酶類(lèi)活性及相關(guān)基因的表達(dá)變化，以期為棗果實(shí)發(fā)育與成熟評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料的預(yù)處理

2016年9-10月在西北農(nóng)林科技大學(xué)清澗紅棗試驗(yàn)站(37°07′N(xiāo)，110°04′E)，選擇10 a生健康駿棗樹(shù)，從東南西北4個(gè)方向隨機(jī)采集二次枝上的健康果實(shí)，分7個(gè)時(shí)期采摘，即白熟期、脆熟期3個(gè)時(shí)期(初紅期、半紅期、全紅期)和完熟期3個(gè)時(shí)期(完熟前期、完熟中期、完熟后期)。果實(shí)去皮并將果肉切成小塊，迅速裝入50 mL離心管中，在液氮環(huán)境下帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃冰箱中保存，作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定基因表達(dá)量的樣品。用于棗果生理指標(biāo)、細(xì)胞壁物質(zhì)含量和酶活性測(cè)定的果實(shí)裝在塑封袋中低溫(4 ℃)帶回，洗凈，一部分果實(shí)用于硬度等生理指標(biāo)測(cè)定；另一部分去皮后取果肉組織，切成小塊，迅速裝入用液氮預(yù)冷的50 mL離心管中，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。所有樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.2.1 果實(shí)硬度、含水量、可溶性固形物含量和色差的測(cè)定 (1)硬度。在果實(shí)中部赤道線上均勻選3個(gè)點(diǎn)，再在果實(shí)兩端各選1個(gè)點(diǎn)，共5個(gè)點(diǎn)，削去5個(gè)點(diǎn)處的外果皮，用手持硬度計(jì)(FHT-15，廣州蘭泰儀器有限公司)測(cè)10個(gè)果實(shí)的硬度。

(2)含水量。用烘干稱(chēng)重法，稱(chēng)取約1 g樣品于稱(chēng)量瓶中，稱(chēng)總質(zhì)量后，放入預(yù)先升溫至105 ℃的烘箱中殺青10 min，再于70 ℃恒溫烘至恒質(zhì)量(約5 h)，放入干燥器中冷卻后稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算含水量(%)，設(shè)3個(gè)重復(fù)。

(3)可溶性固形物(TSS)含量。用數(shù)顯糖度計(jì)(CNT65，杭州陸恒生物科技有限公司)測(cè)定，每個(gè)重復(fù)讀數(shù)3次，測(cè)10個(gè)果實(shí)。

(4)色差。以色彩色差儀(CR-400，DP-400，柯尼卡美能達(dá)有限公司)測(cè)定，隨機(jī)選擇果面5個(gè)點(diǎn)，重復(fù)測(cè)量L*、a*、b*值，其分別表示色澤的明-暗、紅-綠和黃-藍(lán)變化，測(cè)10個(gè)果實(shí)。

1.2.2 果膠、纖維素含量和酶活性測(cè)定 (1)果膠。參考曹建康等[15]的咔唑比色法測(cè)定，略有改動(dòng)。以各濃度梯度的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在紫外分光光度計(jì)(UV-2550，島津，日本)下選擇光度測(cè)定模塊，測(cè)定樣品在530 nm波長(zhǎng)下的吸光值，重復(fù)3次。果膠含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。

(2)纖維素。參考曹建康等[15]的蒽酮-硫酸法測(cè)定，略有改動(dòng)。以各濃度梯度的纖維素標(biāo)準(zhǔn)液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品的吸光值，重復(fù)3次。纖維素含量結(jié)合果實(shí)含水量來(lái)計(jì)算，以“mg/g”表示。

(3)多聚半乳糖醛酸酶(PG)。參考曹建康等[15]的比色法測(cè)定，略有改動(dòng)。各濃度梯度的葡萄糖溶液加入DNS試劑(3,5-二硝基水楊酸)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，重復(fù)3次。PG活性以每小時(shí)每克樣品催化多聚半乳糖醛酸水解形成半乳糖醛酸的質(zhì)量表示(mg/(h·g))。計(jì)算時(shí)將葡萄糖換算成半乳糖醛酸的系數(shù)為1.08(194/180)。

(4)果膠酯酶(PE)。參考程杰山[16]的連續(xù)分光光度計(jì)法測(cè)定，略有改動(dòng)。反應(yīng)體系包含2 mL體積分?jǐn)?shù)0.5%、pH 7.5的果膠溶液，0.15 mL體積分?jǐn)?shù)0.01%、pH 7.5的溴百里香酚蘭溶液，加pH 7.5的蒸餾水至3 mL，最后加入100 μL酶液，在620 nm處測(cè)定吸光值，記錄1 min內(nèi)的OD值變化，重復(fù)3次。PE酶活性以“ΔOD620/(min·g)”表示。

(5)纖維素酶(Cx)。參考曹建康等[15]的DNS還原法測(cè)定，略有改動(dòng)。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和酶液制備方法同PG活性測(cè)定。以10 g/L羧甲基纖維素鈉(CMC)溶液為反應(yīng)底物，分別加入新鮮酶液和失活酶液，之后步驟同PG活性測(cè)定，重復(fù)3次。Cx活性以“mg/(h·g)”表示。

1.3 棗果實(shí)成熟相關(guān)基因的表達(dá)量分析

用RNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，寶生物工程有限公司)提取各時(shí)期果實(shí)樣品總RNA，再用50 μL純化體系純化后，檢測(cè)RNA濃度和純度。用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa Prime ScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser，含qRT-PCR步驟)SYBR Green分析法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，使終質(zhì)量濃度為200 ng/μL。

以棗UBQ基因(登錄號(hào)為EU916200.1)為內(nèi)參基因[17]。根據(jù)駿棗轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果[14]，篩選30個(gè)與果實(shí)成熟軟化過(guò)程中細(xì)胞壁代謝相關(guān)的基因，在生工生物公司設(shè)計(jì)并合成特異性引物。以TaKaRa實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒SYBR GreenⅠ擴(kuò)增，以驗(yàn)證引物序列的正確性，最終選定15對(duì)引物進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。表1為內(nèi)參基因和目的基因的引物序列和擴(kuò)增信息。

表1 內(nèi)參基因與15個(gè)目的基因的引物序列、擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)Table 1 Primer sequences and amplification information of reference and target genes

表1(續(xù)) Continued Table 1

注：UBQ.內(nèi)參基因；PG-1NCC.多聚半乳糖醛酸酶-1-非催化亞基；PG-QRT3.多聚半乳糖醛酸酶-QRT3；PE.果膠酯酶基因；PE-2PR.果膠酯酶-2前體；exo-PG.外切多聚半乳糖醛酸酶基因；CelS-CS.纖維素合酶A催化亞基；EGase.內(nèi)切1,4-β-葡萄糖苷酶基因；β-Glu40.β-葡萄糖苷酶40；GEGlu7.葡聚糖-內(nèi)切-1,3-β-葡萄糖苷酶7；EnGase25.內(nèi)切葡聚糖酶25；XTH6.木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶6；Gal17-1.β-半乳糖苷酶17-1。表3、5、6同。

Note:UBQ.Reference gene;PG-1NCC.Plygalacturonase-1 non-catalytic subunit;PG-QTR3.Polygalacturonase-QRT3;PE.Pectinesterase gene;PE-2PR.Pectinesterase-2 precursor;exo-PG.Exo-Plygalacturonase gene;CelS-CS.Cellulose synthase A catalytic subunit;EGase.Endo-1,4-β-glucanase gene;β-Glu40.β-Glucosidase 40;GEGlu7.Glucan endo-1,3-β-glucosidase 7;EnGase25.Endoglucanase 25;XTH6.Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolases 6;Gal17-1.β-Galactosidase 17-1.The same for Table 3，Table 5 and Table 6.

在熒光定量PCR儀上(Bio-Rad CFX9)對(duì)選定的引物進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系10 μL，其中包含5.0 μL SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ，0.4 μL上游引物，0.4 μL下游引物，1 μL cDNA和3.2 μL dH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。根據(jù)F=2-ΔΔCT計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和Duncan’s多重比較，用Excel 2010和SigmaPlot 12.5繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 駿棗成熟過(guò)程中果實(shí)生理指標(biāo)的變化

駿棗果實(shí)成熟和軟化過(guò)程中外觀形態(tài)、硬度、含水量、TSS含量及色澤的變化如圖1和圖2 所示。

WM.白熟期；TR.初紅期；HR.半紅期；FR.全紅期；ER.完熟前期；MR.完熟中期；LR.完熟后期。下圖同 WM.White mature;TR.Turning-red;HR.Half red;FR.Full red;ER.Early ripe;MR.Middle ripe;LR.Late ripe.The same below圖1 駿棗果實(shí)各發(fā)育時(shí)期外觀形態(tài)的變化Fig.1 Morphological change of ‘Junzao’ fruit during developmental stages

駿棗果實(shí)成熟經(jīng)歷白熟、脆熟和完熟期，果實(shí)逐漸著色，于完熟期開(kāi)始軟化，失水皺縮；駿棗白熟期果實(shí)硬度最大，完熟后期硬度顯著減小。果實(shí)含水量從白熟期到完熟前期逐漸下降，完熟中期有所增加，完熟3個(gè)時(shí)期平均含水量為63.15%。果實(shí)TSS含量從白熟期到完熟前期呈線性增加趨勢(shì)，由14.89%增至28.26%，體現(xiàn)了果實(shí)中可溶性糖、酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累。果實(shí)從白熟期至全紅期L*顯著減小，表明果實(shí)表面由明變暗；a*顯著增大，表明果實(shí)由綠變紅；b*逐漸減小，表明果實(shí)由黃變藍(lán)。完熟3個(gè)時(shí)期內(nèi)L*、a*和b*數(shù)值呈穩(wěn)定狀態(tài)，表明果實(shí)完全著色后色澤幾乎無(wú)變化。

標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下圖同Lower case letters indicate significant difference(P<0.05).The same below

2.2 駿棗果實(shí)成熟過(guò)程中細(xì)胞壁相關(guān)生理指標(biāo)的變化

駿棗果實(shí)成熟過(guò)程中果膠、纖維素含量變化如圖3所示。由圖3可見(jiàn)，果膠含量、原果膠(PP)和可溶性果膠(SP)含量均無(wú)顯著變化，完熟期纖維素含量顯著高于脆熟期。

3種細(xì)胞壁物質(zhì)相關(guān)酶類(lèi)的活性變化如表2所示，隨著駿棗果實(shí)成熟，PG活性呈波動(dòng)狀態(tài)但變化不顯著，表明在駿棗果實(shí)軟化關(guān)鍵期(由全紅期轉(zhuǎn)至完熟期)PG并未起到關(guān)鍵作用；PE活性在完熟期有所增加但不顯著；Cx活性變化與PE相似，特別是在完熟前期活性升高。

圖3 駿棗果實(shí)各發(fā)育時(shí)期果膠和纖維素含量的變化Fig.3 Changes of pectin content and cellulose content in ‘Junzao’ fruit during developmental stages

發(fā)育時(shí)期 Developmental stage PG活性/(mg·h-1·g-1)PG activityPE活性/(ΔOD620·min-1·g-1)PE activityCx活性/(mg·h-1·g-1)Cx activity白熟期 White mature1.03±0.01 a0.09±0.03 a0.24±0.12 a初紅期 Turning-red0.37±0.12 b0.09±0.02 a0.14±0.05 a半紅期 Half red0.80±0.55 ab0.09±0.03 a0.17±0.08 a全紅期 Full red0.68±0.32 ab0.08±0.01 a0.15±0.03 a完熟前期 Early ripe0.49±0.07 ab0.12±0.02 a0.34±0.09 a完熟中期 Middle ripe0.71±0.14 ab0.11±0.02 a0.26±0.16 a完熟后期 Late ripe0.43±0.18 b0.12±0.01 a0.33±0.14 a

2.3 駿棗果實(shí)成熟過(guò)程中果實(shí)軟化相關(guān)基因表達(dá)量的變化

由圖4可知，PG基因家族3個(gè)基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)基本一致，從白熟期開(kāi)始表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，到完熟期時(shí)表達(dá)量接近0，白熟期到全紅期的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果[14]一致。PE基因家族3個(gè)基因表達(dá)均呈“先升后降”的變化趨勢(shì)，PE-3在初紅期表達(dá)量最高，PE1和PE-2PR均在半紅期表達(dá)量最高，3個(gè)基因在完熟期表達(dá)量已顯著降至低水平，PE-2PR在白熟期和脆熟期的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果[14]一致。

圖4 駿棗果實(shí)各發(fā)育時(shí)期PG和PE基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of genes involving in polygalacturonases and pectinesterases at seven developmental stages in ‘Junzao’ fruit

與纖維素酶相關(guān)的基因在駿棗果實(shí)成熟期的表達(dá)量如表3所示。CelS-CS3和CelS-CS9在脆熟期較穩(wěn)定，完熟期后表達(dá)量下降到低水平，表明駿棗纖維素合成調(diào)控主要在脆熟期，完熟期被抑制。EGase1與EGase2的表達(dá)量呈“先升后降”趨勢(shì)，分別在半紅期和全紅期達(dá)到最大，完熟后期表達(dá)量最低，EGase1在前4個(gè)時(shí)期的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄結(jié)果[14]一致。此外，GEGlu7和EnGase25的表達(dá)量變化趨勢(shì)同樣與轉(zhuǎn)錄結(jié)果[14]一致，且前4個(gè)時(shí)期表達(dá)量顯著高于完熟3個(gè)時(shí)期。而β-Glu40從初紅期到半紅期表達(dá)量急劇增加，之后緩慢下降，但直至完熟后期仍高于初紅期。

表3 駿棗果實(shí)各發(fā)育時(shí)期纖維素合成酶和纖維素酶基因的相對(duì)表達(dá)量Table 3 Relative expression levels of genes involving in cellulose synthases and cellulases at seven developmental stages in ‘Junzao’ fruit

與棗果實(shí)細(xì)胞壁代謝相關(guān)的2個(gè)基因XTH6和Gal17-1的表達(dá)情況如圖5所示。圖5顯示，二者表達(dá)量均呈“先升后降”的趨勢(shì)，分別在半紅期和全紅期達(dá)到最高水平；XTH6表達(dá)量在半紅期后顯著下降，Gal17-1表達(dá)量在全紅期后顯著下降至較低水平。

圖5 駿棗果實(shí)各發(fā)育時(shí)期XTH6和Gal17-1基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of genes involving in XTH6 and Gal17-1 at seven developmental stages in ‘Junzao’ fruit

2.4 駿棗果實(shí)成熟生理指標(biāo)與基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

駿棗果實(shí)成熟生理指標(biāo)與基因表達(dá)量的相關(guān)性如表4-6所示。由表4可知，駿棗果實(shí)成熟和軟化過(guò)程中硬度與含水量無(wú)顯著相關(guān)性，TSS含量與含水量呈顯著負(fù)相關(guān)。果膠含量與纖維素含量呈顯著正相關(guān)，與硬度、含水量呈顯著負(fù)相關(guān)；纖維素含量與含水量呈極顯著負(fù)相關(guān)。3種酶中，PG活性與果膠和纖維素含量無(wú)顯著相關(guān)性，PE、Cx活性與果膠和纖維素含量總體呈顯著正相關(guān)。

由表5可知，3個(gè)PG基因表達(dá)量與果膠含量和PG活性間相關(guān)性總體較小，只有PG-1NCC與PG活性呈顯著正相關(guān)，exo-PG與果膠含量呈顯著負(fù)相關(guān)。3個(gè)PE基因與果膠含量和PE活性均呈顯著負(fù)相關(guān)，其中PE1和PE-2PR表達(dá)量與PE活性呈極顯著負(fù)相關(guān)；此外，Gal17-1表達(dá)量與果膠含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

由表6可知，CelS-CS3、CelS-CS9、GEGlu7、EnGase25與纖維素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，Glu40與纖維素含量、Cx活性無(wú)顯著相關(guān)性，XTH6表達(dá)量與纖維素含量無(wú)顯著相關(guān)性。

表4 駿棗果實(shí)成熟過(guò)程中細(xì)胞壁代謝生理指標(biāo)間的相關(guān)性Table 4 Correlation of physiological indexes during fruit developmental stages in ‘Junzao’

注：*.在P<0.05 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)；**.在P<0.01 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。下表同。

Note:*.Significant linear correlation ofP<0.05;**.Significant linear correlation ofP<0.01.The same below.

表5 駿棗果實(shí)成熟過(guò)程中果膠含量、果膠酶活性與其基因表達(dá)量的相關(guān)性Table 5 Correlation of pectin content with pectinesterases activity and related gene expression during fruit developmental stages in ‘Junzao’

表6 駿棗果實(shí)成熟過(guò)程中纖維素含量、纖維素酶活性與其基因表達(dá)量的相關(guān)性Table 6 Correlation of cellulose content with cellulase activity and related gene expression during fruit developmental stages in ‘Junzao’

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，從白熟期到脆熟期，駿棗果實(shí)硬度無(wú)顯著變化，完熟期果實(shí)變軟，硬度和含水量減小。隨著果實(shí)成熟，駿棗可溶性固形物含量逐漸增加，表明糖、酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸積累。從白熟到脆熟期，駿棗果實(shí)果皮由綠白色變?yōu)榧t色，完全著色后果皮顏色無(wú)顯著變化，果肉由綠白色變?yōu)楹稚?，這與金絲小棗的顏色變化[18]基本一致。隨著駿棗果實(shí)的成熟，其果膠含量無(wú)顯著變化，纖維素含量到完熟期時(shí)顯著增加，這與果實(shí)成熟軟化過(guò)程中細(xì)胞壁纖維素微纖絲結(jié)構(gòu)崩解但相對(duì)含量未發(fā)生變化有關(guān)[5]；同時(shí)，完熟期果實(shí)軟化失水也是造成細(xì)胞壁干物質(zhì)含量不減反增的重要原因。駿棗果實(shí)成熟過(guò)程中可溶性果膠、纖維素含量變化與甜橙一致，甜橙成熟期膳食纖維主要由纖維素和可溶性果膠構(gòu)成[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，PG活性在駿棗成熟過(guò)程中呈波動(dòng)狀態(tài)，與果實(shí)硬度、含水量相關(guān)性不強(qiáng)。其3個(gè)調(diào)控基因(PG-1NCC、PG-QRT3和exo-PG)隨著果實(shí)發(fā)育成熟，表達(dá)量逐漸降至較低水平，與果膠含量、PG活性的相關(guān)性較弱，未在果實(shí)完熟期的軟化過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。PG在許多水果中被認(rèn)為是引起果實(shí)軟化的關(guān)鍵因子[20-22]，也有研究認(rèn)為，PG并非果實(shí)軟化的關(guān)鍵因素，且不能獨(dú)立引起果實(shí)軟化[23]。有研究表明，PG基因結(jié)構(gòu)的變異是造成其功能差異的主要原因[24]。

本研究發(fā)現(xiàn)，PE活性在駿棗成熟過(guò)程中有所增加，與果實(shí)含水量、果膠和纖維素含量變化顯著相關(guān)，參與果實(shí)成熟和軟化；3個(gè)PE基因(PE-3、PE1和PE-2PR)在脆熟期表達(dá)量最高，完熟期則降低，表明PE基因?qū)︱E棗果實(shí)軟化有先導(dǎo)作用。這與PE在冬棗等品種軟化中的作用[25]一致。PE活性在番茄、桃等果實(shí)成熟期也有所增加[26-27]，與本研究結(jié)果一致。

Cx酶是由多種纖維素酶類(lèi)組成的混合酶。本研究發(fā)現(xiàn)，駿棗成熟過(guò)程中纖維素含量與Cx活性呈顯著相關(guān)。2個(gè)纖維素合成酶基因CelS-CS3和CelS-CS9在白熟期和脆熟期大量表達(dá)，與纖維素含量變化呈極顯著負(fù)相關(guān)。GEGlu7和EnGase25也在白熟期和脆熟期大量表達(dá)，表明其對(duì)纖維素酶的調(diào)控集中在白熟期和脆熟期。2個(gè)內(nèi)切葡萄糖苷酶基因EGase1、EGase2在脆熟期表達(dá)量最高，表明它們對(duì)纖維素酶的調(diào)控集中在脆熟期，這與番茄中LeCel7和LeCel2 mRNA的表達(dá)[28-29]相似。駿棗中β-葡萄糖苷酶基因β-Glu40也在脆熟期表達(dá)量最高，且在完熟期3個(gè)時(shí)期的表達(dá)量相比其他基因較高，表明其對(duì)纖維素酶的調(diào)控持續(xù)至完熟后期，對(duì)駿棗完熟期的軟化具有重要作用。本研究中，XTH6和Gal17-1對(duì)駿棗果實(shí)調(diào)控的關(guān)鍵時(shí)期在脆熟期；有研究表明，梨棗和沾化冬棗中ZjXTH1和ZjXTH2在果實(shí)轉(zhuǎn)紅期的調(diào)控作用顯著[12]，這些棗果實(shí)中XTH基因的表達(dá)與蘋(píng)果和獼猴桃果實(shí)成熟軟化過(guò)程中一些XTH基因的表達(dá)趨勢(shì)[30-31]較一致。

4 結(jié) 論

駿棗從完熟期開(kāi)始成熟和軟化，果實(shí)硬度和含水量下降，果膠和纖維素含量、PE和Cx活性都在完熟期有所增加。3個(gè)PG相關(guān)基因表達(dá)量逐漸降低，且在完熟期降到最低水平；3個(gè)PE相關(guān)基因在脆熟期的表達(dá)量最高，在完熟期也降到最低水平；在7個(gè)纖維素及其酶類(lèi)的相關(guān)基因中，β-Glu40在完熟期有較高表達(dá)量。上述結(jié)果說(shuō)明，PG及相關(guān)基因并非駿棗果實(shí)成熟和軟化的關(guān)鍵因子，PE相關(guān)基因?qū)麑?shí)軟化具有先導(dǎo)作用，纖維素及其酶類(lèi)相關(guān)基因聯(lián)合調(diào)控果實(shí)成熟過(guò)程，β-Glu40對(duì)果實(shí)成熟后期的軟化具有重要作用。這些生理指標(biāo)的變化和相關(guān)基因的表達(dá)模式及調(diào)控功能，對(duì)于研究棗果實(shí)成熟的細(xì)胞壁代謝具有重要意義。