OPN-siRNA對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠的治療作用①

王 慧 楊國(guó)安 駱康凱 竇晶莉 王永福

(包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，包頭醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫研究所,包頭014010)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性全身性自身免疫性疾病。以侵犯關(guān)節(jié)為主，引起關(guān)節(jié)滑膜炎、軟骨和骨的破壞，最后導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、功能障礙，甚至殘疾，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。另外此病可出現(xiàn)系統(tǒng)受累，最終危及生命。骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)也稱為分泌磷蛋白1(SPP1)或早期T淋巴細(xì)胞活化因子1(Tta1)，是一種糖基化的磷酸蛋白，在多種組織和細(xì)胞合成，并分泌到體液。最初OPN被鑒定為骨基質(zhì)蛋白，隨后被確定為多種細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，如骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞等。研究表明，OPN在RA滑膜襯里層、襯里下層、軟骨表面及侵蝕的滑膜中過表達(dá)[1]。RA患者關(guān)節(jié)局部產(chǎn)生的OPN也是升高的[2]。免疫組化法發(fā)現(xiàn)了高水平的OPN，尤以RA滑膜襯里細(xì)胞為著。RA患者滑膜CD4+T細(xì)胞OPN mRNA表達(dá)水平顯著升高，與滑液中OPN濃度升高相關(guān)[3]。OPN過表達(dá)僅限于RA滑膜，與滑膜T細(xì)胞選擇性O(shè)PN受體共表達(dá)相關(guān)，包括整合素αV、β1 及 CD443。關(guān)節(jié)炎復(fù)發(fā)期血清OPN水平顯著升高，而在進(jìn)展期血清中持續(xù)出現(xiàn)更高水平OPN[4]。因此，OPN在RA發(fā)病過程中可能起著至關(guān)重要的作用。

siRNA是一種特定基因沉默技術(shù)，廣泛用于腫瘤、自身免疫性疾病和肝炎等疾病的治療[5-7]，而且小鼠體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，口服siRNA制劑對(duì)小鼠不會(huì)造成任何的不良反應(yīng)[8]。因此，本研究采用siRNA技術(shù)沉默CIA小鼠中OPN基因的表達(dá)，探討OPN基因的siRNA對(duì)CIA小鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 載體pGFP-V-RS 購(gòu)自美國(guó)Origene公司，AxyPrep質(zhì)粒DNA大量抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司，TRIzol購(gòu)自日本TaKaRa公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invotrigen公司。

1.2方法

1.2.1siRNA的設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)針對(duì)OPN基因的cDNA序列設(shè)計(jì)2段siRNA。第1段序列為：5′-CCAAGTCTGGAAACACACA-3′，第2段序列為：5′-GTTCCAAAGCCAGCCTGGA′-3。將上述序列的模板插入質(zhì)粒載體pGFP-V-RS中，構(gòu)建其真核表達(dá)載體。

1.2.2CIA模型小鼠的建立 4～6周齡DBAⅠ雌性小鼠30只，購(gòu)自南京大學(xué)動(dòng)物模式研究所。隨機(jī)抽取3只小鼠為空白組；其余的小鼠用于CIA模型的建立，每只小鼠尾根部皮內(nèi)注射100 μlⅡ型膠原和完全弗氏佐劑乳化液。第21天尾根部皮內(nèi)注射同等劑量Ⅱ型膠原和不完全弗氏佐劑乳化液。

1.2.3實(shí)驗(yàn)小鼠分組及給藥 27只用于造模的小鼠，出模15只，分別分配到模型組、空載體組及OPN-siRNA1和OPN-siRNA2,每組3只，余3只不夠分組未用于實(shí)驗(yàn)，即本實(shí)驗(yàn)共分為5組，分別為空白組、模型組、空載體組、OPN-siRNA1組和OPN-siRNA2組，每組3只小鼠。將構(gòu)建好的OPN siRNA 60 μg和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000的混合物200 μl[DNA(μg)：LipofectamineTM2000(μl)為1∶2]分別自尾靜脈注射CIA小鼠，對(duì)照組CIA小鼠注射等劑量、等比例的磷酸鹽緩沖液(PBS)和LipofectamineTM2000的混合物。每周注射1次，每次注射100 μl，共注射8次。

1.2.4指標(biāo)的檢測(cè)及組織病理學(xué) 注射后28 d處死所有組別CIA小鼠，心臟取血，分離血清，在-80℃下保存，檢測(cè)血清IL-17、IL-10及IFN-γ水平；取小鼠肺組織，TRIzol提RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠肺臟中OPN mRNA的表達(dá)水平，根據(jù)ct值計(jì)算2-ΔΔct。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，OPN上游引物：5′-CACTCCAATCG-TCCCTAC-3′，下游引物：5′-AGACTCACCGCTC-TTCAT-3′，擴(kuò)增的產(chǎn)物長(zhǎng)度為157 bp，內(nèi)參β-actin上游引物：5′-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′，下游引物：5′-ATGTCACGCACGATTTCC-3′，擴(kuò)增的產(chǎn)物長(zhǎng)度為218 bp；另外取肺組織和踝關(guān)節(jié)，4%甲醛固定，石蠟包埋，切2張片，分別作HE染色和熒光免疫組織化學(xué)染色，熒光免疫組織化學(xué)染色的圖片采用IPP6軟件分析平均A值；取小鼠脾臟，檢測(cè)脾細(xì)胞Th17及Treg水平。另外檢測(cè)注射后小鼠血清中細(xì)胞因子IL-17、IL-10、IFN-γ水平。

2 結(jié)果

2.1OPN siRNA注射后小鼠肺組織OPN mRNA的表達(dá)水平 注射后28 d處死小鼠OPN-siRNA1組和OPN-siRNA2組小鼠肺組織中OPN mRNA的表達(dá)水平明顯低于模型組和空載體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型組和空載體組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),OPN-siRNA1組和OPN-siRNA2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2OPN siRNA注射后小鼠踝關(guān)節(jié)和肺組織中OPN蛋白的表達(dá)水平 注射后28 d處死小鼠，檢測(cè)小鼠踝關(guān)節(jié)和肺組織中OPN蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：模型組和空載體組有很強(qiáng)的紅色熒光，而OPN-siRNA1組和OPN-siRNA2組的紅色熒光量明顯減弱，即OPN-siRNA1組和OPN-siRNA2組OPN的表達(dá)明顯低于模型組和空載體組，模型組和空載體組比較無明顯差異，siRNA1組和siRNA2組比較也無明顯差異。見圖1和圖2 (上述應(yīng)用的為熒光免疫組化，無需染色，放大倍數(shù)為10倍)。

2.3OPN siRNA注射后小鼠的踝關(guān)節(jié)和肺組織病理改變 光鏡下觀察踝關(guān)節(jié)的HE染色病理切片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與空載體組和模型組比較，OPN-siRNA1組和OPN-siRNA2組中的小鼠踝關(guān)節(jié)病理顯示：關(guān)節(jié)的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，關(guān)節(jié)腫脹程度減輕。見圖3。光鏡下觀察小鼠肺組織的HE染色病理切片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與模型組及空載體組比較，OPN-siRNA1組和OPN-siRNA2組肺組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，間質(zhì)性肺病改善。見圖4。

2.4OPN siRNA注射后小鼠血清中細(xì)胞因子的變化 與模型組和空載體組相比，OPN-siRNA1組和OPN-siRNA2組中IL-17的表達(dá)水平下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，模型組和空載體組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),OPN-siRNA1組和OPN-siRNA2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

Groups2-ΔΔCtModel group1.00±0.00Empty vector group1.01±0.06OPN-siRNA1 group0.32±0.761)OPN-siRNA2 group0.55±0.901)

Note：Compared with model group and empty vector group，1)P<0.05.

圖1 小鼠踝關(guān)節(jié)中OPN蛋白的表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of OPN protein in ankle from CIA mice

OPN-siRNA1組和OPN-siRNA2組IL-10的表達(dá)水平明顯高于模型組和空載體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型組低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，空載體組低于空白對(duì)照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組和空載體組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),OPN-siRNA1組和OPN-siRNA2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

OPN-siRNA1組和OPN-siRNA2組IFN-γ的表達(dá)低于模型組和空載體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型組和空載體組高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組和空載體組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),OPN-siRNA1組和OPN-siRNA2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

圖2 小鼠肺組織中OPN蛋白的表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of OPN protein in lung from CIA mice

圖3 小鼠踝關(guān)節(jié)病理改變Fig.3 Pathology of ankle joint in mice

Groups2-ΔΔCtBlank group5.68±0.77Model group5.74±1.05Empty vector group6.73±2.31OPN-siRNA1 group6.73±1.95OPN-siRNA2 group5.87±0.40

Groups2-ΔΔCtBlank group65.83±5.28Model group28.55±15.982)Empty vector group55.78±32.03OPN-siRNA1 group135.86±12.191)OPN-siRNA2 group184.21±23.401)

Note：Compared with model group and empty vector group，1)P<0.05；compared with blank group,2)P<0.05.

2.5OPN siRNA注射后小鼠脾細(xì)胞中Th17和Treg的變化 OPN siRNA作用小鼠后，脾細(xì)胞中Th17細(xì)胞的比例低于模型組和空載體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型組和空載體組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),模型組和空載體組高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，OPN-siRNA1組和OPN-siRNA2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

OPN siRNA作用小鼠后，脾細(xì)胞中Treg細(xì)胞的比例高于模型組和空載體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型組和空載體組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。OPN-siRNA1組與OPN-siRNA2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組、空載體組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表6。

Groups2-ΔΔCtBlank group4.46±0.94Model group15.52±1.902)Empty vector group13.66±3.802)OPN-siRNA1 group5.28±1.411)OPN-siRNA2 group5.54±1.551)

Note：Compared with model group and empty vector group，1)P<0.05；compared with blank group，2)P<0.05.

Groups The proportion of Th17 cellBlank group2.63±0.67Model group6.23±1.102)Empty vector group4.70±1.102)OPN-siRNA1 group2.33±0.851)OPN-siRNA2 group2.90±0.801)

Note：Compared with model group and empty vector group，1)P<0.05；compared with blank group，2)P<0.05.

GroupsThe proportion of Treg cellBlank group3.23±0.40Model group1.87±0.25Empty vector group1.40±0.22OPN-siRNA1 group7.67±1.071)OPN-siRNA2 group6.63±0.751)

Note：Compared with model group and empty vector group，1)P<0.05.

3 討論

RA是一種慢性、以侵犯關(guān)節(jié)為主要特征、原因未明的自身免疫性疾病。全世界RA的患病率是0.5%～1%，女性高于男性[9]。至今RA尚不能根治，治療的總原則是達(dá)標(biāo)治療。

OPN是RA的一種自身抗原，臨床上，抗OPN抗體可能與RA疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[10]。在DBA/1J小鼠，抗OPN單克隆抗體23C3可有效抑制CIA疾病的發(fā)展甚至逆轉(zhuǎn)病情。單克隆抗體23C3降低血清Ⅱ型膠原特異性自身抗體和炎性細(xì)胞因子的水平，并抑制T細(xì)胞針對(duì)Ⅱ型膠原的免疫應(yīng)答[11]。之前的研究結(jié)果有力地提示OPN參與RA的發(fā)展，并表明OPN siRNA、OPN表位的中和性抗體以及整合素抗體有望成為RA治療的工具。本研究針對(duì)OPN基因的cDNA序列設(shè)計(jì)2段siRNA，將上述序列的模板插入質(zhì)粒載體pGFP-V-RS中，構(gòu)建其真核表達(dá)載體。分別自尾靜脈注射CIA小鼠。肺組織OPN mRNA的表達(dá)水平明顯降低；小鼠踝關(guān)節(jié)和肺組織中OPN蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示：模型組和空載體組有很強(qiáng)的紅色熒光，而OPN-siRNA1組和OPN-siRNA2組的紅色熒光量明顯減弱。以上結(jié)果說明：OPN siRNA可抑制CIA小鼠肺臟中OPN mRNA的表達(dá)；另外可以抑制肺組織和踝關(guān)節(jié)OPN蛋白水平的表達(dá)。因此，OPN-siRNA可以抑制OPN mRNA及OPN蛋白的表達(dá)，有望成為RA治療的新武器。

OPN是一種具有多效性的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白[3]?；細(xì)胞的OPN過表達(dá)與局部炎癥相關(guān)，且OPN是RA發(fā)病過程中重要的介質(zhì)。在滑膜襯里層和軟骨浸潤(rùn)部位的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的OPN不僅可以介導(dǎo)這些細(xì)胞附著于軟骨，而且通過刺激關(guān)節(jié)軟骨膠原酶1的分泌促進(jìn)RA基質(zhì)降解[1]。本研究結(jié)果顯示：與模型組和空載體組比較，踝關(guān)節(jié)病理顯示：OPN-siRNA1組和OPN-siRNA2組關(guān)節(jié)的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，關(guān)節(jié)腫脹程度減輕。另外肺組織病理顯示炎細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，間質(zhì)性肺病改善。OPN-siRNA可以明顯抑制關(guān)節(jié)及肺組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)，從而控制疾病的進(jìn)展。RA滑液刺激T細(xì)胞OPN的表達(dá)，這是由于滑液中IL-10的出現(xiàn)及其被IL-10抗體中和所引起[3]。OPN選擇性誘導(dǎo)促炎因子和趨化因子(如IL-1和IL-8)的表達(dá)，從而促進(jìn)炎癥細(xì)胞的遷移和募集。此外，在單核細(xì)胞中OPN可以激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB[3]。OPN通過與其受體αvβ3整合素連接，可以介導(dǎo)破骨細(xì)胞參與的關(guān)節(jié)炎骨吸收過程[4]。OPN mRNA主要存在于關(guān)節(jié)破壞的骨侵蝕部位，該部位有活化的破骨細(xì)胞存在；同時(shí)骨侵蝕部位也檢測(cè)到OPN蛋白。RA滑液中內(nèi)源性O(shè)PN的產(chǎn)生是由于T細(xì)胞內(nèi)IL-17和單核細(xì)胞內(nèi)MCP-1或 MIP-1β生成增加所引起，這種作用可以被OPN抗體阻斷[12，13]。OPN對(duì)Th17分化的影響是通過一個(gè)獨(dú)立的IL-6/STAT-3通路或其他細(xì)胞因子，具體涉及OPN受體CD44和CD29及轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤核受體(Retinoic acid-related orphan receptor，ROR)。此外，OPN可以誘導(dǎo)IL17A基因啟動(dòng)子的H3乙?；饔?，主要是通過在CD4+T細(xì)胞的CD44結(jié)合域，IL17A基因位點(diǎn)與ROR的相互作用來實(shí)現(xiàn)[13]。本研究結(jié)果顯示：OPN siRNA作用小鼠后，脾細(xì)胞中Th17細(xì)胞的比例低于模型組和空載體組，而脾細(xì)胞中Treg細(xì)胞的比例較模型組和空載體組增高。OPN siRNA可以抑制致病性Th17水平；OPN siRNA治療后Treg水平升高，進(jìn)一步誘導(dǎo)免疫耐受，促進(jìn)關(guān)節(jié)炎癥的控制。另外：OPN siRNA作用后，小鼠血清中細(xì)胞因子水平發(fā)生了明顯的變化：引起促炎因子IL-17及IFN-γ下降，而抑炎因子IL-10升高。從而達(dá)到抑制關(guān)節(jié)炎癥的目的。

本研究采用siRNA技術(shù)沉默CIA小鼠中OPN基因的表達(dá)，探討OPN基因的siRNA對(duì)小鼠CIA的治療作用。結(jié)果顯示，OPN-siRNA抑制RA模型鼠體內(nèi)OPN表達(dá)及炎癥介質(zhì)的水平，因此可能成為RA治療新的潛在靶點(diǎn)，本研究樣本量較小，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行證實(shí)。