基于16SrRNA基因測(cè)序技術(shù)研究低聚異麥芽糖對(duì)奶牛瘤胃細(xì)菌菌群的影響

郭 成，郭婷婷，胡丹丹，張力莉，徐曉鋒

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021）

低聚異麥芽糖是α-1，6-糖苷鍵相連的低聚糖類，是功能性寡糖的一種，對(duì)腸道微生物菌群具有調(diào)節(jié)作用[1-2]。Zhang等[3]在肉雛雞的基礎(chǔ)日糧添加0.3%、0.6%、0.9%和 1.2%的異麥芽糖，結(jié)果表明，雛雞的生長(zhǎng)性能得到提高，而且在補(bǔ)充異麥芽糖后，十二指腸消化道中異丁酸和乙酸的含量降低。S.N.Thitaram等[4]給雞添加低聚異麥芽糖會(huì)顯著增加雞盲腸雙歧桿菌數(shù)量。張建斌等[5]研究報(bào)道日糧添加0.3%低聚異麥芽糖在一定程度上能夠替代抗生素，顯著增加雞的盲腸和回腸雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量。A.Ketabi等[6]發(fā)現(xiàn)低聚異麥芽糖可以刺激大鼠腸道中乳酸桿菌的生長(zhǎng)。王少光等[7]研究表明低聚異麥芽糖也能促進(jìn)小鼠腸道雙歧桿菌的增值，顯著降低大腸桿菌數(shù)量，對(duì)腸道乙酸、丁酸等揮發(fā)酸模式存在顯著影響。陳國(guó)旺等[8]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺與低聚異麥芽糖互作會(huì)顯著增加豬腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌的增值。大量研究表明低聚異麥芽糖能夠促進(jìn)單胃動(dòng)物和雞腸道有益菌群的增值，改變腸道揮發(fā)酸模式。

近年來(lái)異麥芽糖在反芻動(dòng)物上的研究也逐步開(kāi)展。王新峰等[9]在斷奶羔羊上研究表明，低聚異麥芽糖會(huì)降低瘤胃產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量。祁茹等[10]研究發(fā)現(xiàn)低聚異麥芽糖也能顯著降低成年反芻動(dòng)物奶山羊的腸道大腸桿菌數(shù)量。反芻動(dòng)物與單胃動(dòng)物的最大不同在于瘤胃系統(tǒng)，瘤胃存在纖毛蟲(chóng)、真菌以及大量細(xì)菌，低聚異麥芽糖對(duì)單胃動(dòng)物腸道菌群的作用已經(jīng)很清楚，對(duì)瘤胃菌群的作用尚不清晰。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在奶牛基礎(chǔ)日糧中添加60 g低聚異麥芽糖可以改變奶牛瘤胃中揮發(fā)酸的比例，提高瘤胃中丁酸的發(fā)酵比例[11]。這對(duì)于提高牛奶的乳脂合成具有潛在意義，但具體機(jī)制還不清楚。本研究擬從瘤胃微生物區(qū)系去探討低聚異麥芽糖對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

選擇4頭泌乳中國(guó)荷斯坦奶牛作為試驗(yàn)動(dòng)物，分為對(duì)照組和試驗(yàn)組。奶牛日產(chǎn)奶量30 kg左右、體重為550 kg左右。根據(jù)NRC（2001）奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制日糧，精粗比為 40∶60（DM 基礎(chǔ)，m:m），日糧組成和營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。采用TMR飼喂方式，全天自由飲水。

表1 奶牛試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分Table 1 Dietary composition and nutritional composition of dairy cows%

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將4頭試驗(yàn)牛隨機(jī)分為2組，每組兩頭牛，一組為對(duì)照組（CK），一組為實(shí)驗(yàn)組（IOT）。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)飼糧并同時(shí)添加60 g/頭低聚異麥芽糖（純度為90%，鄭州文翔化工產(chǎn)品有限公司），通過(guò)口腔灌注添加，在早晚飼喂前分兩次灌注。采用兩階段試驗(yàn)設(shè)計(jì)，第一階試驗(yàn)結(jié)束，經(jīng)過(guò)恢復(fù)期后，再將試驗(yàn)組和對(duì)照組交叉，由之前對(duì)照組變?yōu)樵囼?yàn)組，每階段對(duì)照組和試驗(yàn)組重復(fù)數(shù)為2，合并后每組n=4。試驗(yàn)每階段21 d，其中預(yù)飼期7 d，正式期14 d。

1.3 樣品的采集與處理

使用負(fù)壓吸取裝置（自行設(shè)計(jì)），通過(guò)奶牛口腔釆集瘤胃液。采集時(shí)間分別為飼喂前（0 h）及飼喂后2、4、6 h取樣，每次取瘤胃液50 mL。為獲得具有代表性的樣品，每天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)所取的瘤胃內(nèi)容物樣品經(jīng)混勻后各取5 mL，充分混合，轉(zhuǎn)入凍存管放液氮臨時(shí)保存，轉(zhuǎn)移到試驗(yàn)室放-80℃冰箱保存。

1.4 DNA樣品提取、擴(kuò)增

1.4.1 DNA 提取

取2 mL瘤胃液提取瘤胃微生物DNA，采用試劑盒法，試劑盒采購(gòu)于南京建成生物研究所。

1.4.2 PCR 擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增前用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品的純度和濃度，于離心管中取適量的樣品進(jìn)行稀釋。將稀釋后的基因組DNA作為模板。瘤胃液DNA擴(kuò)增目的片段為V3+V4區(qū)，大概長(zhǎng)度468 bp，引物序列為：V3+V4：341F-806R[12]。

341F：CCTAYGGGRBGCASCAG；

806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT

1.5 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

PCR產(chǎn)物使用膠濃度為2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)；依照PCR產(chǎn)物濃度的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行等濃度混樣，充分混勻后使用膠濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，使用南京建成生物研究所提供的回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.6 Miseq測(cè)序及數(shù)據(jù)

將樣品送至廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行Miseq測(cè)序，其測(cè)序采用Miseq 2500 PE 250平臺(tái)，數(shù)據(jù)由平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P＜0.05作為差異顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總DNA質(zhì)檢結(jié)果

對(duì)瘤胃液樣品的總DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，濃度及純度均符合IlluminaMiseq平臺(tái)測(cè)序要求。

2.2 奶牛瘤胃細(xì)菌菌群序列及多樣性分析

2.2.1 瘤胃細(xì)菌菌群 OTUs比較

經(jīng)IlluminaMiseq測(cè)序結(jié)束后，除去低質(zhì)量序列，通過(guò)序列拼接，應(yīng)用Mothur根據(jù)97%的序列相似度，對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類，對(duì)樣品進(jìn)行OTU的統(tǒng)計(jì)，剔除稀有OTU后對(duì)照組CK樣品獲得2734個(gè)，試驗(yàn)組IOT樣品獲得2 593個(gè)。樣品間差異不顯著（P＞0.05），兩個(gè)樣品共享OTU為1 434個(gè)（見(jiàn)圖1）。

圖1 低聚麥芽糖對(duì)瘤胃細(xì)菌菌群基因OTU分布的影響Figure 1 Effect of isomaltooligosaccharides on the distribution of ruminal bacterial flora gene OTU

2.2.2 瘤胃細(xì)菌alpha多樣性分析

基于OTU的結(jié)果，計(jì)算樣品的alpha多樣性，如表2所示。對(duì)照組和試驗(yàn)組樣品的alpha多樣性結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知飼喂低聚異麥芽糖組奶牛瘤胃細(xì)菌菌群的chao值和ace值與對(duì)照組比較差異不顯著，說(shuō)明飼喂低聚異麥芽糖使瘤胃細(xì)菌多樣性無(wú)顯著影響。與對(duì)照組比較瘤胃細(xì)菌菌群的Shannon指數(shù)比較，說(shuō)明飼喂低聚異麥芽糖組奶牛瘤胃菌群種類分布均勻度有升高的趨勢(shì)（P＜0.1）。本試驗(yàn)的瘤胃液樣品的Shannon曲線見(jiàn)圖2。如圖所示，當(dāng)測(cè)序深度達(dá)到5 000 reads時(shí)，曲線趨于平緩，各樣品達(dá)到飽和狀態(tài)，表明本試驗(yàn)的測(cè)序深度可以覆蓋各樣品中大多數(shù)微生物。

表2 樣品在0.03距離下的Alpha豐富程度表Table 2 Alpha richness table of samples at 0.03 distance

圖2 低聚麥芽糖對(duì)瘤胃細(xì)菌菌群基因Shannon指數(shù)的影響Figure 2 Effect of isomaltooligosaccharides on Shannon of ruminal bacterial flora gene

2.2.3 瘤胃細(xì)菌的beta多樣性分析

Beta diversity值越接近0，表示這兩個(gè)樣品在物種多樣性方面存在的差異越小。試驗(yàn)組和對(duì)照組的beta多樣性分析結(jié)果見(jiàn)圖3。如圖所示，從圖形上觀察，試驗(yàn)組和對(duì)照組相比，（即IOT-1和CK-3、IOT-2和 CK-4、IOT-3 和 CK-1、IOT-4 和 CK-2），發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組較對(duì)照組相比顏色有變化，且beta diversity值均超過(guò)0.02，說(shuō)明奶牛日糧中添加異麥芽糖可以改變瘤胃細(xì)菌菌群的多樣性。

2.3 奶牛瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 瘤胃細(xì)菌在門水平上的結(jié)構(gòu)分析

從門水平上分析，圖4可以直觀反映出試驗(yàn)組和對(duì)照組采集的樣品中所含的主要細(xì)菌門主要為Bacteroidetes（擬桿菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）和Proteobacteria（變形細(xì)菌門），占到了總細(xì)菌門比例的95%以上。

圖4 不同處理組門水平上的菌群結(jié)構(gòu)Figure 4 Microbial structure at phylum level in different treatment groups

2.3.2 瘤胃細(xì)菌在屬水平上的結(jié)構(gòu)分析

進(jìn)一步研究到屬水平，分析瘤胃種群結(jié)構(gòu)。圖5為屬水平上瘤胃細(xì)菌的種群組成。由圖5也可知，Prevotella（普雷沃式菌屬）、Butyrivibrio（丁酸弧菌屬）、Succiniclasticum（解琥珀酸菌屬）和Ruminococcus（瘤胃球菌屬）這4種細(xì)菌屬占總菌屬的60%左右。

2.3.3 低聚異麥芽糖對(duì)瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響

以門水平和屬水平為代表，分析瘤胃菌群微生物變化。兩組試驗(yàn)牛瘤胃液中總細(xì)菌共涉及25個(gè)門，225個(gè)屬。本表共列出7個(gè)門，24個(gè)屬。由表3可知，在門水平上，在日糧中添加低聚異麥芽糖后，奶牛瘤胃Verrucomicrobia（疣微菌門）豐度顯著增加（P＜0.05），其他菌門豐度無(wú)明顯變化。在屬水平上，Prevotella（普雷沃式菌屬）、NA（未注釋菌屬）、S24-7_NA、Ruminococcaceae_NA（未注釋瘤胃球菌屬）、Ruminococcus（瘤胃球菌屬）、Prevotellaceae_NA（未注釋普雷沃式菌屬）、Lachnospiraceae_NA（未注釋毛螺旋菌屬）、Succiniclasticum（解琥珀酸菌屬）、Succinivibrionaceae_NA（未注釋琥珀酸弧菌屬）、Butyrivibrio（丁酸弧菌屬）、Succiniclasticum（解琥珀酸菌屬）和Treponema（密螺旋體屬)和Coprococcus（糞球菌屬）共11個(gè)菌屬豐度占整體的91%以上。由表3可知，飼喂低聚異麥芽糖后，奶牛瘤胃液Comamonadaceae_NA（未注釋叢毛單胞菌屬）豐度極顯著提高（P＜0.01），WCHB1-25_NA 豐度極顯著增加（P＜0.01），Ruminobacte（瘤胃桿菌屬）豐度顯著增加（P＜0.05），鹽細(xì)菌屬 Salinibacterium 豐度顯著增加（P＜0.05），Lactobacillus（乳酸桿菌屬）豐度顯著降低（P＜0.05）。Acidaminococcus（氨基酸球菌屬）、Aerom-icrobium（氣微菌屬）、Actinotalea、Adlercreutzia菌屬豐度有增加趨勢(shì)（0.05＜P＜0.1），TMEG_NA 菌屬豐度有降低的趨勢(shì)（0.05＜P＜0.1）。

圖5 不同處理組屬水平上的菌群結(jié)構(gòu)Figure 5 Microbial structure at genus level in different treatment groups

3 討論

反芻動(dòng)物瘤胃中的微生物將纖維物質(zhì)轉(zhuǎn)化為營(yíng)養(yǎng)成分和能源物質(zhì)供機(jī)體吸收利用。由細(xì)菌，真菌，原蟲(chóng)以及古細(xì)菌等組成的瘤胃微生物群體，成為了宿主反芻動(dòng)物必不可少的共生關(guān)系的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。反芻動(dòng)物瘤胃細(xì)菌中的，優(yōu)勢(shì)菌群為擬桿菌門，厚壁菌門，纖維桿菌和變形菌門[13]。本試驗(yàn)中，在添加低聚異麥芽糖后，奶牛瘤胃細(xì)菌多樣性無(wú)顯著性差異。祁茹等[14]報(bào)道的低聚異麥芽糖對(duì)瘤胃液細(xì)菌總數(shù)沒(méi)有產(chǎn)生顯著性影響。閔力[15]通過(guò)PCR-DGGE技術(shù)研究功能性寡糖組合對(duì)錦江黃牛瘤胃固相細(xì)菌的多樣性發(fā)現(xiàn)，日糧中添加功能性寡糖增加了棲瘤胃普雷沃氏菌屬，提高瘤胃中微生物的多樣性。王新峰等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在羔羊飼糧中添加低聚異麥芽糖及混合低聚糖對(duì)瘤胃細(xì)菌的多樣性無(wú)顯著影響，添加低聚異麥芽糖對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃細(xì)菌菌群多樣性影響的報(bào)道結(jié)果并不一致，低聚異麥芽糖對(duì)瘤胃菌群多樣性影響有可能與動(dòng)物種類，發(fā)育階段以及寡糖添加量有關(guān)。

粗飼料是反芻動(dòng)物最主要的飼料來(lái)源，細(xì)菌在分解利用纖維素過(guò)程中起主要作用，其中纖維素降解菌起重要作用。纖維降解菌通過(guò)酶的催化使纖維素和半纖維素分解為瘤胃能夠吸收的小分子物質(zhì)，纖維物質(zhì)的降解需要在各種酶的協(xié)同作用下完成，酶活性的改變會(huì)影響纖維物質(zhì)的降解[17-20]。林英庭等[21]研究表明，在山羊的日糧中添加1%的低聚異麥芽糖，可以顯著提高纖維降解酶活性，提高纖維降解率。本試驗(yàn)中，添加低聚異麥芽糖后，發(fā)現(xiàn)添加低聚異麥芽糖并未顯著改變瘤胃球菌、纖維桿菌屬等主要瘤胃纖維降解菌的豐度。添加外源寡糖可以提高常用飼料的干物質(zhì)瘤胃消失率，祁茹[22]在山羊日糧中添加低聚異麥芽糖，發(fā)現(xiàn)玉米，豆粕，羊草，苜蓿青干草的瘤胃消失率顯著提高。反芻動(dòng)物精飼料多為淀粉構(gòu)成，在降解淀粉中起著突出作用的瘤胃細(xì)菌包括普雷沃氏菌屬，梭菌屬，牛鏈球菌屬，產(chǎn)琥珀酸纖維桿菌屬，嗜淀粉瘤胃桿菌和反芻動(dòng)物月形單胞菌等[23]。本研究表明，日糧添加低聚異麥芽糖對(duì)奶牛瘤胃液瘤胃桿菌屬豐度提高顯著，可促進(jìn)瘤胃內(nèi)淀粉的分解代謝。

高精日糧會(huì)導(dǎo)致瘤胃酸中毒或亞急性酸中毒，當(dāng)瘤胃處于酸中毒或者亞急性瘤胃酸中毒時(shí)，瘤胃發(fā)酵模式和脂肪酸乳腺的分泌會(huì)發(fā)生改變[24-25]。研究表明，當(dāng)奶牛發(fā)生亞急性酸中毒時(shí)可引起乳脂下降[26]。乳酸產(chǎn)生菌與乳酸利用菌之間的菌群平衡紊亂，使瘤胃內(nèi)乳酸積累，是誘發(fā)瘤胃酸中毒的主要原因[27-28]。瘤胃內(nèi)乳酸產(chǎn)生菌主要有溶纖維丁酸弧菌、牛鏈球菌、乳酸桿菌等[29]。本試驗(yàn)中，日糧添加低聚異麥芽糖，奶牛瘤胃乳酸生成菌乳酸桿菌豐度顯著降低，這對(duì)于調(diào)控瘤胃pH有一定意義。

表3 低聚異麥芽糖對(duì)瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Effect of isomaltooligosaccharides on the structure of bacterial flora in rumen%

4 結(jié)論

本試驗(yàn)利用16SrRNA基因高通量測(cè)序技術(shù)分析奶牛瘤胃細(xì)菌菌群在添加低聚異麥芽糖后的變化，發(fā)現(xiàn)在日糧中添加低聚異麥芽糖后，奶牛瘤胃細(xì)菌菌群多樣性無(wú)顯著差異，并未顯著改變瘤胃纖維菌群等主要瘤胃纖維降解菌的豐度，降解淀粉瘤胃桿菌屬顯著提高，乳酸生成菌乳酸桿菌豐度顯著降低。