黑菊芋多酚提取及抗氧化活性分析

姬妍茹， 許博超， 楊慶麗， 魏連會(huì)， 石 杰， 董 艷， 劉宇峰

(1.黑龍江省科學(xué)院 大慶分院， 黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 黑龍江 大慶 163319)

菊芋(Jerusalem artichoke)又名洋姜、鬼子姜，塊莖含有碳水化合物、氨基酸、維生素等[1]，碳水化合物主要包括菊糖、淀粉、多聚戊糖等，其中菊糖含量最高，占?jí)K莖干重的50%～75%[2]，具有降血脂，雙向調(diào)控血糖，改善腸道，防治便秘等功能[3]。

隨著菊芋產(chǎn)量逐年增大，如何深度加工增加其經(jīng)濟(jì)附加值，成為制約菊芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素。菊芋的傳統(tǒng)加工方式主要是腌制醬菜，近年來新增了菊芋茶包[4]、菊芋飲料[5]、菊芋酒[6]和菊粉等多種加工方式，最常見的是生產(chǎn)菊粉、果糖和低聚果糖[7]。黑菊芋是以鮮菊芋為原料，利用獨(dú)特的工藝加工而成，因其色澤黝黑，口感酸甜軟彈，類似果脯，也稱為“黑菊芋脯”[8]。黑菊芋的研制成功為菊芋提供了新的加工方式，填補(bǔ)了國(guó)際空白，對(duì)菊芋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展將產(chǎn)生良好的推動(dòng)作用，現(xiàn)已明確其主要營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)構(gòu)成[9-10]，但對(duì)活性成分還未開展研究。

多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚類化合物，被稱作“第七類營(yíng)養(yǎng)素”[11]，具有很強(qiáng)的生物活性，例如抗氧化[12]、抗菌[13]、抗炎[14]、抗癌[15]等。鮮菊芋中的多酚含量較少，加工成黑菊芋后含量顯著提高[9]，實(shí)驗(yàn)擬利用超聲輔助法提取黑菊芋中多酚類物質(zhì)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化，并以多酚提取液進(jìn)行DPPH自由基、羥自由基清除能力和鐵離子還原力實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證其抗氧化功效，以期為成果推廣提供理論依據(jù)，同時(shí)為黑菊芋中多酚類物質(zhì)的深度開發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑菊芋以江蘇省沛縣晨玉特種蔬菜有限公司的紅果菊芋為原料，利用大慶分院機(jī)電研究所自制設(shè)備生產(chǎn)；福林酚、乙醇、碳酸鈉、沒食子酸等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Master-D UF型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)，上海和泰儀器有限公司；HPX-9082MBE型恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申勝生物技術(shù)有限公司；HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；LDZX-40SCI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療儀器廠；DHG-9070A型鼓風(fēng)干燥箱，上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；ML204型電子分析天平，梅特勒托利多(上海)有限公司；BCD-215T BDZ型冰箱，青島海爾股份有限公司；GT10-1型高速離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；KQ3200型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；Epoch酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1黑菊芋的制作

將鮮菊芋塊莖洗凈吹干后，裝入密封耐高溫塑料袋，放入加工設(shè)備中，采用變溫加熱方式進(jìn)行加工(在5 h內(nèi)由室溫逐漸升至93 ℃，歷經(jīng)83、78、60 ℃三次降溫，每個(gè)溫度保持一定時(shí)間，最后再降至室溫)，總加工時(shí)間為15 d，顏色變?yōu)楹诤稚?，再?jīng)烘干降低水分至30%左右，得到成品黑菊芋，4 ℃左右保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2菊芋多酚提取

將黑菊芋切成薄片，用研缽磨成泥狀。然后稱取0.5 g左右(精確到0.000 1 g)，以乙醇水溶液為溶劑進(jìn)行超聲提取。

1.3.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以乙醇體積分?jǐn)?shù)(0、35%、55%、75%、95%)，提取溫度(25、40、55、70、85 ℃)，料液比(g/mL)(1∶5、1∶15、1∶25、1∶35、1∶45)、提取時(shí)間(15、30、45、60、75 min)為單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定黑菊芋多酚的最佳提取工藝。

1.3.4總多酚含量檢測(cè)

采用福林酚法，參照國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法，略有改動(dòng)[16]。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確稱取(0.055±0.001) g，用水溶解并用容量瓶定容至50 mL，得1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)沒食子酸溶液。分別移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，于50 mL容量瓶中制成沒食子酸工作液。用移液器分別移取沒食子酸工作液、水及測(cè)試液各1.0 mL于刻度試管內(nèi)，加入5.0 mL的10% Folin-Ciocalteu試劑，搖勻后加入7.5%碳酸鈉溶液4.0 mL，加水定容至14.0 mL，搖勻，室溫下放置1.0 h后分別測(cè)定765 nm處溶液的吸光度。然后以吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程及標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，總多酚提取率(mg/g)見式(1)。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

(1)

實(shí)驗(yàn)中吸取樣品液1.0 mL，3次重復(fù)，按實(shí)驗(yàn)步驟測(cè)定其吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總多酚含量。

1.3.5DPPH自由基清除率測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[17]，稱取一定量的DPPH，用無水乙醇配制成0.2 mmol/L 的DPPH 溶液。吸取1.0 mL菊芋或黑菊芋多酚提取液，用無水乙醇補(bǔ)至2.0 mL，加入0.2 mmol/L DPPH溶液2.0 mL充分混勻，避光放置30 min，以等體積無水乙醇做空白對(duì)照，測(cè)定517 nm處的吸光度。清除率計(jì)算見式(2)：

(2)

式(2)中：A0為對(duì)照組吸光度，A1為樣品組吸光度。

1.3.6羥自由基清除率測(cè)定

參照文獻(xiàn)[18]，吸取1.0 mL的菊芋和黑菊芋多酚提取液于刻度試管中，用超純水補(bǔ)至2.0 mL，加入10 mmol/L FeSO4·7H2O溶液1.0 mL，再加入10 mmol/L水楊酸乙醇溶液1.0 mL，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1.0 mL啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃反應(yīng)30 min，對(duì)照組用超純水替代菊芋多酚提取液。測(cè)定510 nm處的吸光度。清除率計(jì)算見式(3)：

(3)

式(3)中：A0為不加色素的吸光度，A1為測(cè)定液的吸光度，A2為色素本底的吸光度。

1.3.7鐵離子還原力測(cè)定

吸取1.0 mL的菊芋和黑菊芋多酚提取液于具塞刻度試管中，用超純水補(bǔ)至2.0 mL，加入0.2 mol/L pH值6.6的磷酸鹽緩沖溶液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，混勻后50 ℃恒溫20 min，立即冷卻，加入三氯乙酸溶液2.5 mL，混合后3 000 r/min離心10 min(如無沉淀可不離心)，取上清2.5 mL，加入2.5 mL去離子水及0.5 mL 三氯化鐵溶液，迅速混勻，測(cè)定700 nm處的吸光度，以超純水作為零參比。

1.3.8數(shù)據(jù)處理

采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理分析，組間比較采用t檢驗(yàn)方法，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取條件對(duì)黑菊芋總多酚提取效果的影響

2.1.1提取溫度與黑菊芋總多酚提取效果的關(guān)系

當(dāng)其他條件一定時(shí)，隨著超聲溫度的升高，黑菊芋中總多酚的提取率逐漸上升，當(dāng)溫度為70 ℃時(shí)，總多酚的提取率達(dá)到最大值6.25 mg/g，之后開始緩慢下降，見圖2。因此溫度因素選擇 55、70、85 ℃ 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 提取溫度對(duì)黑菊芋總多酚提取效果的影響Fig.2 Effects of temperature on extraction yield of polyphenols from black Jerusalem artichoke

2.1.2乙醇體積分?jǐn)?shù)與黑菊芋總多酚提取效果的關(guān)系

當(dāng)其他條件一定時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，黑菊芋中總多酚的提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為55% 時(shí)，提取率最高為4.98 mg/g，之后逐漸下降，見圖3。因此乙醇體積分?jǐn)?shù)因素選擇 35%、55%、75% 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑菊芋總多酚提取效果的影響Fig.3 Effect of ethanol concentrations on extraction yield of polyphenols from black Jerusalem artichoke

2.1.3料液比與黑菊芋總多酚提取效果的關(guān)系

當(dāng)其他條件一定時(shí)，在乙醇溶液體積達(dá)到25 mL以前，多酚物質(zhì)的提取率明顯升高，之后隨著乙醇體積的增加，提取率變化趨緩，并且有下降的趨勢(shì)，見圖4。因此料液比因素選擇 1∶25、1∶35、1∶45這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 料液比對(duì)黑菊芋總多酚提取效果的影響Fig.4 Effect of solid-to-liquid ratios on extraction yield of polyphenols from black Jerusalem artichoke

2.1.4提取時(shí)間與黑菊芋總多酚提取效果的關(guān)系

當(dāng)其他條件一定時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，黑菊芋中總多酚的提取率逐漸上升，當(dāng)時(shí)間為60 min時(shí)，總多酚的提取率達(dá)到最大值5.35 mg/g，之后開始急劇下降，見圖5。因此時(shí)間因素選擇 45、60、75 min這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖5 提取時(shí)間對(duì)黑菊芋總多酚提取效果的影響Fig.5 Effects of ultrasonic time on extraction yield of polyphenols from black Jerusalem artichoke

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，對(duì)超聲輔助黑菊芋多酚提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果見表1。

從表1極差分析結(jié)果可以看出，4個(gè)因素對(duì)黑菊芋多酚提取率的影響由大到小依次為提取溫度(C)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(D)。在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，得到超聲提取黑菊芋多酚的優(yōu)化條件為A2B2C3D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%，料液比(g/mL)為1∶35，提取溫度為85 ℃，提取時(shí)間為45 min。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

2.3 黑菊芋體外抗氧化活性分析

2.3.1菊芋總多酚提取及含量測(cè)定結(jié)果

采用超聲輔助的方法提取鮮菊芋和黑菊芋多酚，工藝參數(shù)依據(jù)正交試驗(yàn)的優(yōu)化水平組合，超聲提取2次，合并濾液，先用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮發(fā)出乙醇，然后用電磁爐80 ℃濃縮，最后定容至100 mL，所得溶液稱為原液。鮮菊芋原液質(zhì)量濃度為0.114 9 g/mL，黑菊芋為0.123 2 g/mL。鮮菊芋樣品含水量為71.00%，黑菊芋含水量為36.24%。按照1.3.4節(jié)中的方法測(cè)定，以干基計(jì)算，鮮菊芋的多酚質(zhì)量比為1.13 mg/g，黑菊芋的多酚質(zhì)量比為6.41 mg/g，是鮮菊芋的5.67倍。由于本研究未對(duì)菊芋和黑菊芋多酚進(jìn)行分離純化，因此以下實(shí)驗(yàn)中采用多酚粗提液進(jìn)行抗氧化分析，為方便加工前后樣品之間的比較，實(shí)驗(yàn)以樣品質(zhì)量作為橫坐標(biāo)進(jìn)行對(duì)比分析。

2.3.2DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

DPPH是一種有機(jī)自由基，被廣泛應(yīng)用于定量檢測(cè)食品的抗氧化能力[19]。本實(shí)驗(yàn)利用DPPH體系對(duì)菊芋總多酚粗提液清除自由基進(jìn)行研究，結(jié)果如圖6。當(dāng)質(zhì)量均為1.0 mg時(shí)，黑菊芋與鮮菊芋對(duì)DPPH自由基清除率差異顯著(P<0.05)，隨著質(zhì)量增加黑菊芋對(duì)DPPH自由基的清除能力明顯增強(qiáng)(P<0.01)，清除率分別為同質(zhì)量鮮菊芋的1.08～1.54倍。菊芋對(duì)DPPH自由基的清除能力與其多酚含量具有一定相關(guān)性，黑菊芋和鮮菊芋的相關(guān)系數(shù)分別為0.858 2和0.953 6。

圖6 菊芋和黑菊芋對(duì)DPPH自由基的清除效果Fig.6 DPPH· scavenging activity of fresh and black Jerusalem artichoke

2.3.3羥自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

羥自由基是一種活性氧，能殺死紅細(xì)胞，降解DNA、細(xì)胞膜和多糖化合物，也是引起衰老和某些疾病的重要原因之一，從食物提取物中尋找羥自由基清除劑，對(duì)于緩解上述損傷，延緩衰老具有重要意義[20]。鮮菊芋和黑菊芋總多酚粗提液對(duì)羥自由基的清除率隨含量增加而增強(qiáng)(見圖7)。當(dāng)質(zhì)量為10.0 mg時(shí)，黑菊芋與鮮菊芋對(duì)羥自由基的清除率差異顯著(P<0.05)，隨著質(zhì)量增加黑菊芋對(duì)羥自由基的清除能力明顯增強(qiáng)(P<0.01)，黑菊芋對(duì)羥自由基的清除率分別為同質(zhì)量鮮菊芋的1.02～1.28倍。清除能力與多酚含量具有較好的相關(guān)性，黑菊芋和鮮菊芋的相關(guān)系數(shù)分別為0.929 3和0.965 8。

圖7 菊芋和黑菊芋對(duì)羥自由基的清除效果Fig.7 Hydroxyl free radicals scavenging activity of fresh and black Jerusalem artichoke

2.3.4鐵離子還原力測(cè)定結(jié)果

一般而言，樣品的還原力與抗氧化活性有著明顯的相關(guān)性，吸光度越大說明對(duì)應(yīng)樣品的還原力越強(qiáng)。黑菊芋和鮮菊芋總多酚粗提液對(duì)鐵離子的還原能力隨質(zhì)量的增加而增強(qiáng)，見圖8。在測(cè)試的樣品質(zhì)量范圍內(nèi)，與同質(zhì)量鮮菊芋相比，黑菊芋對(duì)鐵離子還原力分別為同質(zhì)量鮮菊芋的2.56～3.98倍，差異極顯著(P<0.01)。而且其還原力大小與多酚含量具有良好的相關(guān)性，黑菊芋和鮮菊芋的相關(guān)系數(shù)分別為0.994 6和0.985 1。

圖8 菊芋和黑菊芋對(duì)鐵離子的還原力Fig.8 Ferric reducing antioxidant power of fresh and black Jerusalem artichoke

3 結(jié) 論

目前，還沒有關(guān)于菊芋中多酚組成的相關(guān)報(bào)道，多酚提取和含量測(cè)定也沒有標(biāo)準(zhǔn)的方法。鞏慧玲等[21]借鑒了牡丹花中多酚的測(cè)定方法，以鄰苯二酚為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得幾種菊芋的多酚質(zhì)量比在0.66～1.55 mg/g。本研究參考GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》中Folin-Ciocalteu法對(duì)菊芋提取液進(jìn)行多酚含量檢測(cè)，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得紅果菊芋的多酚質(zhì)量比為1.13 mg/g。同時(shí)開展了超聲輔助提取黑菊芋多酚的研究，并在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過正交試驗(yàn)對(duì)黑菊芋的多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定優(yōu)化提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，料液比(g/mL)1∶35，提取溫度85 ℃，提取時(shí)間45 min，此時(shí)的提取率為6.26 mg/g。

經(jīng)變溫加熱工藝處理后，黑菊芋中的多酚含量顯著高于鮮菊芋，對(duì)DPPH自由基、羥自由基的清除能力和鐵離子還原力均顯著高于鮮菊芋，各抗氧化指標(biāo)均與多酚含量具有較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.853 2、0.929 3和0.994 6。本研究為黑菊芋新產(chǎn)品的推廣提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。