響應(yīng)面法優(yōu)化鱘魚肝臟鐵蛋白提取工藝

饒承冬，葉 浪，鄧 靜，白稚子，戴卓君，李沛隆，李樹紅，王彩霞，張志清，陳安均，劉興艷，申光輝，吳賀君，羅擎英，黎杉姍，蘇 趙，李美良

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安 625014）

1937年，Laufberge首次從馬的脾臟中分離純化出鐵蛋白（Ferritin），并繼而發(fā)現(xiàn)動物、植物、微生物體內(nèi)均廣泛地存在鐵蛋白[1]。鐵蛋白作為一種球形分子，由蛋白殼和鐵核兩部分構(gòu)成，其分子質(zhì)量為450kD，具有很好的酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性[2]。研究發(fā)現(xiàn)，鐵蛋白是一種新型的天然補鐵制劑，它具有調(diào)節(jié)生物體內(nèi)鐵代謝平衡的生理功能，使機體內(nèi)的鐵元素保持一種可溶、無毒且生物可利用的狀態(tài)，可有效緩解鐵缺乏癥[3-4]。

鱘魚（Sturgeon）又稱鱘龍，屬鱘形目，是一類原始古老的軟骨硬鱗魚類[5]。我國是一個鱘魚養(yǎng)殖大國，據(jù)統(tǒng)計，2016年，我國的鱘魚產(chǎn)量達(dá)到了8.9萬噸[6]，因其特有的經(jīng)濟價值、營養(yǎng)價值和生物學(xué)特性而備受關(guān)注。國內(nèi)外相關(guān)研究人員對鱘魚的研究主要集中在其肌肉、魚卵、軟骨等幾方面[7-9]。鱘魚在加工成產(chǎn)品之后，往往會產(chǎn)生大量的下腳料，如魚腸、肝臟、魚皮等，如何將這些廢棄物加以綜合利用成為近年來的研究熱點，倍受養(yǎng)殖業(yè)關(guān)注。

目前，對于鐵蛋白的研究主要集中在性質(zhì)研究方面，對于提取方法的研究報道較少。本文旨在采用單因素分析結(jié)合響應(yīng)面法探討從鱘魚肝臟提取鐵蛋白的最佳工藝，為鱘魚肝臟的資源開發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試劑：西伯利亞鱘魚肝臟：由四川潤兆食品有限公司提供，保存于-20℃ ； 菲 啰 嗪，KH2PO4，NaOH，Tris，HCl，以上試劑均為分析純，購于成都科龍化工試劑有限公司。

儀器：E-201-95型pH計（上海佑科儀器儀表有限公司）；TGL 16M高速冷凍離心機（湖南湘智離心機有限公司）；SORVALL Legend MICRO 17酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；FA1204B型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；HH-8型數(shù)顯水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；ULUP-IV-10T超純水機（成都超純科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 鱘魚鐵蛋白的提取

將鱘魚肝臟于4℃條件下解凍后，除去脂肪組織并切碎，加入適量緩沖液于組織搗碎機中攪碎；然后4℃、10 000 r/min離心20 min，過濾除去沉淀和上層脂肪，收集中間層清液。

將收集的清液于60～75℃水浴加熱20min，以使非耐熱蛋白變性沉淀；加熱完畢，迅速冷卻至室溫，再次對樣品進(jìn)行多次離心處理（4℃，10 000 r/min），每次20 min，收集上清液。按照一定飽和度，向上清液中加入硫酸銨，并于4℃條件下放置過夜，讓鐵蛋白沉淀析出。在4℃下，以10 000 r/min將上清液離心20 min，除去上清，收集紅色沉淀，并用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）溶解。置于透析袋內(nèi)，用超純水透析過夜，除去硫酸銨和其他鹽，取透析液備用。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 緩沖液種類對鐵蛋白提取率的影響

在其他提取條件相同的情況下，分別使用相同摩爾濃度和pH的Tris-HCl溶液和KH2PO4-NaOH溶液提取鐵蛋白，探究不同緩沖液種類對鱘魚肝臟鐵蛋白提取率的影響。

1.2.2.2 緩沖液pH對鐵蛋白提取率的影響

在其他提取條件相同的情況下，分別使用不同pH（7、7.5、8、8.5、9）的 KH2PO4-NaOH 溶液提取鐵蛋白，探究不同緩沖液pH對鱘魚肝臟鐵蛋白提取率的影響。

1.2.2.3 料液比對鐵蛋白提取率的影響

在其他提取條件相同的情況下，探究在不同料液比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）條件下，鱘魚肝臟鐵蛋白的得率。

1.2.2.4 處理溫度對鐵蛋白提取率的影響

在其他提取條件相同的情況下，使用不同的溫度（60℃、65℃、70℃、75℃）處理第一次離心之后收集的清液，探究不同的溫度處理對鱘魚肝臟鐵蛋白提取率的影響。

1.2.2.5 硫酸銨飽和度對鐵蛋白提取率的影響

在其他提取條件相同的情況下，分別使用不同飽和度的硫酸銨（30%、40%、50%、60%、70%、80%）沉淀鐵蛋白，探究不同飽和度硫酸銨對鱘魚肝臟鐵蛋白提取率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

如表1所示，根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇料液比（X1）、硫酸銨飽和度（X2）、pH（X3）為影響因子，將鐵蛋白提取率作為響應(yīng)值，進(jìn)行3因子3水平的響應(yīng)面試驗設(shè)計，利用Design-Expert 8軟件優(yōu)化分析。

表1 響應(yīng)面試驗編碼和參數(shù)Table 1 Coded values and corresponding values of response surface methodology

1.2.4 提取液中鐵含量的測定

參照楊秀麗[10]的方法，使用Ferrozine試劑法測定Fe濃度。用微量移液器量取20 μL粗鐵蛋白溶液，加入250 μL 30%三氯乙酸，再加入730 μL超純水搖勻，將上述混合液在4 000 g離心1 min。離心后取700 μL上清液于新的離心管中，依次加入100 μL飽和乙酸銨，62.5 μL 0.12 mol/L 抗壞血酸，62.5 μL 0.25 mol/LFerrozine，最后加入 75 μL 超純水，震蕩搖勻。室溫下反應(yīng)4 h后，在562 nm下測定吸光值，得到吸光值A(chǔ)562，即可表示鐵含量的多少。

1.2.5 總蛋白的測定

采用Lowry[11]法測定樣品蛋白含量，具體測定方法參照試劑盒使用說明書。

2 結(jié)果與分析

2.1.1 緩沖液種類對鐵蛋白提取率的影響

由圖1可知，使用KH2PO4-NaOH緩沖液提取鐵蛋白，其得率高于使用相同摩爾濃度和pH的Tris-HCl緩沖液的提取率，因此本實驗將KH2PO4-NaOH作為鐵蛋白提取緩沖液。

圖1 不同緩沖液對鐵蛋白提取率的影響Figure 1 Effect of different buffers on the extraction rate of ferritin

2.1.2 緩沖液pH對鐵蛋白提取率的影響

由圖2可知，使用相同摩爾濃度的KH2PO4-NaOH緩沖液提取鐵蛋白，其提取率隨著緩沖液pH的增加呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)緩沖液pH值為8時，鐵蛋白提取率達(dá)到最大值，因此選擇8作為最適提取pH值。

圖2 緩沖液pH對鐵蛋白提取率的影響Figure 2 Effect of buffer pH on the extraction rate of ferritin

2.1.3 料液比對鐵蛋白提取率的影響

由圖3可知，使用相同的緩沖液提取鐵蛋白，隨著料液比的增加，鐵蛋白的提取率也逐漸增加，在料液比超過1∶4之后，提取率增加的幅度減緩，說明一定的緩沖液量有利于鱘魚肝臟中鐵蛋白的溶出，但是增加緩沖液的量會增加后續(xù)處理的工作量。因此選擇1∶4（w/v）為最佳提取料液比。

圖3 料液比對鐵蛋白提取率的影響Figure 3 Effect of solid to liduid ratio on the extraction rate of ferritin

2.1.4 熱處理溫度對鐵蛋白提取率的影響

清液經(jīng)過加熱處理，可以使一些非耐熱蛋白變性沉淀，經(jīng)過再次離心除去，可以減少雜蛋白的含量，有利于后面純化工作的進(jìn)行。由圖4可知，隨著熱處理的溫度上升，雖然可以使提取液的雜蛋白減少，但是高溫（＞65℃）條件下，也會使部分鐵蛋白變性失活，從而降低了提取率，當(dāng)溫度為65℃的時候，鐵蛋白的得率最高，而雜蛋白也較少；在溫度低于65℃的時候，雖然鐵蛋白的得率較高，但是溶液中混合的雜蛋白也相對較多，將會對鐵蛋白后續(xù)的純化處理工作增加一定難度。綜合考慮，選擇65℃熱處理，提取的效果最佳。

圖4 熱處理溫度對鐵蛋白提取率的影響Figure 4 Effect of heat treatment temperature on extraction rate of Ferritin

2.1.5 硫酸銨飽和度對鐵蛋白提取率的影響

由圖5可知，沉淀時隨著添加硫酸銨的飽和度的增加，其鐵蛋白的提取率逐漸增加，當(dāng)飽和度超過50%時，隨著硫酸銨飽和度的增加，鐵蛋白的提取率沒有明顯的變化，這可能是因為，當(dāng)硫酸銨飽和度為50%時，幾乎所有的鐵蛋白都沉淀析出了。因此選擇50%為最佳硫酸銨沉淀飽和度。

圖5 硫酸銨飽和度對鐵蛋白提取率的影響Figure 5 Effect of ammonium sulfate saturation on extraction rate of Ferritin

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇料液比（X1）、硫酸銨飽和度（X2）和 pH（X3）為自變量，鐵蛋白提取率（Y）為響應(yīng)值，采用Design Expert 8軟件對試驗進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

2.2.2 試驗擬合分析

試驗擬合結(jié)果如下：

由表3可知，該模型R2=97.10%，失擬項不顯著（P=0.091 4＞0.05），回歸模型極顯著（P=0.002 5＜0.01），說明該模型與實際試驗擬合度較好；從F值可以得出，料液比、硫酸銨飽和度、pH對實驗的影響大小為：X3＞X1＞X2，其試驗結(jié)果與一些學(xué)者的研究相一致，辛敏等[12]采用響應(yīng)面法優(yōu)化鷹嘴豆鐵蛋白提取工藝，得到各因素影響大小為：緩沖液pH＞料液比＞鹽析鹽摩爾濃度；劉文營[13]從鷹嘴豆中提取鐵蛋白，通過對pH值、鹽梯度的三水平的考察，得到提取緩沖液pH對鐵蛋白提取率的大小有一定的影響。因此，可以用此模型對鱘魚肝臟鐵蛋白提取的工藝條件進(jìn)行很好的預(yù)測。

表3 鐵蛋白提取率的響應(yīng)面二次模型方差分析Table 3 Variance analysis of response surface quadratic regression equation of Ferritin extraction rate

2.2.3 響應(yīng)面和等高線分析

響應(yīng)面可以描述各變量間的相互作用、預(yù)測因素的最優(yōu)條件值[14]。各自變量交互作用對鐵蛋白提取率影響的響應(yīng)面與等高線見圖6～圖8。

由圖6可知，X1和X2交互影響，鐵蛋白的提取率隨X1和X2的變化較平緩，此外，在其等高線圖中，等高線沿X1軸變化的趨勢與X2軸的變化大體相同，據(jù)此推測，X1和X2對鐵蛋白提取率沒有顯著影響。

圖6 料液比與硫酸銨飽和度對響應(yīng)值的影響（×10-5）Figure 6 Effect of liduid to solid ratio and ammonium sulfate saturation on response values

根據(jù)圖7，鐵蛋白的提取率隨著X3的增加，表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，有最大值；響應(yīng)面坡度隨X1的變化較小，在其等高線圖中，等高線隨X3軸變化的趨勢明顯大于X1軸。因此，X1影響鐵蛋白提取率的顯著性小于X3。

圖7 料液比與pH對響應(yīng)值的影響（×10-5）Figure 7 Effect of liduid to solid ratio and pH on response values

根據(jù)圖8，鐵蛋白的提取率隨著X3的增加，表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，有最大值；響應(yīng)面坡度隨X2的變化較小，在其等高線圖中，等高線X3軸變化的趨勢明顯大于X2軸。因此，X2影響鐵蛋白提取率的顯著性小于X3。

圖8 硫酸銨飽和度與pH對響應(yīng)值的影響（×10-5）Figure 8 Effect of ammonium sulfate saturation and pH on response values

綜上，比較三個因素的兩兩交互作用圖，pH對鱘魚肝臟鐵蛋白提取率的影響較大，表現(xiàn)為在選定的取值區(qū)間內(nèi)曲面響應(yīng)變化大，這與回歸模型方差分析中的一次項X3（P＜0.01）結(jié)果相一致。

2.2.4 驗證試驗

通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗，獲得鐵蛋白最佳提取條件為：料液比 1∶3.81，硫酸銨飽和度 56.90%，緩沖液pH值8.12，此時鐵蛋白的提取率為0.003386%。根據(jù)實際情況，將提取條件微調(diào)為料液比1∶3.8，硫酸銨飽和度57%，緩沖液pH值8.12。按照調(diào)整后提取條件進(jìn)行3次驗證試驗，結(jié)果鐵蛋白的得率0.003 295%，與預(yù)測值偏差小，表明響應(yīng)面法可以用于優(yōu)化鐵蛋白的提取工藝。

3 討論與結(jié)論

響應(yīng)面法為多元二次回歸方法，可以減少試驗次數(shù)，大大降低試驗工作量，并可比較影響因子之間交互作用；通過對響應(yīng)面建立的模型進(jìn)行優(yōu)化求解，可提出試驗優(yōu)化方案，解決響應(yīng)面法在試驗設(shè)計與優(yōu)化的實際應(yīng)用中遇到的問題[15]。目前，該方法經(jīng)常用于對多肽[16]、多糖[17]、黃酮[18]等物質(zhì)的提取工藝及一些食品加工工藝[19]進(jìn)行優(yōu)化。

由于鐵蛋白特殊的結(jié)構(gòu)和功能，其逐漸成為相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點之一。目前對鐵蛋白在基因、分離純化和含量測定方法、鐵釋放動力學(xué)、納米材料的制備等方面的研究都有了很大的進(jìn)展。李忻怡等[20]對青島文昌魚鐵蛋白ferritin基因的序列和一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，并對其二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，為文昌魚鐵蛋白ferritin和研究該分子的功能提供了參考。王群力等[21]魟 魟選取 魚肝臟為研究材料，研究 魚鐵蛋白釋放鐵的動力學(xué)過程和規(guī)律，結(jié)果認(rèn)為鐵蛋白釋放鐵的過程均受到蛋白殼自身柔性調(diào)節(jié)速率的影響。對于水產(chǎn)品來源的鐵蛋白的提取工藝報道較少，本試驗采用響應(yīng)面法優(yōu)化鱘魚肝臟鐵蛋白提取工藝，選取的因素對鐵蛋白影響的大小為：pH＞料液比＞硫酸銨飽和度，其原因可能是緩沖液中的H+和OH-影響了鐵蛋白表面電荷的平衡，從而有利于鐵蛋白的溶出。與辛敏[12]和劉文營[13]等從鷹嘴豆中提取鐵蛋白優(yōu)化工藝因素影響大小相一致，雖然物種不同，鐵蛋白提取率各有差異，但實驗結(jié)果表明，緩沖液pH值的大小對鐵蛋白的提取率的影響較其他因素的影響具有顯著性。

實驗通過對鱘魚肝臟鐵蛋白提取工藝進(jìn)行報道，以期為水產(chǎn)品鐵蛋白的相關(guān)研究提供一定參考。