大孔吸附樹脂純化左金丸總生物堿工藝研究

龔來覲，李鶴，楊芳

(江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學院 中醫(yī)藥學院，江西 樟樹 331200)

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器設備

高效液相色譜儀(Agilent1260液相色譜)；C18ODS-Box柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；UV-3300紫外-可見分光光度計、石英比色皿(上海美譜達儀器有限公司)；BS-124S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；小型粉碎機(北京興時利和科技發(fā)展有限)；RE 5298A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 實驗藥物與試劑

鹽酸小檗堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110713-201708、110802-201709、110801-201709、110733-201609、110732-201611)；黃連與吳茱萸均購于樟樹藥材交流中心，經(jīng)學院龔福保教授鑒定，黃連為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.的干燥根莖，吳茱萸為蕓香科植物Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.的干燥近成熟的果實；大孔吸附樹脂NKA-9、D101、AB-8、DM-301、HPD-100樹脂(天津市海光化工有限公司)；甲醇(色譜純，美國默克公司)；實驗用水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取左金丸粗粉28 g(黃連∶吳茱萸6∶1)，置于500 mL錐形瓶中，加鹽酸-乙醇(1∶100)300 mL靜置30 min，超聲提取40 min，提取過程中溶劑揮發(fā)可再加入適量鹽酸-乙醇(1∶100)，冷卻，抽濾，濾液45℃下減壓濃縮至近干，加入適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加甲醇定容即得樣品液(生藥量0.28 g·mL-1)；精密吸取樣品液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，0.45 μm微孔濾膜濾過， 即得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿適量，分別加甲醇溶解，制成每1 mL中含鹽酸小檗堿8.6 mg,鹽酸巴馬汀8.1 mg,鹽酸藥根堿10.6 mg,吳茱萸堿1.25 mg,吳茱萸次堿1.5 mg的對照品溶液儲備液。

2.3 色譜條件

色譜柱ODS-Box(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-25 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液(B，pH 4.5)，梯度洗脫(0～35 min，10%～45%A；35～65 min，45%～60%A)；柱溫：25℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL[3-4]。

2.4 樹脂的預處理

分別取NKA-9、D101、AB-8、DM-301、HPD-1005種型號大孔樹脂置于層析柱中，加入高于樹脂層10 cm的95%乙醇浸泡24 h充分溶脹后，再用95%乙醇洗，至流出液加蒸餾水不渾濁為止，最后用蒸餾水洗至水液澄清無醇味，備用[5-6]。

2.5 樹脂型號的選擇

2.5.1 靜態(tài)吸附的考察

（2）進行心理健康教育：繁重的工作會導致施工人員不可避免的產(chǎn)生抑郁、焦躁等心理疾病，嚴重的影響其在施工過程中的安全性。因此本工程通過定期的進行視頻教育的方式，警示施工人員不執(zhí)行安全操作可能出現(xiàn)的嚴重后果，同時通過開展各種娛樂活動，加強施工人員良好工作情緒的培養(yǎng)，減少不必要的施工誤操作，有效的提高了施工安全管理的水平。

預處理好的5種型號大孔吸附樹脂各取3份，每份準確稱2.0 g后分別放于15個250 mL錐形瓶中，各加入20 mL樣品液(生藥量為0.28 g·mL-1)，磁力攪拌20 min，靜置過夜(約12 h)，使樹脂吸附藥液至飽和，過濾，適量蒸餾水沖洗樹脂，合并濾液，水浴蒸干。殘渣加甲醇20 mL超聲溶解20 min，過濾，濾液揮干，甲醇溶解并定容至5 mL，過濾，通過測定鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量計算吸附率，結(jié)果見表1。其中綜合評分為5種成分平均吸附率之和除以5。吸附率的計算公式如下：

吸附率(%)=(C0-Ce)/C0×100%

C0上樣液質(zhì)量濃度，Ce為吸附平衡后濾液質(zhì)量濃度。

表1 5種大孔樹脂靜態(tài)吸附5種成分平均吸附率(%,n=3)

由表1可知，5種樹脂中綜合評分最高依次為AB-8>D-101>NKA-9>HPD-100>DM-301，其中AB-8對5種成分的平均吸附率為77.83%，D-101平均吸附率為70.42%。沒有明顯差異，故對AB-8和D-101進行動態(tài)考察[7]。

2.5.2 動態(tài)吸附的考察

將預處理好的AB-8和D-101兩種樹脂各5 mL分別裝入2根同樣規(guī)格的層析柱中，再各取20 mL樣品液(生藥量為0.28 g·mL-1)分別上樣，以0.1倍柱體積·min-1流速進行動態(tài)吸附，然后水洗脫至流出液Molish反應陰性，再依次用30%，50%，70%，95%的乙醇各30 mL洗脫，分別收集各部分洗脫液，減壓濃縮干，殘渣用甲醇25 mL超聲溶解20 min，過濾掉不溶物，濾液揮干后甲醇溶解定容至5mL，過濾，通過測定5種成分含量計算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表2。其中綜合評分為5種成分轉(zhuǎn)移率之和除以5。轉(zhuǎn)移率的計算公式如下：

轉(zhuǎn)移率=洗脫量/上樣量×100%

表2 2種大孔樹脂動態(tài)吸附5種成分轉(zhuǎn)移率及綜合評分(%)

由表2可知，AB-8的綜合轉(zhuǎn)移率為83.65%，D-101的綜合轉(zhuǎn)移率為58.41%，AB-8明顯優(yōu)于D-101，故選用AB-8型大孔樹脂對左金丸藥液進行進一步工藝參數(shù)的優(yōu)化。

2.6 AB-8型大孔樹脂分離富集條件優(yōu)化

2.6.1 正交試驗對工藝參數(shù)的優(yōu)化

通過預實驗我們發(fā)現(xiàn)上樣藥液濃度(A)、上樣流速(B)、樹脂的徑高比(C)、洗脫劑濃度(D)對成分的洗脫率有較大影響，因此選上述4個因素為考察因素，設計L9(34)正交試驗因素水平表(見表3)。分別收集各組條件洗脫液，選擇5種成分洗脫率考察，平行實驗3次，3次的平均值見表4。綜合評分為5種成分洗脫率的平均值，對每組數(shù)據(jù)綜合評分的方差分析見表5，各因素水平綜合評分的K值見表6。

表3 AB-8型大孔樹脂優(yōu)化工藝正交試驗因素水平表

表4 正交試驗結(jié)果各組洗脫率平均值(%,n=3)

表5 方差分析表

F0.01(2,2)=99，F(xiàn)0.05(2,2)=19

表6 AB-8型大孔樹脂優(yōu)化工藝正交試驗洗脫率綜合評分K值

實驗結(jié)果表明，因素A(上樣藥液濃度)，B(上樣流速)，C(徑高比)，D(乙醇濃度)具有顯著性差異，最佳工藝為上樣藥液濃度0.14 g/mL,上樣流速9 BV/h，徑高比1∶10，70%乙醇洗脫。

2.6.2 泄露曲線

量取預處理好的AB-8大孔吸附樹脂20 mL裝入層析柱(徑高比約1∶10)，再將稀釋一倍的樣品液(生藥量為0.14 g/mL)上樣，上樣流速為9BV/h。每試管收集5 mL流出液，共收集20試管。測定每試管中鹽酸小檗堿、吳茱萸堿含量，以每試管中鹽酸小檗堿、吳茱萸堿質(zhì)量為縱坐標，累計上樣體積為橫坐標，繪制泄露曲線，見圖1。由圖1可知，上樣60 mL后鹽酸小檗堿、吳茱萸堿開始明顯泄露，因此上樣量最多8.4 g，即最佳上樣量與樹脂體積比為1∶2.4。

圖1 泄漏曲線

2.6.3 洗脫劑用量的考察

將0.14 g/mL樣品溶液按上樣量與樹脂體積比1∶2.4上柱(徑高比約1∶10，濕樹脂體積10 mL)，進行動態(tài)吸附3 h，然后用2 BV水洗脫將雜質(zhì)去除，再用70%乙醇將成分洗脫，收集乙醇洗脫液，前2試管每試管收集10mL，以后每試管收集5 mL，共收集15試管，測定每試管中鹽酸小檗堿、吳茱萸堿含量。以每試管中鹽酸小檗堿、吳茱萸堿質(zhì)量為縱坐標，累計洗脫體積為橫坐標，繪制洗脫曲線，見圖2。由圖2可知當洗脫溶劑為70 mL時，可同時將鹽酸小檗堿、吳茱萸堿洗脫完全，即洗脫劑用量為7 BV。

圖2 洗脫曲線

2.7 驗證試驗

按優(yōu)選的最佳純化工藝，即以質(zhì)量濃度為0.14 g/mL(相當于原生藥)，上樣量為2.4倍樹脂體積的左金丸乙醇提取液上樹脂柱(徑高比1∶10)后，先以2BV蒸餾水除去雜質(zhì)，再用7 BV體積分數(shù)70%乙醇洗脫，以9 BV/h流速收集體積分數(shù)70%乙醇洗脫部分。以HPLC法測定各成分的吸附-洗脫轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表7。

表7 工藝驗證5種成分吸附率、洗脫率、轉(zhuǎn)移率

由表7可知，左金丸中5種成分精制后含量保留均在75%以上，其中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿3種成分保留85%以上，說明采用大孔樹脂對左金丸鹽酸-乙醇(1∶100)提取液進行精制是合理可行的。

3 討論

有文獻報道[8-10]左金丸可以通過調(diào)節(jié)胃酸分泌及促進胃黏膜愈合等作用來達到抗胃潰瘍的效果，黃連在方中發(fā)揮最主要的藥效，其中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿3種成分水溶性強，容易吸收入血，本課題前期研究還發(fā)現(xiàn)吳茱萸中的吳茱萸堿、吳茱萸次堿2種成分對幽門螺旋桿菌有較強的抑制作用，因此將以上5種成分作為優(yōu)選左金丸精制工藝的檢測指標。

雖然左金丸只由兩味藥組成，其抗?jié)冇行С煞种饕獮樯飰A類化合物，但提取液中仍有多糖、蛋白質(zhì)、鞣制等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)用一般的純化方法不易分離完全，且主要成分損失較大，因此選擇一種純化效果好的大孔樹脂十分必要。從鹽酸小檗堿、吳茱萸堿等的化學結(jié)構(gòu)看都含有2～3個苯環(huán)，吳茱萸堿、吳茱萸次堿的極性較小，疏水性強，而鹽酸小檗堿有一定的親水性，因此將這5種有一定極性差異的化合物完全吸附洗脫有一定難度。AB-8型大孔吸附樹脂為聚苯乙烯型弱極性吸附樹脂，對環(huán)狀芳香族化合物有很強的吸附能力，特別隨被吸附分子親油性增加而增強，這可能是對吳茱萸堿吸附好的原因。由于AB-8型樹脂表面有一定的酯基，其親水性有一定改善，這可能是對鹽酸小檗堿這類化合物也能有較好吸附的原因。

經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后，所得干浸膏中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿5種成分的轉(zhuǎn)移率分別為89.06%，87.23%、85.35%、79.72%、78.47%，所得干浸膏顏色為黃色至黃褐色，干燥后不易吸濕，由此可見糖類、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等雜質(zhì)去除較徹底，純化后主要5種生物堿的含量都有很大提高，為左金丸抗?jié)兓钚圆课豢偵飰A提取物的制備工藝提供了實驗依據(jù)，也為進一步左金丸抗?jié)兯幮镔|(zhì)基礎研究，譜效關(guān)系研究奠定基礎。