c-Myc、mTOR、HIF-1α基因啟動子區(qū)域DNA甲基化與類風濕關節(jié)炎的相關性

黃海燕，鄒榮鑫，李曉可，褚贊波，施善芬，應 穎，彭 勇，張 順，陳 勇

近年來相關研究發(fā)現(xiàn) Th17和Treg細胞在類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthribis,RA)發(fā)生和進展過程中起著至關重要的作用[1]。糖代謝與Th17/Treg細胞分化密切相關[2]。RA患者關節(jié)滑膜增厚、大量炎癥細胞浸潤及炎癥因子釋放造成關節(jié)微環(huán)境的缺氧，缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是調節(jié)體內細胞缺氧反應的核心因子[3]。有研究發(fā)現(xiàn)轉錄因子HIF-1α調控Th17的分化過程向無氧糖酵解方向發(fā)生代謝轉變[4-6]。c-Myc 活化可上調與葡萄糖吸收及糖酵解相關基因的表達，且與HIF-1α 協(xié)同調節(jié)體內糖代謝[7]。mTORC1會通過影響個別信使RNA的翻譯過程而影響HIF-1α的活性[8]。DNA甲基化(DNA methylation)是一種表觀遺傳(epigenetic)修飾，是免疫性疾病、腫瘤、高血壓等多種疾病發(fā)生過程中的一個重要危險因素[9]，一般來說，DNA甲基化會抑制基因的表達[10]。

本研究探討RA患者c-Myc、HIF-1α、mTOR基因啟動子區(qū)域甲基化水平，以期深入研究RA的發(fā)病機制，為RA患者早期診斷及治療提供新思路。

1 對象與方法

1.1 對象

2017年5月至10月就診于寧波市第二醫(yī)院符合納入標準和排除標準的RA患者45例為RA組，其中女35例，男10例;同期來自寧波市第二醫(yī)院體檢中心的體檢人群45例為對照組，其中女35例，男10例。RA診斷標準參照美國風濕病學會1987年RA診斷標準[11]。排除標準：(1)合并其他風濕性疾??；(2)合并其他慢性疾?。?3)明顯血液學指標異常：外周血白細胞計數(shù)<4×109/L或血小板計數(shù)<100×109/L；(4)感染、腫瘤等引起的關節(jié)疼痛。在上述標準基礎上并確認人群之間無血緣關系。本研究所有受試者均簽署知情同意書。

記錄研究對象的年齡(Age)、性別(Sex)、類風濕因子(RF)、免疫球蛋白(IgM、IgG)、C反應蛋白(CRP)、血沉(ESR)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、白細胞計數(shù)(WBC)、血紅蛋白(HB)、壓痛關節(jié)數(shù)(TJC)、腫脹關節(jié)數(shù)(SJC)、DAS28評分(DAS28)等。

1.2 方法

經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者知情同意簽字后抽取受試者外周靜脈血2 ml至2% EDTA管中。用QIAamp DNA試劑盒(QIAGEN公司，德國)提取全基因組DNA，并置于-80 ℃冰箱保存。用DNA甲基化修飾試劑盒(Zymo公司，美國)對DNA進行亞硫酸鹽修飾[12-14]。PCR引物合成由PyroMark Assay Design 2.0 (QIAGEN, 德國) 設計，由華大基因合成(引物序列見表1)。PCR反應體系(50 μl)：H2O 34.8 μl，5×buffer GC(KAPA)10 μl，dNTP(10 mmol/each)1 μl，Primer(up 50 pmol/μl)1 μl，Primer(down 50 pmol/μl)1 μl，Template 2 μl，Taq(5 U/μl)0.2 μl。反應條件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 7 min，共 40循環(huán)。最后用焦磷酸檢測儀(PyroMark Q96 ID，QIAGEN公司，德國)進行甲基化水平檢測[12-14]。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequence of gene

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 基因啟動子區(qū)甲基化與臨床指標的相關性

所選實驗組樣本的甲基化與臨床指標的相關性分析結果顯示，RF、IgM、IgG、CRP、ESR、ALT、AST、WBC、TJC、SJC、DAS28在HIF-1α pos1和c-Myc(pos 2、3、4、5、6)位點上均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；Age在c-Myc(pos 4、6)位點上具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，Sex在c-Myc(pos 3、4)位點上具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，HB在c-Myc(pos 2、4、6)位點上具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)(表2)。

表2 DNA甲基化與臨床指標的相關性Table 2 Correlation analysis of DNA methylation and clinical data

2.2 基因啟動子區(qū)甲基化水平比較

RA組與健康對照組HIF-1α pos 1和c-Myc(pos 2、3、4、5、6)甲基化水平比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，經過Bonferroni校正后，c-Myc(5、6)甲基化水平兩組間差異仍具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其他位點甲基化水平兩組比較差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05) (表3)。

2.3 ROC曲線分析

受試者工作特征曲線(ROC曲線)顯示c-Myc(pos 5、6)的甲基化水平對診斷類風濕關節(jié)炎的準確性較低[ROC曲線下面積(AUC)：0.5～ 0.7，P<0.05]。當c-Myc pos 5的甲基化率≤9.48 時，靈敏性(SE)和特異性(SP)值最大(SE為0.69，SP為0.67)(表4)。

3 討論

RA是難治性疾病，具體病因及發(fā)病機制目前尚不清楚。有文獻報道基因突變與RA發(fā)病具有相關性，如TNFα[15]、IL-1[16]、IL-10[17]等。近來有研究發(fā)現(xiàn)RA患者基因組存在廣泛低甲基化[17]，提示DNA甲基化可能參與了RA疾病的發(fā)生及發(fā)展。本研究RA患者組與健康對照組的c-Myc(pos 5、6)甲基化水平比較差異具有統(tǒng)計學意義(經過Bonferroni校正)，RA組c-Myc(pos 5、6)位點處于低甲基化水平，進一步證實RA患者基因組存在低甲基化，與徐曉等[18]結果相符。

近來研究發(fā)現(xiàn)，促炎性Th17細胞與抗炎性Treg細胞平衡紊亂導致了RA活動性的加劇[19]，提示Th17細胞和Treg細胞在調控RA發(fā)病中有著重要作用[20-21]，糖代謝與Th17/Treg細胞分化有著非常密切的聯(lián)系。本研究結果顯示，c-Myc(pos5、6)位點處于低甲基化水平，筆者猜想c-Myc的低甲基化促進了基因的高表達，從而促進了糖酵解途徑，進而導致Th17/Treg細胞的比例失衡，并且平衡向Th17細胞一方偏移，最終加重了RA患者的炎癥反應，這與從機制上的猜想結果一致，可以解釋RA的發(fā)病機制。

RA并發(fā)貧血在臨床上比較常見，慢性病性貧血(anemia of chronic disease,ACD)是RA最常見的貧血原因，其發(fā)病機制尚未完全明確，有研究認為，TNF-α、IL-1、hepcidin等炎性細胞因子在各種原因引起的慢性貧血中占有重要地位[22-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，HB在c-Myc(pos 2、4、6)位點上與甲基化率均呈正相關，且均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，筆者根據(jù)實驗結果從機制上推測，c-Myc低甲基化促進了c-Myc基因的高表達，從而促進了糖酵解途徑，進而導致Th17/Treg細胞的比例失衡，最終加重了RA患者的炎癥反應，可能也參與了ACD的發(fā)病過程。

表3 基因啟動子區(qū)甲基化水平比較Table 3 Comparison of methylation levels of genes in RA and healthy controls (%)

表4 ROC曲線分析Table 4 ROC curve analysis of gene sites

ROC曲線被用來評估各個試驗在疾病診斷中的能力，并且選擇出最佳的診斷界限值，AUC通常是ROC曲線中一個重要評價標準[26-27]。本研究c-Myc(pos 5、6)ROC曲線分析顯示：所有AUC均在0.5～0.7之間,提示將上述甲基化位點作為RA的診斷指標具有較低的準確性。

綜上所述，c-Myc(pos 5、6)基因在RA中處于低甲基化水平，結合基因功能分析，c-Myc(pos 5、6)低甲基化水平可能增加RA的發(fā)病風險，c-Myc(pos 2、4、6)可能通過調控Th17/Treg平衡參與RA伴ACD的發(fā)病過程。

本研究不足之處：首先，本研究對全血細胞進行研究，并未在患者外周血單個核細胞(peripheral blood monouclear cells, PBMC)的CD4+T細胞進一步驗證，具有一定的局限性；其次，DNA甲基化會抑制基因的表達，調控mRNA的表達，本研究只在DNA水平進行了差異性比較，并未對c-Myc、mTOR、HIF-1α基因的表達水平進行驗證，在今后研究中，筆者將繼續(xù)從細胞分子學、組織學等進一步驗證，以支持相關結論，減少結果的偏倚。