凡納濱對(duì)蝦RAS與WSSV-VP26的相互作用*

王中一 劉慶慧 黃 倢

(1.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2.水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海海洋大學(xué) 上海 201306)

白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)是養(yǎng)殖對(duì)蝦主要的病害之一，其傳播范圍廣、致病力強(qiáng)，蝦群感染3～7 d的死亡率高達(dá)90%～100%，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失(黃倢等, 1995；Loet al, 1996； 馬曉燕等, 2012； 何建國等, 1999)。研究表明，囊膜蛋白是介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞發(fā)生相互作用的重要因子，在病毒侵染早期起關(guān)鍵作用，VP26、VP28和VP37是WSSV的主要囊膜蛋白，VP26存在于囊膜蛋白和核衣殼蛋白之間起聯(lián)結(jié)作用(于力等,2008)；VP28與病毒抗原性有關(guān)，在病毒入侵宿主細(xì)胞過程中起重要作用(van Hultenet al, 2000、2001)；VP37是粘附蛋白，可延緩WSSV的侵染過程(Lianget al, 2005； Liuet al, 2009)。

Ras基因是在生物進(jìn)化過程中第一個(gè)被鑒定出來的非常保守的原癌基因，廣泛存在于從酵母菌到人類的真核細(xì)胞中，因首先發(fā)現(xiàn)于大鼠肉瘤病毒(Rat sarcoma,Ras)而得名(Liuet al, 1995； Winstonet al,1996； Fanet al, 1997)。其分泌的RAS蛋白是偶聯(lián)細(xì)胞表面受體與胞內(nèi)效應(yīng)因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子，位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，屬于小G蛋白家族，能結(jié)合GTP和GDP。結(jié)合 GTP時(shí)為活性狀態(tài)，能夠與下游多種效應(yīng)因子相互作用進(jìn)行信號(hào)傳遞；當(dāng)結(jié)合GDP時(shí)處于非活性狀態(tài)，不能傳遞信號(hào)。所以，RAS蛋白在多種細(xì)胞跨膜受體介導(dǎo)的信號(hào)通路中起著分子開關(guān)的作用，在細(xì)胞增殖、分化、調(diào)亡、癌變等方面也起著非常重要的作用(Wennerberget al, 2005； Winstonet al, 1996； van der Weydenet al, 2007； Castroet al, 2005； Greenhoughet al, 2007)。目前，關(guān)于對(duì)蝦小G蛋白家族的研究多集中在Rab蛋白上，Praween等(2017)研究表明，在對(duì)蝦感染傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)和WSSV時(shí)，Rab5、Rab6、Rab7三種蛋白的表達(dá)量均上調(diào)，說明三者參與了對(duì)蝦的先天性免疫防御系統(tǒng)。

本研究通過克隆表達(dá)獲得凡納濱對(duì)蝦的 RAS蛋白，利用Far-western技術(shù)在體外篩選出能與RAS蛋白相互作用的WSSV結(jié)構(gòu)蛋白，并通過ELISA驗(yàn)證二者在數(shù)量上的相互作用關(guān)系，為深入全面地探索WSSV感染機(jī)制和防治措施奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

WSSV結(jié)構(gòu)蛋白 VP26、VP28N和 VP37，表達(dá)載體 pBAD/gⅢA由本實(shí)驗(yàn)室保存；TRIzol試劑、PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、ExTaq酶及 DNA標(biāo)準(zhǔn)(DNA Marker DL2000)購自TaKaRa公司；E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞購自TIANGEN公司；氨芐青霉素(Amp+)、L-阿拉伯糖、質(zhì)粒小提試劑盒購自Solarbio公司；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶NcoI、XbaI及蛋白Marker購自Thermo公司；地高辛(DIG)購自 Roche公司；膠回收試劑盒購自ZYMO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 凡納濱對(duì)蝦 cDNA的合成 剪取凡納濱對(duì)蝦的鰓絲，加入適量 RNAiso充分研磨后，按照RNAiso試劑盒說明書提取RNA。依照PrimeScript RT Reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 凡納濱對(duì)蝦Ras編碼區(qū)基因的克隆 按照GenBank上的凡納濱對(duì)蝦Ras mRNA序列，設(shè)計(jì)特異性引物(Rass：5'-TACCATGGAGATGACGGAATACACG-3'；Rasa：5'-ACTCTAGATCGAACACAATGCACTT-3'，劃線處為NcoI和XbaI酶切位點(diǎn))，以凡納濱對(duì)蝦鰓的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增Ras基因序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，回收純化。

1.2.3 重組表達(dá)載體pBAD/gⅢA-Ras的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物和 pBAD/gⅢA載體經(jīng)NcoI和XbaI雙酶切，T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞中，取100 μl轉(zhuǎn)化液涂布到 LB固體培養(yǎng)基(Amp+，50 μg/ml)上，37℃倒置培養(yǎng)。挑取單克隆，進(jìn)行菌液PCR篩選陽性克隆，測序驗(yàn)證。

1.2.4 RAS生物學(xué)分析 利用在線軟件ProtParam tool分析蛋白的等電點(diǎn)和分子量，應(yīng)用 SignalP 3.0 Server預(yù)測氨基酸序列有無信號(hào)肽，利用NPS Network Protein Sequence Analysis在線軟件，采用PHD方法預(yù)測RAS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)(王修芳等, 2016)。

1.2.5 RAS蛋白的表達(dá) 測序正確的菌液用新鮮的 LB 培養(yǎng)液(Amp+，100 μg/ml)培養(yǎng)至 OD600nm為0.5～0.6，加入誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖(終濃度為0.2 g/L)，37℃誘導(dǎo)4 h，對(duì)照組不加誘導(dǎo)劑。10000 r/min離心5 min，收集菌體，PBS緩沖液(pH=7.4)重懸，用超聲破碎儀超聲破碎后，10000 r/min離心30 min，分別收集誘導(dǎo)、未誘導(dǎo)菌液的上清液和沉淀，SDS-PAGE分析RAS蛋白表達(dá)情況，并將蛋白條帶切下，送上海復(fù)旦大學(xué)進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析。

1.2.6 Co2+柱親和層析純化 RAS蛋白 誘導(dǎo)表達(dá)的菌液沉淀用A液(含6 mol/L鹽酸胍，pH=7.4)溶解后，4℃ 10000 r/min離心10 min，收集上清液，依次經(jīng)0.8 μm和0.45 μm濾膜過濾。向?qū)游鲋屑尤霕渲琍BS緩沖液(pH=7.4)平衡洗柱，A液將紫外吸收峰洗至0，加入蛋白上清液混勻，冰浴2 h，A液洗脫至峰值為0，C液(含150 mmol/L咪唑，pH=7.4)洗脫，并收集RAS蛋白。RAS蛋白經(jīng)尿素梯度復(fù)性液(4、2、1、0 mol/L)透析復(fù)性后濃縮，SDS-PAGE檢測蛋白純化效果。

1.2.7 DIG標(biāo)記 RAS蛋白 將 DIG粉末溶于DMSO(1∶1000)中，與RAS蛋白充分混勻，4℃ PBS緩沖液(pH=7.4)過夜透析，以去除過量的DIG。

1.2.8 Far-western檢測與RAS蛋白互作的WSSV蛋白 將WSSV的3種結(jié)構(gòu)蛋白VP26、VP28N、VP37和 BSA(陰性對(duì)照)進(jìn)行 15% SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，4℃ 5% BSA封閉過夜，PBS-T清洗后加入DIG-RAS蛋白，室溫避光孵育2 h，PBS-T清洗5遍后，加入堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的抗 DIG抗體(Anti-DIG-AP，1∶3000)，室溫避光孵育2 h，PBS-T清洗5遍后，用BCIP/NBT顯色液避光顯色。

1.2.9 ELISA檢測RAS蛋白與VP26的相互作用

VP26 用 Na2CO3包被液稀釋至 0.02 μg/μl，分別取50 μl稀釋好的VP26加入96孔板中，BSA為陰性對(duì)照，4℃包被過夜。PBS-T清洗后，5% BSA常溫封閉 2 h，PBS-T洗板 3次。加入 50 μl不同量的DIG-RAS 蛋白(0.1、1.0、2.5 μg)，常溫孵育 2 h，PBS-T洗板5次。加入50 μl Anti-DIG-AP(1∶5000稀釋)，常溫孵育2 h，PBS-T洗板5次，加入50 μl PNPP顯色液，直到出現(xiàn)明顯顏色時(shí)，加入50 μl NaOH (0.3 mol/L)中止反應(yīng)。酶標(biāo)儀測定405 nm處的吸光值并計(jì)算P/N值。P/N計(jì)算公式：P/N=(OD405nm-OD405nm空白)/(OD405nmBSA-OD405 nm空白)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Ras基因的克隆

以凡納濱對(duì)蝦鰓的cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增Ras基因，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1，擴(kuò)增的片段在500～750 bp之間，與Ras基因片段(561 bp)大小相符。

圖1 Ras基因的克隆Fig.1 Amplification of Ras gene

2.2 重組表達(dá)載體pBAD/gⅢA-Ras的鑒定

T4 DNA連接酶將雙酶切后的目的片段與具有相同粘性末端的 pBAD/gⅢA表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化到E.coliTop10細(xì)胞中，經(jīng)菌液PCR鑒定陽性克隆，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2，條帶大小為500～750 bp，菌液測序結(jié)果經(jīng)過DNAMAN軟件分析，重組表達(dá)載體序列完全正確，無堿基錯(cuò)配和移碼突變。

圖2 重組表達(dá)載體PCR鑒定Fig.2 Identification of recombinant vector by PCR

2.3 RAS蛋白生物學(xué)信息

經(jīng)ProtParam tool分析顯示，RAS理論分子量為21.3 kDa，等電點(diǎn)為5.97；SignalP 3.0 Server分析顯示，該蛋白無信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，NPS Network Protein Sequence Analysis預(yù)測RAS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖 3)，α螺旋為40.64%，β轉(zhuǎn)角為36.9%，延伸鏈占22.46%。

2.4 RAS蛋白的檢測

分別取誘導(dǎo)、未誘導(dǎo)菌液的上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE(圖4)，與未誘導(dǎo)的上清液、誘導(dǎo)的上清液、未誘導(dǎo)的沉淀相比，誘導(dǎo)菌液的沉淀在25 kDa左右出現(xiàn)一條明顯加粗的蛋白條帶(圖 4中的紅色箭頭所示)，將此條帶進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析(表1)，結(jié)果顯示，該蛋白為凡納濱對(duì)蝦的RAS蛋白。

圖3 RAS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 Secondary structure prediction of RAS

2.5 RAS蛋白的純化

重組RAS蛋白帶有6×His標(biāo)簽，可利用Co2+親和層析法純化。SDS-PAGE顯示(圖5)，RAS蛋白純度高，為單一條帶，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.6 RAS蛋白與WSSV結(jié)構(gòu)蛋白的相互作用

將VP26、VP28N和VP37進(jìn)行蛋白電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，依次經(jīng)過DIG-RAS蛋白和Anti-DIGAP孵育。顯色結(jié)果顯示，在 VP26泳道出現(xiàn)明顯的條帶(圖 6中的紅色箭頭所示)，而 VP28N、VP37和BSA泳道無條帶，說明RAS蛋白只能與VP26特異性結(jié)合。

圖4 RAS蛋白表達(dá)檢測Fig.4 Detection of RAS protein

2.7 ELISA分析

采用ELISA方法，進(jìn)一步驗(yàn)證VP26與RAS互作，數(shù)據(jù)分析顯示P/N值遠(yuǎn)大于2(圖7)，且VP26與RAS蛋白的相互作用隨RAS蛋白量的增加而增強(qiáng)，當(dāng)RAS蛋白量增加至2.5 μg時(shí)，P/N值增加到16.4，說明VP26與RAS蛋白有明顯的結(jié)合作用。

圖5 SDS-PAGE分析純化的RAS蛋白Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified RAS

表1 RAS蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果Tab.1 Results of MS analysis of RAS

圖6 Far-western分析RAS蛋白與VP26、VP28N及VP37的相互作用Fig.6 Analysis of interaction of purified recombinand RAS and VP26, VP28N, and VP37 by far-western

圖7 ELISA分析RAS蛋白與VP26的相互作用Fig.7 Analysis of RAS interaction with VP26 by ELISA

3 討論

大量研究表明，病原蛋白與宿主蛋白相互作用是誘發(fā)感染、致病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。WSSV侵染宿主細(xì)胞是一個(gè)很復(fù)雜的過程，病毒在復(fù)制過程中會(huì)與多種宿主細(xì)胞蛋白發(fā)生作用。近年來，已報(bào)道多種宿主分子(包括Rab5、Rab6、Rab7等小G蛋白)參與WSSV的侵染過程(Sritunyalucksanaet al, 2006、2013)，但關(guān)于RAS蛋白與WSSV的相互作用尚不明確。

本研究根據(jù)Ras編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，PCR獲得Ras序列，通過原核表達(dá)和Co2+親和層析法得到RAS蛋白，SDS-PAGE結(jié)果顯示，RAS蛋白存在于誘導(dǎo)沉淀中，屬于包涵體蛋白。以WSSV的3個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白 VP26、VP28N和 VP37作為研究對(duì)象，通過Far-western和 ELISA檢測三者是否與凡納濱對(duì)蝦RAS蛋白相互作用。研究表明，RAS蛋白雖不能與VP28N和VP37相互作用，但能與VP26特異性結(jié)合，且二者的相互作用隨著 RAS蛋白量的增加而增強(qiáng)。VP26是WSSV中含量較高的被膜蛋白，起連接作用(Tsaiet al, 2006)，既可以與囊膜蛋白VP28結(jié)合，又可以與核衣殼蛋白VP51結(jié)合，三者可能通過形成復(fù)合體起到穩(wěn)定病毒結(jié)構(gòu)的作用(Changet al, 2008；Wanet al, 2008)。VP26能特異性結(jié)合斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)血細(xì)胞，參與WSSV侵染的初始階段(劉非等, 2006)，中國明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)的 Tetraspanin-3蛋白在體外也能特異地結(jié)合VP26，參與WSSV的感染過程(關(guān)廣闊等, 2015)，VP26通過與日本囊對(duì)蝦(Penaeus japonicus)β肌動(dòng)蛋白作用，完成WSSV的入侵、運(yùn)輸和釋放等過程(Liuet al, 2011； Xieet al, 2005； Gouinet al, 2005)，說明VP26可與多個(gè)宿主分子相互作用。

RAS是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，在信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起著極為重要的作用，RAS與 VP28和VP37無作用，說明RAS不參與WSSV吸附宿主細(xì)胞的過程。根據(jù)研究結(jié)果可初步推測，在 WSSV侵染凡納濱對(duì)蝦細(xì)胞時(shí)，RAS蛋白通過與VP26相互作用，調(diào)控信號(hào)通路介導(dǎo) WSSV進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而加快了 WSSV在宿主體內(nèi)的傳播，具體作用機(jī)制尚需深入研究。本研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示 WSSV侵染宿主細(xì)胞的信號(hào)通路和病毒-宿主相互作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。