mTOR復(fù)合物在有氧運(yùn)動(dòng)改善小鼠骨骼肌糖代謝過程中的作用

張?chǎng)斡?周曉勐 牛燕媚 傅力

1天津醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)與病理生理學(xué)系（天津 300070）

2航空總醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科（北京 100012）

3天津醫(yī)科大學(xué)康復(fù)系（天津 300070）

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是哺乳動(dòng)物體內(nèi)與能量代謝相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)蛋白。mTOR在細(xì)胞內(nèi)以復(fù)合物形式存在，分別為雷帕霉素敏感型mTOR復(fù)合物1（mTORC1）和非雷帕霉素敏感型mTOR復(fù)合物2（mTORC2）。其中mTORC1具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增長(zhǎng)及蛋白合成的功能，而mTORC2則調(diào)控細(xì)胞蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB or Akt）活化及細(xì)胞骨架重新合成[1]。在細(xì)胞能量代謝過程中，一磷酸腺苷激活激酶（adenosine monophosphate-activated kinase，AMPK）可磷酸化mTORC1核心組分Raptor從而抑制其活性[2]。而 mTORC2在調(diào)節(jié)組織糖代謝穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用。骨骼肌特異性敲除其核心組分 Rictor可抑制 mTORC2活性并促進(jìn)糖原合成，導(dǎo)致機(jī)體糖耐量穩(wěn)態(tài)失衡，提示，mTORC2在維持機(jī)體糖耐量并抑制糖原合成過程中發(fā)揮重要作用[3]。

骨骼肌包括氧化型和酵解型兩大類肌纖維，其中比目魚?。⊿oleus）以氧化型肌纖維為主，是進(jìn)行葡萄糖有氧氧化的主要肌纖維，而腓腸肌（Gastrocnemius）以酵解型肌纖維為主，主要以糖酵解方式參與運(yùn)動(dòng)過程中的能量供應(yīng)，二者共同調(diào)控機(jī)體糖攝取過程。在安靜狀態(tài)下，小鼠骨骼肌攝取葡萄糖量占機(jī)體總葡萄糖攝取量的75%。 因此，增加骨骼肌糖攝取對(duì)改善機(jī)體胰島素抵抗（insulin resistance，IR）及緩解2型糖尿病具有積極作用[4]。胰島素是調(diào)節(jié)機(jī)體血糖水平的主要激素，胰島素通過與細(xì)胞膜受體結(jié)合引起細(xì)胞內(nèi)α受體亞基構(gòu)象改變，從而促進(jìn)胰島素受體底物（insulin receptor substrates，IRS）賴氨酸位點(diǎn)磷酸化[5]并結(jié)合至磷酸肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）上，隨后PI3K將3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶（3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1）募集至細(xì)胞膜，促進(jìn)Akt-Thr308磷酸化[6]并活化mTORC2結(jié)構(gòu)蛋白的應(yīng)激活化蛋白激酶作用蛋白1（stress-activated protein kinase interacting protein 1，SIN1）從而激活mTORC2，并在mTORC2與Akt-Ser473之間形成正反饋，最終激活胰島素信號(hào)通路[7]。另一方面，胰島素可通過抑制結(jié)節(jié)硬化蛋白復(fù)合物1（tuberous sclerosis complex 1，TSC1）激活A(yù)kt從而活化mTORC1，并激活其下游因子核糖體蛋白S6激酶1（ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1）誘導(dǎo)核糖體合成[8]。

Akt作為IRS的下游信號(hào)分子，在胰島素信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。生理狀態(tài)下，IRS與p58結(jié)合募集PI3K[9]，從而將Akt從胞漿轉(zhuǎn)移至胞膜上[10]，促使Akt-Thr308及Ser473磷酸化并結(jié)合至PDK1及mTORC2[11]，從而調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路活性。在這一過程中，Akt可磷酸化Akt 160KD亞基（Akt substrate of 160 KD，AS160）促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子 4（glucose transporter 4，GLUT4）轉(zhuǎn)位至胞膜從而增加細(xì)胞糖攝??；同時(shí)，胰島素活化Akt引起轉(zhuǎn)錄活化因子叉頭框蛋白O（fork head box protein O，F(xiàn)OXO）磷酸化，以此促使FOXO與14-3-3蛋白結(jié)合，進(jìn)而促使FOXO從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)從而抑制糖異生相關(guān)酶的表達(dá)、催化糖原合成及脂質(zhì)生成[12]。

除此之外，Akt還可通過TSC和富含脯氨酸的40kDa Akt亞基（the proline-rich Akt substrate of 40 kDa，PRAS40）激活mTORC1進(jìn)而影響機(jī)體代謝：一方面Akt直接磷酸化TSC2[13]促使TSC2與TSC1形成復(fù)合體從而活化mTORC1；另一方面，PRAS40可與mTORC1相互作用，對(duì)mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié)[14]。在這一過程中，Akt作為細(xì)胞能量代謝的重要調(diào)節(jié)因子，通過磷酸化PRAS40并促進(jìn)其與 14-3-3蛋白結(jié)合[15]，引起PARAS40與mTORC1解離，從而活化mTORC1[16]。

目前，由于采用的運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案的不同，有關(guān)運(yùn)動(dòng)影響骨骼肌細(xì)胞mTOR信號(hào)通路及其與糖代謝之間的調(diào)控關(guān)系尚不完全清楚，為進(jìn)一步探究長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌糖代謝的影響，本實(shí)驗(yàn)采用C57BL/6小鼠，通過6周高脂飲食喂飼誘導(dǎo)胰島素抵抗模型，后進(jìn)行8周、強(qiáng)度為75%VO2max的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)，觀察IRS/Akt/mTOR信號(hào)通路活性，分析有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)長(zhǎng)期高脂飲食小鼠骨骼肌糖代謝的影響，以期為揭示運(yùn)動(dòng)改善代謝性疾病的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，室溫控制在22℃～25℃，濕度控制在30%～40%，光照/黑暗時(shí)間為12/12，小鼠自由進(jìn)食、水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)在天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，符合中國(guó)科學(xué)院指導(dǎo)下的天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)懷及使用管理?xiàng)l例。

50只4周齡C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常飲食組（C組，n=10）和高脂飲食組（n=40），并分別喂飼正常飲食和高脂飲食（脂肪含量為45%）。6周后根據(jù)口服糖耐量（OGTT）和空腹胰島素檢測(cè)結(jié)果將高脂飲食組25只成模小鼠隨機(jī)分為高脂飲食安靜組（H組，n=10）及高脂飲食運(yùn)動(dòng)組（HE組，n=15）[19]。H組繼續(xù)喂飼高脂飲食，而HE組小鼠在高脂飼養(yǎng)的同時(shí)給予8周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

HE組小鼠運(yùn)動(dòng)干預(yù)前先進(jìn)行為期1周的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練，首次訓(xùn)練時(shí)長(zhǎng)為20 min、強(qiáng)度為10 m/min，隨后漸增至12 m/min。運(yùn)動(dòng)干預(yù)時(shí)長(zhǎng)為8周、速度為12 m/min，相當(dāng)于小鼠75%VO2max[17]，1小時(shí)/天、5天/周。

1.3 動(dòng)物組織取樣

6周高脂飼料喂養(yǎng)及 8周運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束后進(jìn)行取材。取材前，各組小鼠禁食 14 h，小鼠經(jīng)利多卡因眼球局部麻醉后內(nèi)眥靜脈取血。血液4℃靜置30 min后3000 g離心15 min，取上層血清保存于-80℃冰箱備用。取血后立即分離小鼠比目魚肌及腓腸肌，經(jīng)液氮速凍后移至-80℃冰箱備用。

1.4 Western Blot 檢測(cè)小鼠比目魚肌胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

用乙基苯基聚乙二醇裂解液提取比目魚肌與腓腸肌總蛋白，用垂直電泳儀（Bio-Rad）加入等量比目魚肌蛋白質(zhì)樣品并經(jīng)10%SDS-PAGE膠分離后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜（Millipore）上，隨后使用10%脫脂奶粉封閉1小時(shí)，抗體稀釋液（5%BSA/TBST，Sigma）按1∶2000比例稀釋一抗pAkt-S473、pAkt-T308、pAMPK-T172、pIRS1-S307、pS6K1-T389、Raptor、Rictor、mTOR（Cell Signaling Technology），β-actin（北京銳抗生物科技有限公司），4℃搖床孵育過夜。次日，使用1×TBST洗滌3次，每次10min，隨后使用同一抗體稀釋液按1∶20000比例稀釋二抗，室溫?fù)u床孵育1小時(shí)后，重復(fù)上述洗滌過程。隨后以發(fā)光底物ECL反應(yīng)液顯影，暗室曝光，膠片掃描后采用Quantity One軟件定量分析并統(tǒng)計(jì)各條帶相對(duì)灰度值。

1.5 免疫共沉淀法檢測(cè)骨骼肌組織Raptor-mTOR，Rictor-mTOR 表達(dá)

研究表明，Raptor-mTOR結(jié)合反映mTORC1表達(dá)量，Rictor-mTOR結(jié)合反映mTORC2表達(dá)量[18]。用乙基苯基聚乙二醇裂解液提取比目魚肌及腓腸肌總蛋白，利用Invitrogen公司Dynabeads R蛋白G免疫沉淀反應(yīng)試劑盒分別檢測(cè)小鼠比目魚肌及腓腸肌Raptor-mTOR及Rictor-mTOR結(jié)合。采用清洗緩沖液（Ab Binding&Washing Buffer）以1∶200比例稀釋mTOR抗體，隨后轉(zhuǎn)移至裝有磁珠的1.5 ml EP管中，室溫孵育15 min（間歇搖動(dòng)）。用Washing Buffer重懸磁珠并去除廢液，隨后加入蛋白稀釋液稀釋（1×PBS，0.1%Tween-20）的蛋白樣品（80～100 μg），室溫孵育15 min（間歇搖動(dòng)），Washing Buffer重懸后棄廢液，20 μl Elution Buffer洗脫抗體-蛋白結(jié)合物，-20℃貯存以備Western Blot檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均由 SPSS軟件處理。采取單因素方差分析（One-way ANOVA），計(jì)算各組標(biāo)準(zhǔn)差和均值，各組之間的顯著性定為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂飲食小鼠代謝表型的影響

在本實(shí)驗(yàn)室前期建造模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)14周后小鼠體重、血糖及空腹胰島素水平均顯著增加，提示14周高脂飲食可誘發(fā)小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗，而在高脂飲食的同時(shí)進(jìn)行8周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可有效降低胰島素抵抗小鼠的空腹血糖及胰島素水平[19]。

2.2 8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠比目魚肌Akt/mTOR信號(hào)通路的影響

檢測(cè)小鼠比目魚肌胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化水平，結(jié)果顯示，與 C組相比，H組小鼠比目魚肌pAkt-T308（P＜0.05），pIRS1-S307表達(dá)顯著降低（P＜0.001），而pS6K1-T389顯著增高（P＜0.05）；與H組小鼠對(duì)比，HE 組 pAkt-S473（P＜0.05），pAkt-T308（P＜0.05），pAMPKα -T172（P＜0.05），pIRS1-S307（P＜0.001）表達(dá)顯著增加，而pS6K1-T389表達(dá)顯著降低（P＜0.05）（圖1）。

2.3 長(zhǎng)期高脂飲食和8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌mTORC1/C2蛋白表達(dá)的影響

14周高脂喂養(yǎng)后，與C組相比，H組小鼠比目魚肌Rictor-mTOR結(jié)合量顯著降低，而Raptor-mTOR結(jié)合量明顯增加（P＜0.05）（圖2）。與H組相比，HE組Rictor-mTOR結(jié)合量顯著增加，Raptor-mTOR結(jié)合量顯著降低（P＜0.05），提示長(zhǎng)期高脂飲食可顯著增加比目魚肌mTORC1表達(dá)、降低mTORC2表達(dá)；而8周有氧運(yùn)動(dòng)可顯著降低mTORC1表達(dá)、增加mTORC2表達(dá)（P＜0.05）（圖2）。

圖2 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)研究各組小鼠比目魚肌Rictor-mTOR（B）、Raptor-mTOR（C）在高脂/高脂+運(yùn)動(dòng)干預(yù)下的結(jié)合水平

與C組相比，H組小鼠腓腸肌Raptor-mTOR結(jié)合顯著增加（P＜0.05），而Rictor-mTOR結(jié)合雖有增加趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與H組對(duì)比，HE組小鼠腓腸肌Raptor-mTOR顯著降低（P＜0.05），Rictor-mTOR雖有降低趨勢(shì)，但無顯著性意義（P＞0.05），提示長(zhǎng)期高脂飲食可增加腓腸肌mTORC1含量，但對(duì)mTORC2含量無顯著影響；8周有氧運(yùn)動(dòng)可顯著降低小鼠腓腸肌mTORC1含量、對(duì)mTORC2含量無顯著影響（P＞0.05）（圖3）。

3 討論

3.1 mTORC1/C2與高脂飲食誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗之間的關(guān)系

mTOR在感受機(jī)體能量狀態(tài)的過程中發(fā)揮重要作用。生理狀態(tài)下，餐后氨基酸及血糖升高可刺激胰島β細(xì)胞分泌胰島素，進(jìn)而磷酸化IRS并使其結(jié)合至PI3K，從而活化下游效應(yīng)器Akt和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等[20]。其中，Akt一方面抑制糖原合酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK-3）活性從而抑制糖原合成，另一方面可促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞GLUT4轉(zhuǎn)位至胞膜從而增加糖攝取[21]。細(xì)胞葡萄糖及支鏈氨基酸長(zhǎng)期過量可活化mTORC1，并促進(jìn)S6K1磷酸化IRS、抑制IRS與胰島素受體結(jié)合，此負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制可降低細(xì)胞胰島素敏感性，導(dǎo)致胰島素抵抗[22，23]。在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，S6K1敲除小鼠可抵抗高脂飲食誘導(dǎo)胰島素敏感性降低及肥胖[24]，而脂肪細(xì)胞特異性敲除Raptor小鼠表現(xiàn)出胰島素敏感性增加并對(duì)抗高脂飲食誘導(dǎo)肥胖的發(fā)生[25]。已有大量研究表明，在胰島素抵抗情況下，細(xì)胞IRS1含量顯著降低。當(dāng)過表達(dá)Rheb或敲除TSC1/2時(shí)，mTORC1/S6K1可持續(xù)活化并促進(jìn)IRS1及IRS2蛋白降解，從而導(dǎo)致胰島素受體及 PI3K含量降低，最終引發(fā)胰島素抵抗[26]。

除mTORC1外，mTORC2對(duì)IRS1或Akt也發(fā)生作用，但二者在胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展過程中的作用并不完全一致。敲低或抑制mTORC2表達(dá)可通過泛素連接酶Fbw8促進(jìn)IRS1蛋白降解，引起細(xì)胞漿內(nèi)非活化的IRS1累積，提示mTORC2在調(diào)節(jié)胰島素敏感性過程中發(fā)揮著重要作用[27]。此外，mTORC2還通過調(diào)節(jié)Akt活性參與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，具體表現(xiàn)為Rictor敲除小鼠脂肪及肌肉組織mTORC2及Akt活性均受到抑制，胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取量也隨之減少[28]。同時(shí)，抑制mTORC2還可增加肝臟糖原合成并抑制糖酵解及脂質(zhì)合成。因此，mTORC2含量及活性降低可導(dǎo)致血糖升高及糖耐量受損[29]。

3.2 骨骼肌組織mTORC1/mTORC2 與有氧運(yùn)動(dòng)改善胰島素抵抗的關(guān)系

mTOR可參與調(diào)節(jié)包括細(xì)胞生長(zhǎng)分化、蛋白合成及細(xì)胞骨架蛋白構(gòu)建等多種過程。作為胰島素信號(hào)通路的重要組分，mTOR活性受骨骼肌重復(fù)收縮活動(dòng)的調(diào)控并在骨骼肌運(yùn)動(dòng)適應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。由于各家研究所采用的運(yùn)動(dòng)形式或時(shí)長(zhǎng)的不同，目前關(guān)于運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)的機(jī)制尚不明確。

研究發(fā)現(xiàn)，單次抗阻運(yùn)動(dòng)可增加人體肌肉含量并促進(jìn)mTORC1及S6K1活化，提示單次抗阻運(yùn)動(dòng)后mTORC1的活化與肌纖維蛋白質(zhì)合成代謝有關(guān)[30]，而運(yùn)動(dòng)個(gè)體肌肉的增速與mTORC1活性密切相關(guān)[31]。研究發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠訓(xùn)練14天后肌肉含量增加43%，而給予雷帕霉素的野生型小鼠肌肉含量則無顯著變化。對(duì)于含有雷帕霉素抗性的骨骼肌特異性mTOR突變小鼠，無論是否給予雷帕霉素，其肌肉含量均明顯增加[32]，提示mTORC1在調(diào)控骨骼肌合成代謝過程中發(fā)揮重要作用。人體試驗(yàn)表明，對(duì)給予雷帕霉素的受試者進(jìn)行抗阻訓(xùn)練后，其混合型肌肉增加并不顯著[33]。同樣，雷帕霉素也可抑制運(yùn)動(dòng)小鼠產(chǎn)生骨骼肌肥大[34]。綜上所述，mTORC1的活化促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成代謝。

Kleinert等發(fā)現(xiàn)，mTORC2在運(yùn)動(dòng)中參與調(diào)節(jié)骨骼肌糖攝取[35]。研究表明，敲除Rictor對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)能力并無顯著影響，但會(huì)引起運(yùn)動(dòng)后小鼠血糖及血乳酸含量升高、糖原合成降低。在安靜狀態(tài)下，敲除Rictor對(duì)骨骼肌糖攝取無顯著影響，但敲除Rictor小鼠運(yùn)動(dòng)后骨骼肌糖攝取能力較野生型小鼠下降40%[35]。此外，Hodson等通過人體試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)進(jìn)食及抗阻運(yùn)動(dòng)后，骨骼肌mTORC1被激活，同時(shí)S6K1活性也增加，而mTORC2無顯著變化[36]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)mTORC1及mTORC2在調(diào)節(jié)骨骼肌糖代謝過程中表現(xiàn)出相互拮抗作用，具體表現(xiàn)為高脂飲食可增加骨骼肌mTORC1表達(dá)、降低mTORC2表達(dá)，8周有氧運(yùn)動(dòng)可顯著逆轉(zhuǎn)長(zhǎng)期高脂飲食引發(fā)的上述改變，并且mTORC2的變化只出現(xiàn)在氧化型肌纖維內(nèi)（比目魚?。?，在酵解型肌纖維（腓腸?。﹎TORC2的變化并不顯著。

4 結(jié)論

長(zhǎng)期高脂飲食可引發(fā)機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài)失衡，有氧運(yùn)動(dòng)可顯著改善高脂飲食引起的機(jī)體代謝紊亂現(xiàn)象。本研究證明，長(zhǎng)期高脂飲食可增加骨骼肌纖維mTOR與Raptor結(jié)合，降低比目魚?。ㄑ趸图±w維）mTOR與Rictor結(jié)合及胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白活性。8周有氧運(yùn)動(dòng)通過增加小鼠比目魚肌纖維胰島素信號(hào)蛋白（pAkt-T308，S473）表達(dá)、降低mTOR與Raptor結(jié)合，從而逆轉(zhuǎn)高脂飲食導(dǎo)致的機(jī)體代謝失衡。