隔藥灸對(duì)克羅恩病大鼠結(jié)腸p38MAPK、ERK1/2及c-fos調(diào)節(jié)作用的研究＊

吳麗潔，李茜瑩，楊延婷，楊 玲，施 征，趙粹英，吳煥淦，李志元，張 丹＊＊，馬曉芃，＊＊

（1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)岳陽(yáng)臨床醫(yī)學(xué)院 上海 201203；2. 上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所 上海 200030；3. 浙江省中醫(yī)院 杭州 310060）

克羅恩?。–rohn's Disease，CD）是一種原因不明的腸道炎癥性疾病[1]，慢性起病，其主要臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹瀉、腹痛，可有血便、腹部包塊、瘺管形成或腸梗阻，并伴有不同程度的體重減輕、發(fā)熱、食欲不振、乏力、貧血等全身癥狀。嚴(yán)重者病程遷延難愈，預(yù)后不良，并可發(fā)生癌變[2]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3]。目前治療CD 的原則是實(shí)現(xiàn)臨床和內(nèi)鏡緩解，以避免疾病進(jìn)展并最小化手術(shù)切除，達(dá)到維持緩解，黏膜治愈，提高患者生活質(zhì)量的目的[3]。CD 的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，研究發(fā)現(xiàn)，CD 患者結(jié)腸中的磷酸化p38α、ERK1/2 水平明顯增高，p38α選擇性抑制藥物可顯著下調(diào)MAPK通路的激活和促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的分泌，提示p38MAPK、ERK1/2 與CD 發(fā)病關(guān)系密切[4,5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)艾灸可下調(diào)CD 結(jié)腸TNF-α、IL-1β等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，改善腸道炎癥、促進(jìn)黏膜損傷的修復(fù)[6-10]。在此基礎(chǔ)上，本課題擬觀察隔藥灸對(duì)克羅恩大鼠結(jié)腸p38MAPK、ERK1/2 及cfos的影響，探討隔藥灸治療克羅恩病的抗炎機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠36 只，體重（150 ± 20）g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件：溫度（20±1）°C，濕度50%左右，自由飲水、攝食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，大鼠飲食、活動(dòng)均正常后開始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與試劑

組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、切片機(jī)、烤片機(jī)（萊卡公司，德國(guó)）；光學(xué)顯微鏡及senscell 分析軟件（Olympus，日本）；轉(zhuǎn)膜電泳儀、垂直電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad,美國(guó)）；5%（w/v）2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）（Sigma，美國(guó)）；p38MAPK、c-fosELISA 試劑盒（源葉，中國(guó)）；BCA 蛋白濃度試劑盒、SYBR Green PCR 試劑盒（Thermo，美國(guó)）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas，加拿大）；Trizol（Invitrogen，美國(guó)）；Tris、TEMED（碧云天，中國(guó)）、SDSrunningbuffer（Bio-Rad,美 國(guó)）、ERK1/2（CST,美國(guó)）、GAPDH、二抗（博士德，中國(guó)）；蘇木素染色液、伊紅-染色液（南京建成，中國(guó)）；戊巴比妥鈉、甲醇、異丙醇、無水乙醇、氯仿、二甲苯、中性樹膠、甘氨酸（國(guó)藥集團(tuán)，中國(guó)）。

1.3 模型制備方法

參照國(guó)際公認(rèn)的Morris 法[11]，應(yīng)用TNBS 合50%乙醇溶液造模。造模開始前大鼠禁食、不禁水24 h，采用2%戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1）行腹腔注射麻醉。將無水乙醇加雙蒸水配成50%乙醇，然后將5%（W/V）的TNBS 與50%乙醇按照體積比2∶1 混合制備TNBS 灌腸液。以TNBS 灌腸液3mL·kg-1（TNBS 用量為100 mg·kg-1）灌腸造模。灌腸針連接注射器，并抽取適當(dāng)灌腸液，大鼠體位為頭下尾上，灌腸時(shí)將灌腸針緩緩插入大鼠肛門6-8 cm，注入灌腸液，拔出灌腸針后再將大鼠倒立1 min，以防藥液溢出。每7 d 大鼠重復(fù)灌腸1次，共灌腸4 次。造模結(jié)束后，每組隨機(jī)抽取1 只大鼠，取結(jié)腸組織進(jìn)行蘇木素-伊紅（Hematoxylin-eosin staining，HE）染色光鏡下觀察，以鑒定模型制備是否成功。在確定模型制備成功的基礎(chǔ)上開始干預(yù)治療。

1.4 分組與治療

SD 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、隔藥灸組和假灸組，每組9 只。隔藥灸組，選取天樞穴（雙側(cè)）、氣海穴進(jìn)行隔藥灸，每次每穴各灸2 壯（約10 min），每日灸治1 次，共治療7 次。藥餅的主藥為附子粉，隔藥灸前用黃酒調(diào)和，并用動(dòng)物藥餅專用模具壓制成藥餅備用；同時(shí)用模具將艾絨壓實(shí)制成錐形艾炷備用，艾炷的重量為90 mg。隔藥灸操作時(shí)，將艾炷置于藥餅上，放置在穴位上點(diǎn)燃艾炷后施灸。假灸組除不點(diǎn)燃艾炷外，余操作均同隔藥灸組。模型組與正常組不進(jìn)行任何治療，只作與隔藥灸組相同的抓取與固定。

1.5 樣本處理與制備

各組大鼠干預(yù)結(jié)束后，禁食、不禁水24 h，腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉后，沿大鼠的腹正中線剪開腹部皮膚，充分暴露大鼠的直腸、結(jié)腸部分，自恥骨聯(lián)合處—盲腸取下結(jié)腸，沿腸系膜縱軸剖開，取自上而下的3 cm 結(jié)腸組織，用4°C 冷生理鹽水沖洗，分成3段，1段放入4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定；2段放入凍存管置于液氮內(nèi)，后移入-80°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 指標(biāo)檢測(cè)方法

1.6.1 結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察

HE 染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化。操作步驟主要包括：結(jié)腸組織脫水、包埋、切片、烤片處理后，置于二甲苯、梯度酒精中脫蠟脫水，蘇木素染色，1%鹽酸酒精分化，自來水返藍(lán)，0.5%伊紅染色，再依次經(jīng)梯度酒精浸泡，二甲苯透明后，中性樹膠封片。

1.6.2 結(jié)腸p38MAPK、ERK1/2、c-fos蛋白檢測(cè)

取出-80°C 保存的結(jié)腸組織，裂解后勻漿，離心后取上清。采用BCA 蛋白定量法測(cè)定樣本蛋白濃度。ERK1/2 采用Western blot 方法檢測(cè)，蛋白變性后，經(jīng)電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉后，加入一抗ERK1/2（1：1000），4°C 孵育過夜，PBST 緩沖液洗膜，加入二抗（兔抗）（1：1000）室溫孵育1 h，PBST 緩沖液洗膜，加入一抗GAPDH（1：1000），室溫孵育3 h，PBST 緩沖液洗膜，加入二抗（兔抗）室溫孵育1 h，PBST 緩沖液洗膜后，凝膠成像系統(tǒng)拍攝條帶圖，使用Image J軟件分析灰度值。p38MAPK、c-fos 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Enzyme Linked Immunoserbent Assay，ELISA）測(cè)定，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行，適當(dāng)比例稀釋待測(cè)樣本后，在96 孔板中依次加入待測(cè)樣本、親和素、酶標(biāo)試劑，充分混勻后，37°C 孵育。去除以上液體，再依次加入顯色劑A、顯色劑B，充分混合后，37°C 避光顯色。最后，加入終止液終止顯色反應(yīng)。酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定OD 值，蛋白濃度與OD 值之間呈正線性關(guān)系，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出標(biāo)本中目的蛋白的濃度。

1.6.3 結(jié)腸p38MAPK的mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR）檢測(cè)，主要步驟包括：①組織總RNA 的抽提；②總RNA 中DNA 的消 除：DNase I 1 μL;10 × DNase I Buffer 1 μL;總RNA≦1 ng;DEPC-H2O nμL。③逆轉(zhuǎn)錄cDNA: RNA-Primer Mix 12 μL；5 × RT Reaction Buffer 5 μL；25 mMdNTPs 1 μL；25 U·μL-1RNase Inhibitor 1 μL;200 U·μL-1M-MLV Rtase 1 μL；Oligo (dt)18 1 μL；ddH2O（DNase-free）4 μL。PCR 擴(kuò)增：SYBR Green Mix 12.5 μL；Primer F 0.5 μL；Primer R 0.5 μL；ddH2O 9.5 μL；cDNA 模板2 μL。4Real-time PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95°C，10 min（95°C，15 Sec；60°C，45 Sec）× 40；

95°C，15 Sec；60°C，1 min；95°C，15 Sec；60°C，15 Sec。記錄Ct值，以GAPDH 作為內(nèi)參，蛋白引物設(shè)計(jì)見表1。通過2-△Ct法計(jì)算目的蛋白mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布資料采用X—± s 的形式表示；不符合正態(tài)分布的資料采用Median（min-max）的形式表示。若各組方差齊等，則采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行檢驗(yàn)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則進(jìn)一步采用LSD 檢驗(yàn)做兩兩比較；若各組方差不齊，采用Game-Howell 分析。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為α=0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 p38MAPK mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物設(shè)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化

光鏡下觀察，正常組大鼠結(jié)腸黏膜、腺體形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)規(guī)則，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見潰瘍。模型組結(jié)腸組織黏膜上皮缺失，腺體排列不規(guī)則，黏膜下層明顯增厚，血管增生，黏膜層及黏膜下層可見較多的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，淋巴組織增生，黏膜有裂隙狀潰瘍形成，部分潰瘍可深達(dá)腸壁肌層，偶見肉芽腫形成以及纖維化瘢痕。隔藥灸組可見愈合性潰瘍形成，黏膜上皮較為完整，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞增生，腺體排列較為規(guī)則，黏膜下層增厚減輕，可見少量成纖維細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。假灸組大鼠結(jié)腸損傷程度、炎癥反應(yīng)與模型組類似（圖1）。

2.2 結(jié)腸p38MAPK蛋白和mRNA的檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸p38MAPK 蛋白及mRNA 表達(dá)明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。與模型組比較，隔藥灸組大鼠p38MAPK 蛋白及mRNA 表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01、P＜0.05）；假灸組大鼠均無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與假灸組比較，隔藥灸組大鼠p38MAPK 蛋白及mRNA 表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01、P＜0.05）（表2）。

2.3 結(jié)腸ERK1/2蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸ERK1/2 蛋白表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，隔藥灸組ERK1/2 蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；假灸組大鼠ERK1/2 蛋白表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與假灸組比較，隔藥灸組ERK1/2 蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3，圖2）。

2.4 結(jié)腸c-fos蛋白檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸c-fos蛋白濃度明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，隔藥灸組c-fos 蛋白濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；假灸組大鼠c-fos 蛋白表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與假灸組比較，隔藥灸組大鼠c-fos蛋白濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表4）。

3 討論

克羅恩病是一種慢性炎癥性疾病，反復(fù)發(fā)病，臨床表現(xiàn)多變，根據(jù)不同的臨床癥狀，可歸屬于中醫(yī)“腹痛”、“腹瀉”、“痔漏”“積聚”等范疇。其病灶呈節(jié)段性分布，以末端回腸和鄰近結(jié)腸最為常見；其病理學(xué)特點(diǎn)主要為節(jié)段性全壁性腸炎、裂隙狀潰瘍、黏膜下層增厚、淋巴細(xì)胞聚集、結(jié)節(jié)病樣肉芽腫以及鵝卵石樣改變等。具體病因及發(fā)病機(jī)制尚未十分明確，多與遺傳、自身免疫缺陷等因素相關(guān)。其發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì)，且復(fù)發(fā)率高，預(yù)后不佳[12]。近年來，臨床研究發(fā)現(xiàn)艾灸能有效緩解輕、中度克羅恩病患者的臨床癥狀及抑郁、焦慮情緒[13-16]，是治療輕、中度克羅恩病的有效方法之一。深入研究艾灸（隔藥灸）治療克羅恩病的作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步提高臨床療效、促進(jìn)臨床應(yīng)用。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果

表2 各組大鼠結(jié)腸p38MAPK蛋白及mRNA表達(dá)的比較

表3 各組大鼠結(jié)腸ERK1/2蛋白表達(dá)的比較

表4 各組大鼠結(jié)腸c-fos蛋白濃度表達(dá)的比較

圖2 各組大鼠結(jié)腸ERK1/2蛋白表達(dá)條帶圖

目前在炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）的研究中發(fā)現(xiàn)，促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族能夠抑制上皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)腸道細(xì)胞凋亡[17]，且MAPK 的不同亞型在IBD患者的結(jié)腸黏膜中顯著活化[18],在其發(fā)病過程中起重要的作用，其主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK/MAPK）、c-JUN 氨基末端激酶（JNK）、p38 MAPK 和ERK5/BMK1（BMK1）[19]。與其他MAPK 相比，p38 MAPK 在IBD 患者炎癥腸黏膜內(nèi)的活性較強(qiáng)[20]。Otsuka 等發(fā)現(xiàn)，CD 患者的結(jié)腸組織的固有肌層中p38MAPK和ERK1/2表達(dá)明顯增加；且在TNBS處理的小鼠中，骨髓細(xì)胞特異性缺失p38 小小鼠較正常小鼠炎癥表現(xiàn)較輕和疾病狀況得到改善[21]。Mulsow等發(fā)現(xiàn)，在復(fù)發(fā)性CD 狹窄患者中，可以通過抑制ERK 1/2 MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)降低TGF-導(dǎo)促纖維化作用，有望成為治療CD 的新靶標(biāo)[22]。Ko 等發(fā)現(xiàn)結(jié)腸上皮細(xì)胞中類桿菌毒素能導(dǎo)致MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)的快速激活，活化的MAPK 信號(hào)通過腸上皮細(xì)胞中的IKK-NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)HO-1 分子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]，而腸上皮細(xì)胞的凋亡是其炎癥發(fā)生的主要相關(guān)因素[24]，Piegholdt等的研究表明生物素A 和prunetin 可通過下調(diào)ERK 來改善上皮功能[25,26]。Zhang 等人發(fā)現(xiàn)MBF-DE 通過抑制NF-κB/p65 和MAPK/p38/ERK 信號(hào)減弱了LPS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥反應(yīng)[27]。Ihara 等發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸炎期間，ERK 和p38MAPK 對(duì)卡巴膽堿誘導(dǎo)的腸道收縮的作用顯著，導(dǎo)致結(jié)腸平滑肌收縮功能障礙[28]。這些研究均提示了p38MAPK、ERK 信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)可能是CD 發(fā)病的重要途徑之一。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，隔藥灸可以調(diào)節(jié)CD 大鼠結(jié)腸MAPK 家族中JNK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，起到緩解炎癥、促進(jìn)結(jié)腸損傷愈合的作用[29]。在此基礎(chǔ)上，研究隔藥灸對(duì)MAPK 家族中其他蛋白及相關(guān)通路的影響，進(jìn)一步完善隔藥灸對(duì)MAPK信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，有助于全面闡釋隔藥灸治療克羅恩病的作用機(jī)制。

在本研究中，模型組結(jié)腸組織黏膜上皮缺失，黏膜層及黏膜下層可見較多的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，有裂隙狀潰瘍形成。與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸炎癥表現(xiàn)明顯，且p38MAPK 和ERK1/2 的表達(dá)也較正常組明顯升高，提示p38MAPK 和ERK1/2 的過度表達(dá)可能與腸道的炎癥性表現(xiàn)密切相關(guān)；同時(shí)ERK1/2下游c-fos 蛋白水平也明顯升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[30]。c-fos能夠誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡，參與了結(jié)腸黏膜的損傷過程。與模型組比較，隔藥灸組可見愈合性潰瘍形成，黏膜上皮較為完整，p38MAPK、ERK1/2、c-fos 的表達(dá)也明顯降低，提示：隔藥灸能下調(diào)克羅恩大鼠結(jié)腸p38MAPK、ERK1/2、c-fos的表達(dá)，改善腸道炎癥、促進(jìn)腸道組織修復(fù)；下調(diào)結(jié)腸p38MAPK、ERK1/2、c-fos 表達(dá)可能是隔藥灸治療CD 的抗炎機(jī)制之一。本研究?jī)H觀察了隔藥灸對(duì)MAPK信號(hào)通路靶蛋白p38 MAPK、ERK1/2、c-fos的影響，缺少對(duì)p38MAPK和ERK 信號(hào)通路激活調(diào)節(jié)途徑的研究，尚需在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開展研究，有助于較為全面地揭示隔藥灸對(duì)克羅恩病結(jié)腸MAPK信號(hào)通路的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制。