不同模式的低氧訓(xùn)練對骨骼肌肌球蛋白合成及其mTOR信號通路的影響

楊加玲 王海軍

江蘇省連云港師范高等專科學(xué)校（連云港 222006）

高住高練（living high-training high，HiHi）和高住低練（living high-training low，HiLo）是低氧訓(xùn)練的兩種常見模式[1]，HiHi是在低氧環(huán)境中生活和訓(xùn)練，而Hi-Lo是在低氧條件下生活，但在常氧環(huán)境下進(jìn)行運(yùn)動訓(xùn)練。研究表明，在高原低氧和運(yùn)動缺氧的雙重刺激下，機(jī)體蛋白質(zhì)的降解率會大于其合成率，導(dǎo)致機(jī)體蛋白質(zhì)丟失，引起肌肉萎縮，肌力下降[2，3]，從而影響了高原訓(xùn)練的效果。與高原訓(xùn)練相比，HiLo可使骨骼肌蛋白質(zhì)丟失的程度減少，在一定程度上可維持骨骼肌的收縮力量[1]。但是，在模擬高原訓(xùn)練或HiLo過程中，骨骼肌蛋白質(zhì)含量降低的機(jī)制目前還不完全清楚。有研究表明，在骨骼肌蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)過程中，PI3K/Akt/mTOR（雷帕霉素靶蛋白）信號通路具有非常重要的促進(jìn)作用[4，5]，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的活性可明顯促進(jìn)骨骼肌的廢用性萎縮，而PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活可使骨骼肌廢用性萎縮的程度明顯下降[4]。但是，PI3K/Akt/mTOR及其下游信號通路在調(diào)節(jié)低氧運(yùn)動訓(xùn)練過程中骨骼肌合成中的作用目前研究很少。本研究對大鼠進(jìn)行低氧暴露和/或大強(qiáng)度的運(yùn)動訓(xùn)練，6周后測定大鼠腓腸肌中總蛋白（Pro）和肌球蛋白（Myo）含量，同時測定腓腸肌中PI3K、Akt含量以及mTOR、真核細(xì)胞延伸因子2（eukaryotic elongation factor 2，eEF2）和真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，eIF4E-binding proteins，4EBP-1）的mRNA表達(dá)，探討不同模式低氧訓(xùn)練過程中骨骼肌蛋白質(zhì)合成代謝的變化及其調(diào)節(jié)機(jī)制，旨在促進(jìn)低氧訓(xùn)練科學(xué)化。

1 對象與方法

1.1 實(shí)驗對象和分組

體重130～160 g的雄性SD大鼠50只，由江蘇大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，許可證號為SCXK（蘇）2013-0011。在室溫20～22℃的環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，每籠5只，喂飼國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物固體飼料，自由飲水。大鼠在3天的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)被分成常氧對照組（NC組，n=10）、低氧暴露組（HC組，n=10）、常氧訓(xùn)練組（NE組，n=10）、模擬高原訓(xùn)練組（HE組，n=10）和高住低練組（HiLo組，n=10）5組。

1.2 低氧與訓(xùn)練方案

NC和HC組分別在常氧和低氧環(huán)境中生活，不進(jìn)行運(yùn)動訓(xùn)練；NE和HE組分別在常氧和低氧環(huán)境中生活和訓(xùn)練；HiLo組在低氧環(huán)境中生活12 h，其余時間在常氧下生活和運(yùn)動訓(xùn)練。實(shí)驗所需要的低氧環(huán)境由The MAG-10 Mountain Air Generator模擬，在第1周內(nèi)將低氧艙中氧濃度從模擬海拔高度1600 m逐漸增加到3500 m，最終氧濃度為13.6%。NE、HE和HiLo組在下午進(jìn)行負(fù)重游泳訓(xùn)練，每周6天，訓(xùn)練6周。在第1周內(nèi)將常氧下和低氧下訓(xùn)練大鼠的負(fù)重逐漸增加到體重的1.9%（相當(dāng)于大鼠90%乳酸閾強(qiáng)度）[6]和1.7%[7]，游泳時間漸增到90 min，以后按照此運(yùn)動強(qiáng)度和時間進(jìn)行訓(xùn)練。游泳池為內(nèi)壁光滑的長方體塑料水桶（120 cm×80 cm×70 cm），游泳池水的深度保持身高的2倍以上，溫度維持在30～33℃之間。

1.3 取材

末次運(yùn)動訓(xùn)練后第2天上午進(jìn)行實(shí)驗取材，取材前禁食禁水12 h，腹腔注射20%的烏拉坦溶液對大鼠進(jìn)行麻醉后，快速分離腓腸肌，將筋膜和脂肪去除，裝于凍存管放入液氮中速凍，最后保存至-80℃冰箱。

1.4 指標(biāo)測試

腓腸肌Myo、PI3K、Akt含量采用ELISA測定，總蛋白含量采用BCA法測定，試劑盒由南京森貝伽生物科技有限公司提供，儀器為multiskan全波段酶標(biāo)儀。4EBP-1、eEF2和mTOR mRNA采用Real-time PCR法[7]，RNAiso Plus和cDNA合成試劑盒購自TaKaRa公司，SYBR Green Master（ROX）試劑盒購自Roche Diagnostics，測定儀器為ABI 7500 RT-PCR儀。由上海生物工程有限公司合成引物，序列見表1。

表1 各種指標(biāo)和GAPDH的引物序列

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗結(jié)果用x±s表示，NC、HC、NE和HE 4組之間進(jìn)行雙因素方差分析，HiLo、NC、HE 3組之間進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，P＜0.05有顯著性差異，P＜0.01有極顯著性差異，。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腓腸肌總Pro含量、Myo含量的變化

由表2、表3可知，無論是低氧暴露還是大強(qiáng)度的運(yùn)動訓(xùn)練，均使腓腸肌Pro含量顯著降低（P＜0.05，P=0.01），Myo含量也顯著下降（P＜0.01，P=0.05），低氧暴露與運(yùn)動訓(xùn)練雖然對降低腓腸肌Pro含量無顯著性交互作用，但對降低Myo含量有顯著性的交互作用（P＜0.05）；HiLo組腓腸肌Pro和Myo含量顯著低于NC組，但顯著高于HE組（P＜0.05）。

表2 各組腓腸肌Pro、Myo含量

表3 各組腓腸肌Pro、Myo含量的雙因素方差分析

2.2 各組實(shí)驗大鼠腓腸肌4E-BP1 和eEF2 mRNA表達(dá)量的變化

由表4、表5可知，對NC、NE、HC和HE組4組之間進(jìn)行雙因素方差分析，低氧暴露使腓腸肌4E-BP1 mRNA表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），eEF2mRNA表達(dá)有所降低，但無顯著性差異；而運(yùn)動訓(xùn)練使腓腸肌4E-BP1 mRNA表達(dá)量顯著升高，eEF2mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；低氧和大強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練對4EBP-1 mRNA表達(dá)的進(jìn)一步升高無顯著性交互作用，而對降低腓腸肌eEF2 mRNA表達(dá)有顯著性交互作用（P＜0.05）；HiLo組腓腸肌4E-BP1mRNA的表達(dá)顯著高于NC組，雖低于HE組，但無顯著性差異；eEF2mRNA表達(dá)與NC組相比無顯著性升高，但是顯著高于HE組（P＜0.01）。

表4 各組腓腸肌4E-BP1和eEF2的mRNA表達(dá)

表5 各組腓腸肌4E-BP1和eEF2 mRNA表達(dá)的雙因素方差分析

2.3 各組大鼠腓腸肌PI3K、Akt含量和mTORmRNA表達(dá)的變化

由表6、表7可知，對NC、NE、HC和HE組4組之間進(jìn)行雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)，低氧暴露使腓腸肌PI3K、Akt含量和mTOR mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01），運(yùn)動訓(xùn)練使PI3K含量和mTOR mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），低氧暴露與運(yùn)動訓(xùn)練對降低腓腸肌PI3K和Akt含量無顯著性交互作用，但對降低mTOR mRNA表達(dá)具有顯著性的交互作用（P＜0.01）；HiLo組腓腸肌PI3K、Akt含量和mTOR mRNA表達(dá)與NC組相比無顯著性變化，但PI3K含量和mTOR mRNA表達(dá)顯著高于HE組（P＜0.05）。

表6 各組腓腸肌PI3K、Akt的含量和mTOR的mRNA表達(dá)

表7 各組腓腸肌PI3K、Akt含量和mTOR mRNA表達(dá)的雙因素方差分析

3 討論

在組成骨骼肌的成分中，蛋白質(zhì)是最重要的，其中主要的結(jié)構(gòu)蛋白和收縮蛋白是肌球蛋白，其含量的降低不僅可降低骨骼肌的收縮速度，還可減小骨骼肌的收縮力量。為了進(jìn)一步探討高原訓(xùn)練過程中導(dǎo)致骨骼肌蛋白質(zhì)下降的主要原因，本研究通過交互設(shè)計的實(shí)驗方案對大鼠進(jìn)行低氧暴露和/或運(yùn)動訓(xùn)練，6周后檢測了腓腸肌Pro、Myo含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是6周的大負(fù)荷游泳訓(xùn)練還是低氧暴露均顯著降低了大鼠腓腸肌Pro和Myo含量，雖然低氧暴露和運(yùn)動訓(xùn)練兩個因素對腓腸肌Pro含量的減少無顯著性交互作用，但對降低Myo含量具有顯著性的交互作用。從而說明，機(jī)體長期暴露在低氧環(huán)境中或進(jìn)行大負(fù)荷運(yùn)動訓(xùn)練時，骨骼肌蛋白質(zhì)的丟失均增加，而在低氧環(huán)境中進(jìn)行大負(fù)荷運(yùn)動訓(xùn)練時骨骼肌收縮蛋白的丟失更加明顯。然而HiLo組大鼠腓腸肌Pro和Myo含量雖然顯著低于NC組，但均顯著性高于HE組。因此，與傳統(tǒng)的高原訓(xùn)練相比，HiLo可以降低大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)丟失的程度。

有研究證實(shí)，PI3K/Akt/mTOR信號通路是以mTOR為中心的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞生長過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[8，9]。它通過調(diào)節(jié)核糖體S6激酶（p70S6K）、翻譯抑制蛋白4E-BP1、翻譯起始因子eIF4E和eIF4G及翻譯延長因子eEF2等下游信號因子調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物合成。其中，eEF2屬于翻譯延伸過程中的一種重要的細(xì)胞因子，它能與核糖體結(jié)合，促進(jìn)mRNA翻譯延長過程。eIF4E與eIF4A和eIF4G結(jié)合形成翻譯起始所必須的eIF4F復(fù)合物。由于4E-BP1能和eIF4G競爭性地與eIF4E結(jié)合，可阻礙eIF4F復(fù)合物的形成，故是eIF4E的抑制因子。因此，4E-BP1是eIF4F復(fù)合物形成過程中最為關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，是mTOR直接作用的底物之一[10，11]。PI3K/AKT/mTOR信號通路的活化，可能會下調(diào)4EBP-1和上調(diào)eEF2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成[12，13]。

有研究表明，低氧可以通過抑制骨骼肌IGF-1的分泌或阻斷IGF-1介導(dǎo)的Akt/mTOR的激活[14-16]，從而抑制mTOR調(diào)節(jié)下游的4EBP-1和eEF2（真核細(xì)胞延伸因子2）來降低蛋白質(zhì)合成[17]，而eEF2的磷酸化與去磷酸化的平衡最終影響其活性[18]。運(yùn)動時AMPK激活，從而激活eEF2激酶的活性，引起eEF2磷酸化，使eEF2活性降低，可抑制蛋白質(zhì)的合成[18，19]；運(yùn)動后mTOR激活，能使eEF2去磷酸化，使eEF2活性升高，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。目前不少研究證實(shí)，力量訓(xùn)練可以激活骨骼肌Akt/mTOR信號通路促進(jìn)蛋白質(zhì)的生物合成，從而引起骨骼肌體積的增大[20-22]。而耐力性運(yùn)動訓(xùn)練對骨骼肌Akt/mTOR信號通路的影響目前研究結(jié)果并不一致，且可能與運(yùn)動強(qiáng)度有關(guān)。低強(qiáng)度的有氧耐力性運(yùn)動訓(xùn)練并不能使骨骼肌中mTOR活性發(fā)生變化[23]，而進(jìn)行不習(xí)慣或大強(qiáng)度的耐力性運(yùn)動可以通過提高AMPK活性抑制骨骼肌中mTOR的活性[20]。但是有研究發(fā)現(xiàn)，28天的耐力性運(yùn)動訓(xùn)練可激活大鼠骨骼肌Akt/mTOR/p70S6K信號通路，促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)的生物合成[24，25]。然而，低氧運(yùn)動對Akt/mTOR及其下游信號通路影響的報道甚少。有研究證實(shí)，HiLo對骨骼肌Akt/mTOR信號通路具有一定的抑制作用，在一定程度上可以抑制蛋白的生物合成[24]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，低氧暴露可通過抑制骨骼肌mTOR/p70S6K信號通路抑制肌肉蛋白質(zhì)的合成，在低氧中進(jìn)行適量的耐力運(yùn)動鍛煉在一定程度上可削弱低氧對mTOR/p70S6K信號通路的抑制作用[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，2個月的運(yùn)動訓(xùn)練雖然能夠增加血氧正常和血氧低下的慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者的運(yùn)動能力，但運(yùn)動訓(xùn)練只能增加血氧正常COPD患者骨骼肌中檸檬酸合成酶和乳酸脫氫酶活性、肌纖維橫截面積和毛細(xì)血管纖維比值。與此同時，血氧正常COPD患者骨骼肌中Akt（Ser473）、GSK-3β（Ser9）和p70S6k（Thr389）的磷酸化在運(yùn)動訓(xùn)練后無顯著性增加，但在血氧低下的COPD患者中顯著降低[16]，從而進(jìn)一步說明運(yùn)動訓(xùn)練在低氧和常氧下對骨骼肌蛋白質(zhì)生物合成的影響不同。本研究發(fā)現(xiàn)，6周的低氧暴露在顯著降低大鼠腓腸肌PI3K、Akt含量和mTOR mRNA表達(dá)的同時，顯著升高4E-BP1 mRNA表達(dá)量，而eEF2 mRNA表達(dá)無顯著性降低；運(yùn)動訓(xùn)練能顯著降低PI3K含量以及mTOR和eEF2 mRNA表達(dá)，顯著升高4EBP1 mRNA表達(dá)量；且低氧暴露與運(yùn)動訓(xùn)練對降低mTOR和eEF2 mRNA表達(dá)具有顯著性的交互作用；與NC組相比，HiLo組除了腓腸肌4E-BP1 mRNA的表達(dá)顯著升高外，PI3K、Akt含量和mTOR mRNA表達(dá)均無顯著性變化，但HiLo組PI3K含量、mTOR和eEF2的mRNA表達(dá)顯著高于HE組。

長時間的低氧暴露和大強(qiáng)度的運(yùn)動訓(xùn)練，由于骨骼肌能量的大量消耗，一方面激活A(yù)MPK，另一方面促進(jìn)皮質(zhì)酮的分泌[26]，抑制睪酮和IGF-1的分泌[2]，從而抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，顯著上調(diào)4EBP-1和下調(diào)eEF2 mRNA表達(dá)。而低氧聯(lián)合大強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練在一定程度上對骨骼肌PI3K/Akt/mTOR及其下游信號通路的抑制作用比單純的低氧暴露或大強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練更大。但是由于HiLo中，低氧暴露的時間比模擬高原訓(xùn)練要短，從而使HiLo對骨骼肌PI3K/Akt/mTOR及其下游信號通路的抑制作用比模擬高原訓(xùn)練要小。因此，在低氧訓(xùn)練中如何采取低氧暴露時間和運(yùn)動強(qiáng)度的合理組合，在最大程度上減輕低氧暴露引起的蛋白質(zhì)丟失，對于提高運(yùn)動員的運(yùn)動能力有著非常重要的意義。

4 結(jié)論

4.1 模擬高原訓(xùn)練中，低氧和大強(qiáng)度的運(yùn)動訓(xùn)練均能通過抑制骨骼肌PI3K/Akt/mTOR及其下游信號通路，降低骨骼肌蛋白質(zhì)含量。低氧聯(lián)合大強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練對骨骼肌PI3K/Akt/mTOR及其下游信號通路以及蛋白質(zhì)合成的抑制作用在一定程度上比單純的低氧暴露或大強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練更大。

4.2 高住低練能夠減輕骨骼肌中PI3K/Akt/mTOR及其下游信號通路的抑制程度，減輕抑制骨骼肌蛋白質(zhì)合成的程度，對于防止低氧引起的骨骼肌蛋白質(zhì)丟失具有重要作用。