手工制作組織芯片的方法

朱偉峰 彭鳳英 翁秀琴 蔡曉雯

組織芯片（Tissue Chips）是把數(shù)十個(gè)至數(shù)百個(gè)患者的組織整齊有序的排列到同一個(gè)蠟塊上，進(jìn)而制成組織切片用于HE、組化染色、DNA和RNA檢測(cè)分析等[1]。1998年Kononen等首次提出組織芯片的概念并證實(shí)組織芯片的實(shí)用價(jià)值[2]。從此組織芯片得到飛速發(fā)展，它最大的作用是將基因、蛋白水平的研究與組織形態(tài)學(xué)相結(jié)合，應(yīng)用同一實(shí)驗(yàn)條件同時(shí)研究大量不同患者組織樣本（高通量），減少實(shí)驗(yàn)誤差，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更可靠，極大地提高實(shí)驗(yàn)效率，并節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本和人力[3-5]。但組織芯片技術(shù)一般采用進(jìn)口的組織微陣列儀或組織芯片制作儀，價(jià)格高，不適于基層[6]。本文通過臨床經(jīng)驗(yàn)及設(shè)計(jì)，介紹一種建議組織芯片制作方法，操作簡(jiǎn)單，效果滿意，適用性廣泛，以供臨床參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2015年12月—2017年12月福建省腫瘤醫(yī)院病理科60例肺癌患者病例制作組織標(biāo)本。

1.2 儀器設(shè)備

石蠟（德國(guó) Leica，Histowax），組織芯片儀（Quick-Ray 韓國(guó)UNITMA），Thermo切片機(jī)（HM325），隔水式培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)為GHP9180），一次性刀片（Leica），Leica攤片機(jī)（型號(hào)為HI 1210）和Leica烤片機(jī)（型號(hào)為HI 1220），Thermo包埋機(jī)（HISTOSTAR）。

1.3 方法

1.3.1 組織處理 所有標(biāo)本均經(jīng)4%中性緩沖福爾馬林固定，取材，脫水，包埋，切片和HE染色。

1.3.2 組織芯片制作過程 （1）空白蠟塊制作：把高熔點(diǎn)的蠟（58～60℃）制成空白蠟塊；（2）軟化：把空白蠟塊倒扣在烤片板上軟化石蠟；（3）組織芯片設(shè)計(jì)：根據(jù)患者例數(shù)及空白蠟塊用記號(hào)筆設(shè)置位點(diǎn)，選擇手工芯片儀直徑2 mm的取樣頭；（4）打孔：將取樣頭在軟化空白蠟塊上穿孔；（5）取樣：病理醫(yī)師HE鏡下選取代表性區(qū)域并用記號(hào)筆標(biāo)記并與對(duì)應(yīng)蠟塊進(jìn)行取樣定位并倒扣在60℃烤片板，用組織芯片搶取樣并按照芯片陣列設(shè)計(jì)圖打入對(duì)應(yīng)的軟化蠟塊孔，依次將所有樣本植入芯片蠟塊；（6）移除加樣好的芯片蠟塊使之硬化收縮并抹平使各個(gè)組織盡量在同一平面，用刀片使組織芯片與包埋盒分離；（7）二次包埋：在60℃溫箱用低熔點(diǎn)的蠟（56℃）把組織芯片放包埋框，觀察到芯片蠟塊達(dá)到相應(yīng)的溶解狀態(tài)時(shí)重新包埋，放入冰盤或冷凍臺(tái)冷卻；（8）蠟塊儲(chǔ)存：蠟塊冷卻后使之與包埋框分離，除去蠟塊四周蠟邊備用。

1.3.3 組織芯片切片 組織芯片切片步驟：（1）組織芯片蠟塊放4℃冰箱預(yù)冷保證芯片溫度一致，有利于切片；（2）取出固定于切片頭，認(rèn)真耐心的調(diào)試切片刀和蠟塊面的角度，減少修片造成的組織損傷，盡量選用鋒利的一次性刀片，然后做3μm厚的連續(xù)切片；（3）低濃度酒精漂片；（4）48℃水浴展片；（5）防脫帶膠片撈片；（6）風(fēng)干、60℃烤片板烤片30 min后常溫備用。

2 結(jié)果

制備的組織芯片各個(gè)組織為所要組織形態(tài)學(xué)區(qū)域，蠟塊完整，組織排列整齊，蠟塊未見開裂及組織丟失，組織與蠟塊結(jié)合緊密，組織芯片能被完整切出。

3 討論

組織芯片與傳統(tǒng)石蠟切片相比，組織芯片在實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、科學(xué)性、可比性上都具有優(yōu)越性[7]。同樣我們也可以將芯片用于制作免疫組化對(duì)照用的“套餐式”芯片[8]，Low等[9]報(bào)道了一種“香腸”組織包埋法，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且耗材，隨后經(jīng)過多次改良也制成多組織陽(yáng)性對(duì)照片，用于免疫組化染色。通過組織芯片的制作過程我們應(yīng)認(rèn)識(shí)并了解它在實(shí)驗(yàn)室的重要地位，不斷發(fā)展組織芯片技術(shù)。

本實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單易行，受體蠟塊也是自己制備，幾乎不需要任何費(fèi)用，制作組織芯片涉及較多的蠟塊和切片，制作步驟較多，因此，其操作過程要求細(xì)致精準(zhǔn)，否則組織芯片的完整性就難以保證。通過在組織芯片的制作過程中，總結(jié)以下幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：（1）患者標(biāo)本的選取：一定要把蠟塊和相應(yīng)的HE對(duì)應(yīng)清楚，因?yàn)闃?biāo)本存放時(shí)間長(zhǎng)，可能收縮變形導(dǎo)致HE上標(biāo)記的位點(diǎn)和蠟塊對(duì)應(yīng)的位置有誤差[10]，可能導(dǎo)致取到無(wú)效組織，所以盡量選取組織豐富區(qū)域（一般都是診斷醫(yī)生定位）；（2）受體蠟塊制備嚴(yán)格按照組織陣列設(shè)計(jì)圖操作，避免錯(cuò)樣、漏樣；（3）制作受體蠟塊烤片板預(yù)熱使蠟軟化便于穿孔，防止蠟開裂[11]；（4）鉆頭在使用前用電吹風(fēng)或放溫箱預(yù)熱，再放入二甲苯或松節(jié)油浸泡除去殘留蠟；（5）芯片抹平很重要，可以保證組織因?yàn)榍忻娌黄秸苟鴮?dǎo)致切片損傷組織，可以在組織全部打入孔后反過來把切面在試驗(yàn)臺(tái)上壓實(shí)抹平；（6）包埋石蠟與受體石蠟熔點(diǎn)接近，這樣更有利于石蠟的融合，也會(huì)有利于切片；（7）由于組織芯片包含各種各樣或者時(shí)間長(zhǎng)短不一的組織，而組織的質(zhì)地和軟硬都不盡相同，所以盡量用鋒利的刀片切片，這樣也比較不易出現(xiàn)刀痕皺褶[12]；（8）組織芯片在切片時(shí)調(diào)整切片切面要求嚴(yán)格，前期角度調(diào)整后可減少組織較薄位點(diǎn)的損失；（9）組織芯片要切片完整、美觀、厚薄均勻、無(wú)刀痕皺褶，這對(duì)操作人員的技術(shù)水平有極高的要求，一塊組織芯片的組織數(shù)量越多，它的制作難度就越大。

總之，組織芯片的實(shí)用性很高，它的制作是一項(xiàng)經(jīng)濟(jì)高效的技術(shù)。操作人員要通過細(xì)心了解，耐心安排，專心的操作，盡量保證組織芯片的制作質(zhì)量。