達氏鱘和西伯利亞鱘精子超微結構的比較研究

劉 釗，趙仲孟，楊世勇，黃小麗，田 莉，楊 淞，馮 楊，段 靖，杜宗君

（四川農業(yè)大學動物科技學院，成都 611130）

精子是由雄性動物產生并傳遞其遺傳物質的一種高度分化的細胞，其主要功能是完成受精，使物種得以延續(xù)，而在不同的物種之間精子的形態(tài)結構存在差異性。其中哺乳動物的精子的結構特征基本相同，其整體形態(tài)呈蝌蚪狀，主要由頭部和尾部組成，精子尾部由前向后分為頸段、中段、主段和末端，但是精子的形態(tài)在不同的哺乳動物中也有所差異，主要體現(xiàn)在頭部[1]。與哺乳動物相比，禽類的精子也可分為頭部和尾部，尾部又分為頸部、中段、主段和末端，但禽類的精子頭部呈鐮刀狀，立體形狀為長柱狀，頸短尾長，外形纖細，不同的禽類精子形態(tài)在種屬之間存在一定的差異[2-3]。魚類的精子形態(tài)與禽類差異較大，與哺乳動物更為接近，但結構上存在差異，魚類精子主要分為頭部、中段和尾部3部分，頭部和中段緊密相連，尾部一般為細長的鞭毛。與哺乳動物一樣，魚類的精子形態(tài)也呈蝌蚪狀，但泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）[4]、大口黑鱸（Micropterus salmoides）[5]鲀、綠鰭馬面 （Thamnaconus septentrionalis）[6]等大多數(shù)硬骨魚類不具有頂體結構，而哺乳動物的精子具有頂體結構。

在硬骨魚類中，鱘形目魚類作為一種演化兩億多年的古老魚類，其具有很高的經濟價值：個體較大，肉肥嫩多脂，富含蛋白質，魚卵經加工后制成的魚子醬也是享譽世界的佳肴。鱘形目魚類能夠演化至今，其成功的繁殖策略是非常關鍵的，而在繁殖中精子結構起著至關重要的作用。在動物的演化過程中，動物的受精方式發(fā)生著變化，同時精子形態(tài)也在發(fā)生一系列的變化。陸生動物在適應陸生生活與體內受精的生殖方式時，其精子逐漸變長，另外發(fā)展了其他附屬的尾部細胞骨骼器官[7]。和大多數(shù)硬骨魚類一樣，鱘形目魚類的精子也是由頭部、中段和尾部3部分組成，但鱘形目魚類精子頭部具有明顯的頂體結構，且中段明顯[8-14]，這些結構特征可能與鱘形目魚類進化相關。

達氏鱘（Acipenser dabryanus）和西伯利亞鱘（Acipenser baerii）均屬于鱘形目（Acipenseriformes）、鱘科（Acipenseridae）、鱘屬（Acipenser）[15]。達氏鱘主要分布于長江流域，作為國家Ⅰ級重點保護野生動物和長江上游急切保護魚類[16]，已成為長江上游珍稀特有魚類國家級自然保護區(qū)的主要保護對象之一。西伯利亞鱘則主要分布于額爾齊斯河流域，經濟價值高，目前作為我國人工養(yǎng)殖鱘魚的主要品種之一，已在全國大面積推廣養(yǎng)殖。達氏鱘的精子研究目前有關于其生理生態(tài)[17-18]、結構[19]及保存[20]等方面的報道，對西伯利亞鱘精子的研究主要涉及保存方法及環(huán)境因素對其結構的影響[21-23]，然而關于天然棲息水域迥異、珍稀級別不同的這兩種鱘屬魚類的精子超微結構比較未見報道。本研究采用透射電鏡對達氏鱘和西伯利亞鱘精子超微結構進行比較觀察，以期為鱘類的種質資源的保護與利用及其繁殖生物學研究提供基礎性資料。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

達氏鱘和西伯利亞鱘精子采集時間為2016年12月，來源于四川潤兆漁業(yè)有限公司（軍樂基地）性腺發(fā)育良好的性成熟雄性親本（達氏鱘親本年齡9+，體長 122.2 cm，體重 21.3 kg；西伯利亞鱘親本年齡8+，體長 125.5 cm，體重 32.2 kg），經人工催產后獲得。采集2 mL鱘魚精液，馬上用2.5%的戊二醛固定，裝入樣品箱中并用冰袋降溫，在2 h內帶回實驗室4℃保存。

1.2 實驗方法

透射電鏡樣品制備：將固定好的精液經15 000 r/min離心30 min后棄去上清液，將精子團塊置于2.5%的戊二醛中保存，4℃過夜。樣品經PBS緩沖液清洗3次，每次時間為10 min，然后用1%鋨酸再固定 2 h，用 30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水，最后環(huán)氧樹脂置換，浸透、包埋。超薄切片后經醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，用透射電鏡（日立H-600型，自帶拍照系統(tǒng)）進行觀察和拍照。

2 結果

2.1 頭部

達氏鱘精子頭部（圖1A、圖 1C）長約為 7.15 μm，由頂體和細胞核組成。頂體長約0.68 μm。頂體由頂體泡、亞頂體以及顆粒物質等組成，呈帽狀覆蓋在精子頂端。頂體泡位于頂體的最外層，亞頂體位于頂體泡與核區(qū)之間，且與兩者結合緊密，頂體泡與亞頂體中間具頂體膜，且在頂體后外側存在頂體后外側延長物。細胞核由染色較深的電子致密物組成，核質分布均勻，外周質膜覆蓋，膜與核結合緊密，核中無囊泡。細胞核中有3條核管（內切溝）呈螺旋形排列，從細胞核的橫切面觀察，3條核管之間排列似三角形，3條核管始自植入窩，一直延伸至頂體。

西伯利亞鱘精子頭部（圖1B、圖1D）長約7.12 μm，與達氏鱘精子頭部長度相近，且頭部也分為頂體和細胞核兩部分。西伯利亞鱘頂體長約0.83 μm，較達氏鱘精子頂體長，西伯利亞鱘精子頂體也包括頂體泡、亞頂體以及顆粒物質等，且其精子頂體也存在后側延長物。西伯利亞鱘細胞核也是由電子密度均勻的染色質組成，外周包被核膜。但是在西伯利亞鱘精子細胞核中未發(fā)現(xiàn)內切溝結構。

圖1 達氏鱘和西伯利亞鱘精子頭部對比Figure 1 A comparison of the sperm head of Acipenser dabryanus and Acipenser baerii

2.2 中段

達氏鱘精子中段（圖 2A）長度約為 1.13 μm，呈楔形沿中軸對稱，由線粒體、伸入中段的軸絲以及中心粒復合體等組成。線粒體呈圓形或橢圓形位于細胞核后端質膜和核膜之間，呈環(huán)形單層排列。在中段和細胞核連接處有向核內凹陷的植入窩和纖維體結構。植入窩由膜包被呈囊狀結構，纖維體位于植入窩內。植入窩之后是中心粒復合體，由近端中心粒和遠端中心粒組成，近端中心粒和遠端中心粒相互垂直，近端中心粒位于核植入窩正后方，由9組三聯(lián)微管組成。

西伯利亞鱘精子中段（圖2B）長度約為1.25 μm，相較于達氏鱘精子中段長度要長。西伯利亞鱘精子中段的形狀和結構與達氏鱘的形狀與結構相仿，形狀呈楔形且沿中軸對稱，由線粒體、伸入中段的軸絲以及中心粒復合體等組成，且分布位置相一致。

圖2 達氏鱘和西伯利亞鱘精子中段對比Figure 2 The midsection of sperm of Acipenser dabryanus and Acipenser baerii

2.3 尾部

達氏鱘精子的尾部（圖3A）為一條細長的鞭毛，長約為 39.33 μm，約占全長的 80.26%，由細胞質膜和軸絲組成。尾部軸絲為典型的“9+2”型雙聯(lián)體微管結構，軸絲的起始端與遠端中心粒的末端相連，該處微管清晰，但中央微管僅見雛形，隨著軸絲從袖套中的延伸，軸絲與袖套之間出現(xiàn)的腔越來越大。尾部中間為軸，軸兩側有翼呈扁平形。鞭毛兩側有側鰭，側鰭的基部分布有顆粒狀物質。

西伯利亞鱘精子的尾部（圖3B）也為一條細長的鞭毛，但其鞭毛長約 45.23 μm，約占全長的 84.38%，高于達氏鱘鞭毛占精子全長的比值。西伯利亞鱘精子的鞭毛同樣為典型的“9+2”微管結構，且鞭毛兩側亦有側鰭結構。

圖3 達氏鱘和西伯利亞鱘精子鞭毛對比Figure 3 A comparison diagram of the sperm flagellum of Acipenser dabryanus and Acipenser baerii

3 討論

達氏鱘和西伯利亞鱘均屬于鱘形目，兩者在精子結構上與其他種類的鱘形目魚類相似，整體結構呈蝌蚪狀，由頭部、中段和尾部3部分組成，且頭部具有頂體結構，這一特點與其他硬骨魚類差異明顯。在有關動物精子結構的報道中，哺乳動物和禽類的精子頭部均具有明顯的頂體結構[1-3]，而大多數(shù)硬骨魚類的精子頭部無頂體結構，但在鱘類如中華鱘（Acipenser sinensis）的精子頭部前端發(fā)現(xiàn)明顯的傘狀頂體[26]。頂體是位于精子頭部最前端的帽狀結構，相當于普通細胞內的溶酶體，內含多種酶類。因此可見，頂體結構對提高受精率有重要作用，鱘形目魚類精子頭部的頂體結構可能是其在長期進化過程中為了適應環(huán)境不斷演化而來，是鱘魚類保持其物種延續(xù)的重要策略。同時在兩種鱘魚之間的精子頂體結構都存在后外側延長物（PLP），與郭威[19]、章龍珍等[21]的研究結果基本一致。而目前研究對PLP結構功能還尚未有定論，但有部分學者認為在受精過程中頂體后外側突出物可以錨定在卵上[27]，因此PLP結構的功能可能與提高受精率相關。

頂體后緊接著是細胞核，不同動物的細胞核形狀差異較大。馬鹿（Cervus elaphus）[28]、綿羊（Ovis aries）[29]等有蹄類動物的精子細胞核為扁卵圓形；人（Homo sapiens）[30]、東北虎（Panthera tigris altaica）[31]的精子細胞核呈犁形；大鼠（Rattus norvegicus）[32]、小鼠（Mus musculus）[33]的精子細胞核呈鐮刀狀；大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）[34]呈豆瓣狀，鴕鳥（Struthio camelus）[2]、火雞（Meleagris gallopavo）[3]的細胞核呈長棒狀結構，而本實驗研究的兩種鱘魚的精子細胞核呈短棒狀結構，與哺乳動物和鳥類都不相同，與泥鰍[4]、大口黑鱸[5]、川陜哲羅鮭（Hucho bleekeri）[24]、齊口裂腹魚（Schizothorax plagiostomus）[25]等大多數(shù)硬骨魚類的精子細胞核為圓形的特征也不相同[35]，這可能是和鱘魚適應環(huán)境相關。本研究中兩種鱘魚精子細胞核局部構造存在差異，達氏鱘細胞核中發(fā)現(xiàn)內切溝，這一結構在西伯利亞鱘的精子細胞核中沒有觀察到，有研究表明內切溝可能在受精時維持精子細胞核呈錐狀進入卵內有關[36]，有利于提高達氏鱘受精率。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，達氏鱘和西伯利亞鱘精子尾部鞭毛相似，兩側均長有側鰭，側鰭結構并非是種屬間的特異性結構，在其他種類鱘魚[8-14，17]以及其他硬骨魚類[5，24-25]精子超微結構的研究中也發(fā)現(xiàn)側鰭結構，但在部分魚類[4，6，37-38]的精子尾部鞭毛無側鰭結構。目前為止，對于側鰭的生物學功能仍不是十分清楚，M.N.Dilauro等[8]認為側鰭是對體外受精的適應，有助于提高精子游動速率。但有學者認為鞭毛的鰭狀物與受精環(huán)境并沒有相關性，因為發(fā)現(xiàn)在許多體內受精的魚類鞭毛中也出現(xiàn)了鰭狀結構[39]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)兩種鱘魚精子側鰭的基部分布著許多小的顆粒狀物質，這些顆粒狀物質可能與提高精子的運動速度有關，有助于提高鱘魚受精率。