神經(jīng)節(jié)苷脂GD3合酶缺失加重DSS誘導(dǎo)的小鼠炎癥性腸?、?/h1>
2019-01-17 06:00:14閆風(fēng)連董冠軍張俊鳳寧召臣李春霞朱玉貞姚瀟穎李學(xué)慧王玉忠司傳平熊化保
中國(guó)免疫學(xué)雜志 2019年1期
閆風(fēng)連 董冠軍 張 惠 張俊鳳 史 慧 寧召臣 李春霞 朱玉貞 姚瀟穎 李學(xué)慧 王玉忠 司傳平 熊化保
(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與分子醫(yī)學(xué)研究所，濟(jì)寧272067)
炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一種慢性易復(fù)發(fā)的胃腸紊亂疾病，由兩種主要亞型組成：潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn′s disease，CD)[1]。UC主要影響結(jié)腸，其特征是在黏膜以及黏膜下層產(chǎn)生炎癥。 CD是一種透壁性的炎癥，對(duì)從口腔到肛門的整個(gè)消化道都可能產(chǎn)生影響[1]。IBD最初主要在北美和歐洲一些發(fā)達(dá)國(guó)家高發(fā)，最近一些年在亞洲其發(fā)病率也持續(xù)增高[2,3]。目前普遍認(rèn)為IBD的發(fā)生與環(huán)境、遺傳、腸道微生物以及免疫等多方面因素的相互作用密切相關(guān)[2,4,5]。但其具體的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。
神經(jīng)節(jié)苷脂是一類非常重要的含有唾液酸的鞘糖脂，廣泛分布于細(xì)胞的外表面，在腦組織中含量豐富[6]。GD2和GD3分別是含有兩個(gè)糖基和三個(gè)糖基的雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，在正常人的組織中不表達(dá)，或者低水平表達(dá)，一般只有在病態(tài)下才高水平表達(dá)，例如癌癥以及神經(jīng)退行性疾病等[6]。GD3和GD2在腫瘤的增殖、遷移、侵襲、黏附、血管生成以及腫瘤的免疫抑制中發(fā)揮著重要作用[6]。GD3合酶(GD3 synthase，GD3S)是一種調(diào)控GD3和GD2合成的酶，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及神經(jīng)退行性疾病中具有重要作用[6,7]。目前以GD3合酶為藥物靶點(diǎn)開發(fā)治療腫瘤新藥具有廣闊前景。有研究表明，具有炎癥的腸黏膜中GD3的含量比正常腸黏膜要低，而且通過(guò)飲食在結(jié)腸細(xì)胞中增加神經(jīng)節(jié)苷脂的含量可以降低促炎細(xì)胞因子信號(hào)通路[8]，在培養(yǎng)的嬰兒結(jié)腸中可以阻止低氧誘導(dǎo)的腸壞死以及細(xì)胞損傷[9]。但是具體的有關(guān)GD3合酶是否直接參與IBD還鮮有報(bào)道。因此本研究選擇利用經(jīng)典小鼠IBD模型以及GD3合酶缺陷小鼠來(lái)探索GD3合酶是否參與IBD以及在其中的作用。
1 材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 C57BL/6小鼠購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司；神經(jīng)節(jié)苷脂GD3合酶缺失小鼠(GD3S-/-)由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院王玉忠副主任提供，繁殖并飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物房。DSS購(gòu)自MP Biomedicals公司；IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BioLegend公司；結(jié)腸組織病理切片由濟(jì)南金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司制備；RIPA強(qiáng)裂解液、BCA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche公司。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自BIOTEK公司；倒置熒光顯微鏡Ti-E購(gòu)自日本NIKON公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)Multifuge×1R購(gòu)自ThermoFisher公司。
1.2方法
1.2.1小鼠IBD模型死亡率檢測(cè) 于濟(jì)南朋悅購(gòu)買6周雄性C57BL/6小鼠，在本實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)1周，GD3S-/-小鼠繁殖并飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物房，飼養(yǎng)至7周，與C57BL/6小鼠同時(shí)開始建立DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD模型。實(shí)驗(yàn)分為兩組：C57BL/6 DSS模型組(WT DSS組)以及GD3S-/-DSS模型組(GD3S-/-DSS組)，各8只小鼠。兩組小鼠均給予2.5%的DSS飲水，每天記錄小鼠死亡數(shù)量，并繪制小鼠生存率曲線。
1.2.2小鼠IBD模型分組與樣品采集 實(shí)驗(yàn)分為4組：C57BL/6對(duì)照組(WT組)、C57BL/6 DSS模型組(WT DSS組)、GD3S-/-對(duì)照組(GD3S-/-組)、GD3S-/-DSS模型組(GD3S-/-DSS組)。DSS模型組給予2.5%DSS飲水7 d、對(duì)照組給予正常飲水7 d，期間每天記錄小鼠體重變化以及便血情況。7 d 后眼球取血，4 500 r/min離心10 min收集小鼠血清。解剖分離小鼠全結(jié)腸，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度。將結(jié)腸內(nèi)容物用醫(yī)用棉簽處理干凈后備用。
1.2.3腸蛋白的提取及濃度測(cè)定 取結(jié)腸近肛門端2 cm結(jié)腸，加入1 ml RIPA強(qiáng)裂解液，用勻漿器進(jìn)行勻漿，然后4℃靜置裂解2 h，每15 min上下顛倒混勻，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清。嚴(yán)格按照碧云天生物技術(shù)有限公司BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書中操作步驟，檢測(cè)各樣品的蛋白濃度。
1.2.4腸勻漿上清以及血清中IL-6蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 包被：加入100 μl稀釋好的 IL-6的包被抗體，在2～8℃包被過(guò)夜；封閉：用配好的清洗液洗板4次，加入200 μl assay diluent 在微孔板振蕩器上室溫孵育1 h；加樣：洗板4次，加入100 μl稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品以及樣品，在微孔板振蕩器上室溫孵育2 h；加檢測(cè)抗體：洗板4次，加入100 μl稀釋好的檢測(cè)抗體，在微孔板振蕩器上室溫孵育1 h；加酶：洗板4次，加入100 μl稀釋好的Avidin-HRP，在微孔板振蕩器上室溫孵育30 min；顯色：加入清洗液微孔板振蕩器上振蕩1 min后棄去孔內(nèi)液體，清洗5次，加入100 μl TMB，室溫避光孵育 15～30 min，根據(jù)孔內(nèi)顏色的深淺(深藍(lán)色)來(lái)判定；終止反應(yīng)：迅速加入100 μl 終止液終止反應(yīng)；讀板：終止后15 min內(nèi)，用檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm 讀值。
1.2.5TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 結(jié)腸組織石蠟包埋切片，65～70℃脫蠟2 h；將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗2次，每次10 min；用無(wú)水乙醇洗2次，每次5 min。用95%、90%、85%、80%、75%乙醇各洗1次，每次3 min；用PBS于脫色搖床上洗2次，每次5 min；加入200 μg/ml蛋白酶K工作液于20～37℃水解 30 min，去除組織蛋白；用PBS于脫色搖床上洗3次，每次5 min；滴加試劑盒內(nèi)的TUNEL檢測(cè)液；將切片放于濕盒內(nèi)37℃避光孵育1 h；用PBS于脫色搖床上避光清洗3次，每次5 min；擦凈玻片，滴加防淬滅劑；封片。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad prism 6軟件分析處理，兩組之間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1GD3S缺失導(dǎo)致IBD模型小鼠生存率降低 與WT小鼠相比，GD3S-/-小鼠在給予2.5%DSS飲水第12天時(shí)全部死亡，而WT小鼠在建模16 d后仍有一半小鼠存活，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示其生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)，說(shuō)明神經(jīng)節(jié)苷脂GD3或GD2在DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠中具有一定的保護(hù)作用。
2.2GD3S缺失加重IBD模型小鼠的炎癥表型 DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠模型的典型特征是在飲用2%～5% DSS 5～7 d后出現(xiàn)便血、體重減輕，結(jié)腸長(zhǎng)度變短的現(xiàn)象[10]。因此分別給予WT小鼠以及GD3S-/-小鼠2.5%DSS飲水7 d，期間每天記錄小鼠體重變化以及便血情況，并檢測(cè)7 d后其結(jié)腸長(zhǎng)度。結(jié)果顯示GD3S-/-小鼠在第5天時(shí)出現(xiàn)血便，而WT小鼠明顯晚于GD3S-/-小鼠。且與WT小鼠相比，GD3S-/-小鼠其體重下降更快，在第4天時(shí)與對(duì)照組相比即有極顯著差異(P<0.01，圖2A)。GD3S-/-小鼠其結(jié)腸長(zhǎng)度也顯著短于野生型小鼠(P<0.01，圖2B、C)。
2.3GD3S缺失加重IBD模型小鼠結(jié)腸黏膜的損傷 DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠在建模6～10 d時(shí)結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)會(huì)出現(xiàn)明顯潰瘍，表現(xiàn)為緊密排列的單層管狀細(xì)胞、隱窩層和扁平上皮層，逐漸出現(xiàn)肌層變厚，隱窩被中性粒細(xì)胞滲透，出現(xiàn)上皮層細(xì)胞大量死亡，隱窩結(jié)構(gòu)消失且伴隨大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)[11]。通過(guò)HE染色以及TUNEL法分別觀察WT小鼠以及GD3S-/-小鼠結(jié)腸黏膜損傷以及細(xì)胞死亡情況。HE染色結(jié)果顯示GD3S-/-小鼠已無(wú)緊密排列的單層管狀細(xì)胞，而且炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更為嚴(yán)重。TUNEL結(jié)果顯示GD3S-/-小鼠凋亡細(xì)胞明顯增多。
圖1 神經(jīng)節(jié)苷脂GD3合酶缺失降低IBD模型小鼠生存率Fig.1 Ganglioside GD3 Synthase deficiency decreased survival rate of IBD mouseNote: Kaplan-Meier method was used to estimate overall survival and the survival rates were determined by Log-rank test.Compared to WT DSS group，*.P<0.05.
2.4GD3S缺失使IBD模型小鼠炎性因子的分泌增加 DSS誘導(dǎo)的IBD的發(fā)生發(fā)展伴隨著大量炎性因子的釋放，結(jié)腸組織中炎性因子的表達(dá)水平也能反映結(jié)腸炎癥的狀態(tài)。檢測(cè)了WT小鼠以及GD3S-/-小鼠血清和結(jié)腸組織勻漿中IL-6的表達(dá)，結(jié)果顯示GD3S-/-小鼠血清以及結(jié)腸組織勻漿中IL-6的表達(dá)明顯升高，與WT組相比具有極顯著差異(P<0.01，圖4A、B)。
圖2 GD3S缺失加重IBD模型小鼠的炎癥表型Fig.2 Ganglioside GD3 Synthase deficiency aggravated dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitisNote: A.Loss of basal body weight of WT and GD3S-/-mice;B.Colon length of WT and GD3S-/-mice;C.The statistical result of Colon length.Compared to WT DSS group，**.P<0.01.
圖3 GD3S缺失加重IBD模型小鼠結(jié)腸黏膜的損傷(HE，TUNEL,×200)Fig.3 Ganglioside GD3 Synthase deficiency increased pathological damage of colonic mucosa in inflammatory bowel disease(HE，TUNEL,×200)Note: HE (above) and TUNEL(below) methods were used to detect the pathological damage of colonic mucosa.
圖4 GD3S缺失使IBD模型小鼠炎性因子的分泌增加Fig.4 Increased inflammatory cytokine production of Ganglioside GD3 Synthase deficiency mice in inflammatory bowel diseaseNote: A.Cytokine level in blood serum of WT and GD3S-/-mice；B.Cytokine level in colonic homogenate of WT and GD3S-/-mice.Compare to WT DSS group，**.P<0.01.
3 討論
IBD是一種由環(huán)境、基因、免疫等多種因素相互作用導(dǎo)致的疾病。IBD患者會(huì)有規(guī)律地出現(xiàn)慢性炎癥、過(guò)度活化的免疫應(yīng)答、腸結(jié)構(gòu)損傷、滲透性改變等癥狀，對(duì)于患者的生活質(zhì)量具有很大的影響。目前主要通過(guò)類固醇類、免疫抑制劑類或抗生素等一些昂貴的藥物來(lái)控制該疾病，嚴(yán)重者需要進(jìn)行手術(shù)去除病變的結(jié)腸，但是這些手段均不能使該疾病完全治愈[12]。因此目前急需一種新的治療方式來(lái)解決這一問(wèn)題。神經(jīng)節(jié)苷脂對(duì)于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性具有重要作用，是小腸紋狀緣細(xì)胞以及結(jié)腸頂端表面細(xì)胞的組成成分，可以影響到多種細(xì)胞進(jìn)程，包括微生物附著、細(xì)胞分裂、分化以及信號(hào)通路[13]。有研究表示神經(jīng)節(jié)苷脂在腸黏膜中的新陳代謝可能是IBD發(fā)病的基礎(chǔ)[14]。在腸黏膜中神經(jīng)節(jié)苷脂含量較低，往往會(huì)伴隨著炎癥標(biāo)志分子表達(dá)增加、容易感染致病菌、腸完整性被破壞等[13]。GD3、GD2作為神經(jīng)節(jié)苷脂中的重要一員，目前其研究主要集中于對(duì)各種腫瘤以及神經(jīng)退行性疾病的影響[6]，在IBD中的作用還很少有報(bào)道，有報(bào)道指出IBD患者腸黏膜中GD3含量降低[14]，但是具體GD3是否參與IBD的發(fā)生發(fā)展，還是IBD導(dǎo)致GD3含量的降低目前均還不清楚。GD3S是唯一的調(diào)控GD3和GD2合成的酶，已被認(rèn)為是癌癥治療藥物新的靶點(diǎn)[6]，因此通過(guò)研究GD3S在IBD中的作用，可以為GD3、GD2是否參與IBD提供直接依據(jù)，也為IBD的治療提供新的研究方向以及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
我們利用GD3S缺失小鼠，誘導(dǎo)IBD模型，發(fā)現(xiàn)GD3S-/-DSS模型組與WT DSS組相比，其生存率顯著降低，體重下降明顯加快，血便早于WT DSS組；結(jié)腸長(zhǎng)度也顯著短于WT DSS組；HE染色顯示GD3S-/-DSS模型組結(jié)腸黏膜組織損傷較重，TUNEL染色顯示GD3S-/-DSS模型組凋亡細(xì)胞顯著增加；GD3S-/-DSS模型組血清以及結(jié)腸黏膜組織勻漿IL-6表達(dá)明顯高于WT DSS。說(shuō)明GD3S缺失會(huì)加重DSS誘導(dǎo)的IBD，GD3、GD2在IBD的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。但是GD3、GD2參與IBD的具體機(jī)制還未有報(bào)道，仍需進(jìn)一步的研究。
目前已知的GD3可能參與IBD的機(jī)制包括以下幾方面：①通過(guò)間接影響整合素進(jìn)而影響免疫細(xì)胞向腸道的募集。趨化因子受體9可以使免疫細(xì)胞募集于腸道，但趨化因子9受體陽(yáng)性免疫細(xì)胞主要分布在小腸，而整合素α4β7陽(yáng)性的免疫細(xì)胞傾向于募集在小腸以及結(jié)腸[13]，GD3可以和β1整合素聚集影響整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路[15]，這就提示GD3有可能通過(guò)影響整合素進(jìn)而影響免疫細(xì)胞向腸道的募集。②影響NF-κB信號(hào)通路。CARD15[Nucleotideoligomerization domain-containing protein 2 (NOD2)]被認(rèn)為是CD的一種遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子，CARD15 缺陷會(huì)導(dǎo)致NF-κB 持續(xù)激活，引發(fā)慢性炎癥以及腸黏膜損傷[13]。GD3可以抑制有絲分裂原激活的T細(xì)胞中NF-κB 的激活[16]。NF-κB 的激活會(huì)促進(jìn)環(huán)氧酶(Cyclooxygenase，COX) 以及脂氧合酶(Lipoxygenase，LOX)增加，促進(jìn)花生四烯酸向促炎介質(zhì)白三烯B4以及前列腺素E2的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)炎癥。說(shuō)明GD3有可能通過(guò)NF-κB信號(hào)通路影響IBD。③影響腸黏膜通透性以及完整性。 腸黏膜的通透性是由緊密接頭蛋白介導(dǎo)的，它主要位于脂筏上[17]。在腸黏膜中GD3含量低會(huì)導(dǎo)致緊密接頭蛋白的降解，增加腸黏膜中GD3含量可以減少接頭蛋白的降解從而減少腸黏膜滲透性、改善腸結(jié)構(gòu)的完整性[14]。這些都為后續(xù)研究提供了一定的方向。
綜上所述，GD3S缺失會(huì)加重DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病，為GD3、GD2在炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，雖然其具體機(jī)制仍然需要進(jìn)一步深入研究，但是也為IBD的治療提供了新的方向。
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神經(jīng)節(jié)苷脂是一類非常重要的含有唾液酸的鞘糖脂，廣泛分布于細(xì)胞的外表面，在腦組織中含量豐富[6]。GD2和GD3分別是含有兩個(gè)糖基和三個(gè)糖基的雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，在正常人的組織中不表達(dá)，或者低水平表達(dá)，一般只有在病態(tài)下才高水平表達(dá)，例如癌癥以及神經(jīng)退行性疾病等[6]。GD3和GD2在腫瘤的增殖、遷移、侵襲、黏附、血管生成以及腫瘤的免疫抑制中發(fā)揮著重要作用[6]。GD3合酶(GD3 synthase，GD3S)是一種調(diào)控GD3和GD2合成的酶，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及神經(jīng)退行性疾病中具有重要作用[6,7]。目前以GD3合酶為藥物靶點(diǎn)開發(fā)治療腫瘤新藥具有廣闊前景。有研究表明，具有炎癥的腸黏膜中GD3的含量比正常腸黏膜要低，而且通過(guò)飲食在結(jié)腸細(xì)胞中增加神經(jīng)節(jié)苷脂的含量可以降低促炎細(xì)胞因子信號(hào)通路[8]，在培養(yǎng)的嬰兒結(jié)腸中可以阻止低氧誘導(dǎo)的腸壞死以及細(xì)胞損傷[9]。但是具體的有關(guān)GD3合酶是否直接參與IBD還鮮有報(bào)道。因此本研究選擇利用經(jīng)典小鼠IBD模型以及GD3合酶缺陷小鼠來(lái)探索GD3合酶是否參與IBD以及在其中的作用。
1 材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 C57BL/6小鼠購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司；神經(jīng)節(jié)苷脂GD3合酶缺失小鼠(GD3S-/-)由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院王玉忠副主任提供，繁殖并飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物房。DSS購(gòu)自MP Biomedicals公司；IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BioLegend公司；結(jié)腸組織病理切片由濟(jì)南金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司制備；RIPA強(qiáng)裂解液、BCA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche公司。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自BIOTEK公司；倒置熒光顯微鏡Ti-E購(gòu)自日本NIKON公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)Multifuge×1R購(gòu)自ThermoFisher公司。
1.2方法
1.2.1小鼠IBD模型死亡率檢測(cè) 于濟(jì)南朋悅購(gòu)買6周雄性C57BL/6小鼠，在本實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)1周，GD3S-/-小鼠繁殖并飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物房，飼養(yǎng)至7周，與C57BL/6小鼠同時(shí)開始建立DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD模型。實(shí)驗(yàn)分為兩組：C57BL/6 DSS模型組(WT DSS組)以及GD3S-/-DSS模型組(GD3S-/-DSS組)，各8只小鼠。兩組小鼠均給予2.5%的DSS飲水，每天記錄小鼠死亡數(shù)量，并繪制小鼠生存率曲線。
1.2.2小鼠IBD模型分組與樣品采集 實(shí)驗(yàn)分為4組：C57BL/6對(duì)照組(WT組)、C57BL/6 DSS模型組(WT DSS組)、GD3S-/-對(duì)照組(GD3S-/-組)、GD3S-/-DSS模型組(GD3S-/-DSS組)。DSS模型組給予2.5%DSS飲水7 d、對(duì)照組給予正常飲水7 d，期間每天記錄小鼠體重變化以及便血情況。7 d 后眼球取血，4 500 r/min離心10 min收集小鼠血清。解剖分離小鼠全結(jié)腸，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度。將結(jié)腸內(nèi)容物用醫(yī)用棉簽處理干凈后備用。
1.2.3腸蛋白的提取及濃度測(cè)定 取結(jié)腸近肛門端2 cm結(jié)腸，加入1 ml RIPA強(qiáng)裂解液，用勻漿器進(jìn)行勻漿，然后4℃靜置裂解2 h，每15 min上下顛倒混勻，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清。嚴(yán)格按照碧云天生物技術(shù)有限公司BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書中操作步驟，檢測(cè)各樣品的蛋白濃度。
1.2.4腸勻漿上清以及血清中IL-6蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 包被：加入100 μl稀釋好的 IL-6的包被抗體，在2～8℃包被過(guò)夜；封閉：用配好的清洗液洗板4次，加入200 μl assay diluent 在微孔板振蕩器上室溫孵育1 h；加樣：洗板4次，加入100 μl稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品以及樣品，在微孔板振蕩器上室溫孵育2 h；加檢測(cè)抗體：洗板4次，加入100 μl稀釋好的檢測(cè)抗體，在微孔板振蕩器上室溫孵育1 h；加酶：洗板4次，加入100 μl稀釋好的Avidin-HRP，在微孔板振蕩器上室溫孵育30 min；顯色：加入清洗液微孔板振蕩器上振蕩1 min后棄去孔內(nèi)液體，清洗5次，加入100 μl TMB，室溫避光孵育 15～30 min，根據(jù)孔內(nèi)顏色的深淺(深藍(lán)色)來(lái)判定；終止反應(yīng)：迅速加入100 μl 終止液終止反應(yīng)；讀板：終止后15 min內(nèi)，用檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm 讀值。
1.2.5TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 結(jié)腸組織石蠟包埋切片，65～70℃脫蠟2 h；將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗2次，每次10 min；用無(wú)水乙醇洗2次，每次5 min。用95%、90%、85%、80%、75%乙醇各洗1次，每次3 min；用PBS于脫色搖床上洗2次，每次5 min；加入200 μg/ml蛋白酶K工作液于20～37℃水解 30 min，去除組織蛋白；用PBS于脫色搖床上洗3次，每次5 min；滴加試劑盒內(nèi)的TUNEL檢測(cè)液；將切片放于濕盒內(nèi)37℃避光孵育1 h；用PBS于脫色搖床上避光清洗3次，每次5 min；擦凈玻片，滴加防淬滅劑；封片。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad prism 6軟件分析處理，兩組之間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1GD3S缺失導(dǎo)致IBD模型小鼠生存率降低 與WT小鼠相比，GD3S-/-小鼠在給予2.5%DSS飲水第12天時(shí)全部死亡，而WT小鼠在建模16 d后仍有一半小鼠存活，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示其生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)，說(shuō)明神經(jīng)節(jié)苷脂GD3或GD2在DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠中具有一定的保護(hù)作用。
2.2GD3S缺失加重IBD模型小鼠的炎癥表型 DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠模型的典型特征是在飲用2%～5% DSS 5～7 d后出現(xiàn)便血、體重減輕，結(jié)腸長(zhǎng)度變短的現(xiàn)象[10]。因此分別給予WT小鼠以及GD3S-/-小鼠2.5%DSS飲水7 d，期間每天記錄小鼠體重變化以及便血情況，并檢測(cè)7 d后其結(jié)腸長(zhǎng)度。結(jié)果顯示GD3S-/-小鼠在第5天時(shí)出現(xiàn)血便，而WT小鼠明顯晚于GD3S-/-小鼠。且與WT小鼠相比，GD3S-/-小鼠其體重下降更快，在第4天時(shí)與對(duì)照組相比即有極顯著差異(P<0.01，圖2A)。GD3S-/-小鼠其結(jié)腸長(zhǎng)度也顯著短于野生型小鼠(P<0.01，圖2B、C)。
2.3GD3S缺失加重IBD模型小鼠結(jié)腸黏膜的損傷 DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠在建模6～10 d時(shí)結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)會(huì)出現(xiàn)明顯潰瘍，表現(xiàn)為緊密排列的單層管狀細(xì)胞、隱窩層和扁平上皮層，逐漸出現(xiàn)肌層變厚，隱窩被中性粒細(xì)胞滲透，出現(xiàn)上皮層細(xì)胞大量死亡，隱窩結(jié)構(gòu)消失且伴隨大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)[11]。通過(guò)HE染色以及TUNEL法分別觀察WT小鼠以及GD3S-/-小鼠結(jié)腸黏膜損傷以及細(xì)胞死亡情況。HE染色結(jié)果顯示GD3S-/-小鼠已無(wú)緊密排列的單層管狀細(xì)胞，而且炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更為嚴(yán)重。TUNEL結(jié)果顯示GD3S-/-小鼠凋亡細(xì)胞明顯增多。
圖1 神經(jīng)節(jié)苷脂GD3合酶缺失降低IBD模型小鼠生存率Fig.1 Ganglioside GD3 Synthase deficiency decreased survival rate of IBD mouseNote: Kaplan-Meier method was used to estimate overall survival and the survival rates were determined by Log-rank test.Compared to WT DSS group，*.P<0.05.
2.4GD3S缺失使IBD模型小鼠炎性因子的分泌增加 DSS誘導(dǎo)的IBD的發(fā)生發(fā)展伴隨著大量炎性因子的釋放，結(jié)腸組織中炎性因子的表達(dá)水平也能反映結(jié)腸炎癥的狀態(tài)。檢測(cè)了WT小鼠以及GD3S-/-小鼠血清和結(jié)腸組織勻漿中IL-6的表達(dá)，結(jié)果顯示GD3S-/-小鼠血清以及結(jié)腸組織勻漿中IL-6的表達(dá)明顯升高，與WT組相比具有極顯著差異(P<0.01，圖4A、B)。
圖2 GD3S缺失加重IBD模型小鼠的炎癥表型Fig.2 Ganglioside GD3 Synthase deficiency aggravated dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitisNote: A.Loss of basal body weight of WT and GD3S-/-mice;B.Colon length of WT and GD3S-/-mice;C.The statistical result of Colon length.Compared to WT DSS group，**.P<0.01.
圖3 GD3S缺失加重IBD模型小鼠結(jié)腸黏膜的損傷(HE，TUNEL,×200)Fig.3 Ganglioside GD3 Synthase deficiency increased pathological damage of colonic mucosa in inflammatory bowel disease(HE，TUNEL,×200)Note: HE (above) and TUNEL(below) methods were used to detect the pathological damage of colonic mucosa.
圖4 GD3S缺失使IBD模型小鼠炎性因子的分泌增加Fig.4 Increased inflammatory cytokine production of Ganglioside GD3 Synthase deficiency mice in inflammatory bowel diseaseNote: A.Cytokine level in blood serum of WT and GD3S-/-mice；B.Cytokine level in colonic homogenate of WT and GD3S-/-mice.Compare to WT DSS group，**.P<0.01.
3 討論
IBD是一種由環(huán)境、基因、免疫等多種因素相互作用導(dǎo)致的疾病。IBD患者會(huì)有規(guī)律地出現(xiàn)慢性炎癥、過(guò)度活化的免疫應(yīng)答、腸結(jié)構(gòu)損傷、滲透性改變等癥狀，對(duì)于患者的生活質(zhì)量具有很大的影響。目前主要通過(guò)類固醇類、免疫抑制劑類或抗生素等一些昂貴的藥物來(lái)控制該疾病，嚴(yán)重者需要進(jìn)行手術(shù)去除病變的結(jié)腸，但是這些手段均不能使該疾病完全治愈[12]。因此目前急需一種新的治療方式來(lái)解決這一問(wèn)題。神經(jīng)節(jié)苷脂對(duì)于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性具有重要作用，是小腸紋狀緣細(xì)胞以及結(jié)腸頂端表面細(xì)胞的組成成分，可以影響到多種細(xì)胞進(jìn)程，包括微生物附著、細(xì)胞分裂、分化以及信號(hào)通路[13]。有研究表示神經(jīng)節(jié)苷脂在腸黏膜中的新陳代謝可能是IBD發(fā)病的基礎(chǔ)[14]。在腸黏膜中神經(jīng)節(jié)苷脂含量較低，往往會(huì)伴隨著炎癥標(biāo)志分子表達(dá)增加、容易感染致病菌、腸完整性被破壞等[13]。GD3、GD2作為神經(jīng)節(jié)苷脂中的重要一員，目前其研究主要集中于對(duì)各種腫瘤以及神經(jīng)退行性疾病的影響[6]，在IBD中的作用還很少有報(bào)道，有報(bào)道指出IBD患者腸黏膜中GD3含量降低[14]，但是具體GD3是否參與IBD的發(fā)生發(fā)展，還是IBD導(dǎo)致GD3含量的降低目前均還不清楚。GD3S是唯一的調(diào)控GD3和GD2合成的酶，已被認(rèn)為是癌癥治療藥物新的靶點(diǎn)[6]，因此通過(guò)研究GD3S在IBD中的作用，可以為GD3、GD2是否參與IBD提供直接依據(jù)，也為IBD的治療提供新的研究方向以及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
我們利用GD3S缺失小鼠，誘導(dǎo)IBD模型，發(fā)現(xiàn)GD3S-/-DSS模型組與WT DSS組相比，其生存率顯著降低，體重下降明顯加快，血便早于WT DSS組；結(jié)腸長(zhǎng)度也顯著短于WT DSS組；HE染色顯示GD3S-/-DSS模型組結(jié)腸黏膜組織損傷較重，TUNEL染色顯示GD3S-/-DSS模型組凋亡細(xì)胞顯著增加；GD3S-/-DSS模型組血清以及結(jié)腸黏膜組織勻漿IL-6表達(dá)明顯高于WT DSS。說(shuō)明GD3S缺失會(huì)加重DSS誘導(dǎo)的IBD，GD3、GD2在IBD的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。但是GD3、GD2參與IBD的具體機(jī)制還未有報(bào)道，仍需進(jìn)一步的研究。
目前已知的GD3可能參與IBD的機(jī)制包括以下幾方面：①通過(guò)間接影響整合素進(jìn)而影響免疫細(xì)胞向腸道的募集。趨化因子受體9可以使免疫細(xì)胞募集于腸道，但趨化因子9受體陽(yáng)性免疫細(xì)胞主要分布在小腸，而整合素α4β7陽(yáng)性的免疫細(xì)胞傾向于募集在小腸以及結(jié)腸[13]，GD3可以和β1整合素聚集影響整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路[15]，這就提示GD3有可能通過(guò)影響整合素進(jìn)而影響免疫細(xì)胞向腸道的募集。②影響NF-κB信號(hào)通路。CARD15[Nucleotideoligomerization domain-containing protein 2 (NOD2)]被認(rèn)為是CD的一種遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子，CARD15 缺陷會(huì)導(dǎo)致NF-κB 持續(xù)激活，引發(fā)慢性炎癥以及腸黏膜損傷[13]。GD3可以抑制有絲分裂原激活的T細(xì)胞中NF-κB 的激活[16]。NF-κB 的激活會(huì)促進(jìn)環(huán)氧酶(Cyclooxygenase，COX) 以及脂氧合酶(Lipoxygenase，LOX)增加，促進(jìn)花生四烯酸向促炎介質(zhì)白三烯B4以及前列腺素E2的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)炎癥。說(shuō)明GD3有可能通過(guò)NF-κB信號(hào)通路影響IBD。③影響腸黏膜通透性以及完整性。 腸黏膜的通透性是由緊密接頭蛋白介導(dǎo)的，它主要位于脂筏上[17]。在腸黏膜中GD3含量低會(huì)導(dǎo)致緊密接頭蛋白的降解，增加腸黏膜中GD3含量可以減少接頭蛋白的降解從而減少腸黏膜滲透性、改善腸結(jié)構(gòu)的完整性[14]。這些都為后續(xù)研究提供了一定的方向。
綜上所述，GD3S缺失會(huì)加重DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病，為GD3、GD2在炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，雖然其具體機(jī)制仍然需要進(jìn)一步深入研究，但是也為IBD的治療提供了新的方向。
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