中國對蝦生物量評估的環(huán)境DNA檢測技術(shù)的建立及優(yōu)化*

李 苗 單秀娟 王偉繼① 呂 丁 戴芳群 丁小松 吳歡歡,4

(1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院 上海 201306；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室山東省漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；4.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

保護多樣性是生態(tài)學(xué)和保護生物學(xué)的主要目標(Vermeulenet al, 2002)，也是政府制定相關(guān)保護措施與政策的根本依據(jù)。然而，精確評價生物多樣性、掌握目標種的分布與生物量需要花費大量的人力、物力和財力，尤其對于水生生物而言，其特殊生存環(huán)境更是增加了研究的困難。

隨著分子生物學(xué)的高速發(fā)展，可以直接從環(huán)境樣品中提取DNA片段，然后利用高通量測序及熒光定量 PCR等技術(shù)進行物種定性或定量分析，即 eDNA(Environmental DNA, eDNA)技術(shù)(Ficetolaet al, 2008；Haileet al, 2009； Bohmannet al, 2014； Evanset al,2017； 單秀娟等, 2018)，這種技術(shù)作為一種新的物種監(jiān)測方法應(yīng)用到水生生物調(diào)查中。然而，由于物種之間的差異，其釋放的eDNA量的多少與eDNA片段的大小各不相同(Geertset al, 2018)。因此，針對不同的研究對象應(yīng)采用不同的eDNA富集與提取方法，以期達到最佳的研究效果。

自20世紀80年代以來，中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)資源嚴重衰退，目前其捕撈產(chǎn)量主要來源于增殖放流(袁偉等, 2015)。放流初期，其個體較小、游泳能力較弱，其群體數(shù)量相對較少，傳統(tǒng)的方法難以準確監(jiān)測。因此，為了能夠準確掌握中國對蝦的分布與資源量狀況，合理開發(fā)利用其資源，本研究以渤海中國對蝦為研究對象，采用濾膜法富集eDNA，結(jié)合DNeasy Blood and Tissue kit提取eDNA，最后應(yīng)用實時熒光定量PCR(絕對定量)分析DNA樣品，建立了一套適于中國對蝦研究的eDNA技術(shù)操作流程，旨在為中國對蝦分布監(jiān)測及其資源評估提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 特異性引物設(shè)計

針對中國對蝦的線粒體細胞色素酶氧化亞基I(COI)基因設(shè)計特異性引物。在 GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索中國對蝦COI基因序列，利用 BioEdit和MEGA7軟件進行序列比對，使用 Primer Premier 6與 Beacon Designer 8軟件設(shè)計引物與探針，并在NCBI網(wǎng)站上進行引物特異性測試。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，詳細信息見表1。

1.2 中國對蝦肌肉組織DNA提取及PCR擴增

中國對蝦肌肉組織取自2016年7月渤海漁業(yè)資源調(diào)查捕獲的中國對蝦，-20℃保存。

DNA提取采取傳統(tǒng)的酚-氯仿-異戊醇方法，具體參照閆晗等(2012)的方法并做相應(yīng)的改進，最后將提取的DNA溶液稀釋到50 ng/μl，用1.5 ml無菌離心管-20℃保存?zhèn)溆?。PCR 25 μl體系：10×TaqBuffer 2.5 μl，dNTPs(各 2.5 mmol/L)0.5 μl，正反向引物(COIPF/CO I PR) (10 mmol/L)各 0.5 μl，TaqDNA Polymerase (5 U/μl) 0.5 μl，模板 DNA(50 ng/μl) 1 μl,MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μl，ddH2O 18 μl。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃復(fù)延伸10 min。引物對COIDF/COIDR的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件與引物對COIPF/COIPR相同。

1.3 重組質(zhì)粒標準品的制備

將1.2中的PCR產(chǎn)物純化，連接到pMD-18-T質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，在LB固體平板培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，挑取單菌落擴大培養(yǎng)進行質(zhì)粒DNA提取，將質(zhì)粒DNA稀釋到特定濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 中國對蝦mtDNA COI基因PCR擴增引物信息Tab.1 Primer pairs for mtDNA COI of F.chinensis

1.3.1 PCR產(chǎn)物純化 將1.2中PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，選擇電泳條帶單一且明亮的產(chǎn)物使用 Gel Extraction Kit(OMEGA)試劑盒進行切膠回收，純化的PCR產(chǎn)物-20℃保存。具體實驗步驟參照說明書。

1.3.2 質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化 將經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物連接到 pMD-18-T質(zhì)粒載體(TaKaRa)上(具體操作詳見說明書)；將 10 μl連接產(chǎn)物加入 100 μl DH5α 感受態(tài)細胞(TaKaRa)中，冰浴30 min；42℃熱激1 min，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞；加入1 ml SOC培養(yǎng)基，37℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)1 h；取150 μl菌液將其涂布在LB固體培養(yǎng)基上(含Amp、X-gal、IPTG)上，37℃倒置過夜培養(yǎng)；挑取6個白色單菌落分別置于1.5 ml離心管中培養(yǎng)，菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序；選取連接轉(zhuǎn)化成功的菌液擴大培養(yǎng)。

1.3.3 標準品制備 將經(jīng)過擴大培養(yǎng)的菌液使用Plasmid Mini Kit(OMEGA)試劑盒進行質(zhì)粒DNA提取(具體操作參照說明書)，提取完成后，用紫外分光光度計檢測DNA濃度，并將其稀釋為108copies/μl的標準品，-80℃保存。

1.4 eDNA樣品采集

實驗水樣取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所水產(chǎn)遺傳育種中心的中國對蝦養(yǎng)殖池，養(yǎng)殖池長5.5 m、寬3.6 m、高1.2 m，養(yǎng)殖水體體積為14 m3。其中，對蝦平均體重為27 g，每池180尾蝦(中國對蝦的體重及數(shù)量數(shù)據(jù)由基地工作人員收集)。

實驗水樣采集方案設(shè)計如下：選取直徑為47 mm的玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、聚碳酸酯膜、尼龍膜共4種材質(zhì)的濾膜，每種濾膜根據(jù)其孔徑大小設(shè)置0.45、0.8、1.2、5 μm 共 4個梯度，取水量設(shè)置 500 ml、1 L、2 L共3個梯度，同一樣本(即使用同一孔徑與同一材質(zhì)的濾膜過濾相同體積的水樣)做 3次技術(shù)重復(fù)。此外，在養(yǎng)殖池入水口取6個平行樣本作為陰性對照，共計150個樣本。取養(yǎng)殖池表層水，采用無菌真空抽濾裝置進行過濾，每次過濾之前用無菌水沖洗過濾漏斗，防止交叉污染。過濾完成后，將每張濾膜單獨卷起來，放入1.5 ml離心管中并做好標記，-20℃保存直至進行DNA提取。

1.5 eDNA提取

利用DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen, 德國)試劑盒提取 DNA，參照 Renshaw等(2015)的方法并加以改進。將濾膜取出解凍后，用剪刀將濾膜剪成細條狀，放入2 ml的離心管中，加入570 μl Buffer ATL和60 μl蛋白酶K，渦旋混勻，恒溫水浴3 h (期間每隔15 min輕輕顛倒混勻)；加入630 μl Buffer AL，渦旋震蕩混勻；加入630 μl無水乙醇，渦旋震蕩混勻；將2 ml離心管中的混合液分3次轉(zhuǎn)移到DNeasy離心柱中(離心柱每次能承載液體為700 μl)，室溫8000g離心1 min，棄濾液及收集管；將離心柱放入新收集管，加入500 μl Buffer AW1。室溫 8000g離心1 min，棄濾液及收集管；將離心柱放入新收集管中，加入500 μl Buffer AW2。室溫 12000 g離心 3 min，棄濾液及收集管；將離心柱放入新1.5 ml離心管中，在離心柱中部加入50 μl Buffer TE，室溫孵育1 min，室溫8000 g離心1 min；重復(fù)上一步驟以增大DNA產(chǎn)量。

1.6 eDNA的定量分析

所有提取的 eDNA樣品采用 BBI生命科學(xué)有限公司的2× TaqMan Fast qPCR Master Mix (Low Rox)實時熒光定量PCR試劑盒進行定量分析。PCR反應(yīng)體系采用 20 μl 體系：10 μl 2×TaqMan Fast qPCR Master Mix，0.4 μl正向引物(10 μmol/L)，0.4 μl反向引物(10 μmol/L)，0.4 μl探針(10 μmol/L)，2 μl模板 DNA，6.8 μl PCR水。擴增反應(yīng)程序采用兩步法：(1)94℃預(yù)變性3 min；(2)94℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，40個循環(huán)。

標準品及每個eDNA樣品做3個重復(fù)，即每一采樣類型 9個重復(fù)(即使用同一孔徑與同一材質(zhì)的濾膜過濾相同體積的水樣)(3個 qPCR重復(fù)×3次取樣重復(fù))，每個96孔板做3個無模板空白對照以檢測污染問題，標準品濃度從107copies/μl以10倍為梯度稀釋到102copies/μl。最終的eDNA拷貝數(shù)取平均值，實驗數(shù)據(jù)采用絕對定量法分析。使用 Applied Biosystems ABI 7500型定量PCR儀和96孔板(Thermo Fisher)進行qPCR擴增，應(yīng)用系統(tǒng)軟件SDS1.4.0.25自動計算Ct值及生成標準曲線與擴增曲線。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析與處理在 R.3.0.2軟件上進行，使用GAM進行曲線擬合，誤差控制在95%的置信區(qū)間以內(nèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性

本實驗設(shè)計的引物成功擴增出了597 bp和106 bp的特異性目的片段，與預(yù)期結(jié)果完全一致，其測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上經(jīng)過Blast比對分析，其結(jié)果顯示與原始序列片段同源性達 100%。同時，引物特異性通過對蝦肌肉組織DNA的PCR擴增與瓊脂糖凝膠電泳檢測得到驗證，其目的條帶單一且明亮，結(jié)果如圖1所示。

圖1 中國對蝦mtDNA COI的擴增結(jié)果Fig.1 Amplification of mtDNA COI of F.chinensis

2.2 環(huán)境DNA樣品采集

共采集132個樣本：養(yǎng)殖池入水口出6個；玻璃纖維膜與硝酸纖維膜均取36個，無堵塞現(xiàn)象出現(xiàn)；聚碳酸酯膜為30個，此材質(zhì)的孔徑大小為0.45 μm，在過濾300 ml水樣后便被堵塞；尼龍膜為24個，此材質(zhì)的孔徑大小為0.45 μm，在過濾150 ml水樣后堵塞，而孔徑大小為0.8 μm的濾膜，在過濾350 ml水樣后堵塞。

在整個環(huán)境DNA水樣采集過程發(fā)現(xiàn)，用不同材質(zhì)、相同孔徑的濾膜過濾同一體積的水樣，用玻璃纖維膜過濾所用時間最短，主要原因在于玻璃纖維膜的通透性最強。

2.3 DNA檢測

提取的中國對蝦肌肉組織DNA純度及濃度均較高，其PCR產(chǎn)物電泳檢測目的條帶單一(圖1)。

eDNA提取完成后，紫外分光光度計檢測顯示，DNA 濃度最小值為 12.23 ng/μl，最大為 173.68 ng/μl，且大部分DNA樣品的A260nm/A280nm值在1.8～2.0之間。此結(jié)果與已有研究結(jié)果相比，eDNA濃度及純度均較高，這與取樣的養(yǎng)殖池中國對蝦密度較大且物種單一有關(guān)。此外，物種之間的差異也導(dǎo)致了不同的eDNA釋放速率與釋放量。

2.4 標準曲線的制備

通過實時熒光定量 PCR擴增，系統(tǒng)根據(jù)熒光值的變化自動生成中國對蝦COI基因的標準曲線與擴增曲線(圖 2)。曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.993，回歸方程為Y=-3.531x+40.975，說明本研究在稀釋的質(zhì)粒標準品濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，所建立的標準曲線能夠正確反映出中國對蝦COI基因的擴增。

圖2 中國對蝦COI基因的qPCR標準曲線Fig.2 The standard curve of qPCR of F.chinensis COI gene

2.5 最佳濾膜及取水量篩選

通過實時熒光定量PCR的檢測發(fā)現(xiàn)(圖3、圖4)，在濾膜未出現(xiàn)堵塞的情況下，用同一材質(zhì)、同一孔徑的濾膜過濾不同體積的水樣，過濾的水樣體積越大，所提取的 DNA 濃度(copies/μl)及產(chǎn)量(copies)越大。在濾膜未出現(xiàn)堵塞的情況下，用同一材質(zhì)、不同孔徑的濾膜過濾相同體積的水樣，濾膜孔徑越大，提取的DNA濃度及產(chǎn)量越小。通過對所有樣品的檢測，結(jié)果顯示，使用0.45 μm的玻璃纖維濾膜過濾2 L的水樣能夠提取到的DNA的濃度最高，為1750 copies/μl，且其eDNA產(chǎn)量也最大。理論上，隨著取樣水量的成倍增加，所提取eDNA的濃度及產(chǎn)量的平均值均應(yīng)該呈倍數(shù)關(guān)系增加，但由于在實驗操作的過程中存在一定的誤差，導(dǎo)致最終提取的eDNA濃度及產(chǎn)量并非呈嚴格的倍數(shù)關(guān)系遞增。

3 討論

與傳統(tǒng)調(diào)查方法相比，eDNA技術(shù)具有經(jīng)濟高效、省時省力、靈敏度高等特點，對于資源衰退嚴重的物種，此方法能更準確地反應(yīng)其分布與資源量狀況，但不同水樣采集方法、eDNA富集方法及eDNA的提取方法均會對物種定性與定量分析產(chǎn)生影響(Minamotoet al, 2016； Geertset al, 2018)。

3.1 水樣采集

Moyer等(2014)對池塘表層水、中層水、底層水分析發(fā)現(xiàn)，表層水與底層水的效果較好，但海洋生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，不同于池塘，已有研究采集的水樣從15 ml至10 L不等，以1 L與2 L為主(Reeset al, 2014)。本研究發(fā)現(xiàn)，在濾膜沒有堵塞之前，采集水樣體積越大，獲得DNA拷貝越多，后期分析越有利，由于海上調(diào)查時受時間限制，建議過濾2 L水樣為宜。

3.2 eDNA富集方法

eDNA富集方法通常有酒精沉淀(Thomsenet al,2012)、離心(Klymuset al, 2015)及過濾(Jerdeet al,2011)三種方法。酒精沉淀法和離心法適合于小體積水樣的eDNA富集，主要用于養(yǎng)殖池及其他人工水體等靜水生態(tài)系統(tǒng)。由于目標種檢出率受生物量影響，相對于人工水體，自然生態(tài)系統(tǒng)中目標種密度相對較小，為了避免假陽性結(jié)果產(chǎn)生，建議采用濾膜法采集水樣，以增加目標種的檢出率，尤其適合中國對蝦這種資源衰退嚴重的物種。此外，選用濾膜法更有利于樣品保存，有效防止eDNA的降解。

圖3 不同濾膜類型及過濾水量所富集的eDNA的濃度Fig.3 Concentration of eDNA enriched by different membrane and volume of filtered water

圖4 不同濾膜類型及過濾水量所富集的eDNA的產(chǎn)量Fig.4 Output of eDNA enriched with different membrane and volume of filtered water

水生生物釋放到環(huán)境中的有效DNA片段集中在0.1～10 μm 之間(Turneret al, 2014)，選取合適的濾膜孔徑對于富集eDNA至關(guān)重要。目前，最常用的濾膜有 4種：玻璃纖維膜(Jerdeet al, 2011)、硝酸纖維膜(Goldberget al, 2011)、聚碳酸酯膜(Takaharaet al,2012)、尼龍膜(Thomsenet al, 2012)。各種濾膜對eDNA的富集效果取決于具體研究對象，不同研究對象的最適合濾膜也不同。本研究發(fā)現(xiàn)，使用同一孔徑、不同材質(zhì)的濾膜過濾同一體積水樣的時間不同，其中，0.45 μm的玻璃纖維膜通透性最強，時間最短，對中國對蝦eDNA的富集效果最佳。

3.3 eDNA的提取

目前，eDNA提取主要采用酚-氯仿-異戊醇法(Costaset al, 2007； Deineret al, 2014)與商業(yè)化的試劑盒提取(Minamotoet al, 2012； Sigsgaardet al, 2017)。酚-氯仿-異戊醇法與試劑盒法相比價格低，由于其在提取過程中DNA損耗較多，用于生物量豐富的物種定性檢測尚可，定量分析則不能正確反映物種生物量。對于瀕危物種及稀有物種而言，其在自然水域中密度非常小，釋放到水環(huán)境中的DNA屬于微量，為了更有效地對目標種進行物種監(jiān)測與生物量評估，建議使用商業(yè)化試劑盒提取 eDNA。對于試劑盒的選用，使用最多的主要有DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen, 德國)與 PowerWater DNA Isolation Kit(MOBIO Laboratories, 美國)兩種試劑盒。有學(xué)者就各類試劑盒對 eDNA的提取效果做過對比分析(Deineret al, 2015； Eichmilleret al, 2016)，普遍認為 DNeasy Blood and Tissue Kit效果較好，同一試劑盒對不同目標種可能存在差異。因此，研究者應(yīng)針對所選取的研究對象做eDNA技術(shù)操作流程各個步驟的優(yōu)化。

3.4 eDNA的定量分析

目的基因的選擇及熒光定量 PCR中熒光標記方法均是影響熒光定量 PCR結(jié)果準確性的主要因素。Hebert等(2005)研究表明，在eDNA濃度較低的情況下，細胞中的線粒體拷貝數(shù)要遠大于核 DNA，更易于被檢測到?；陂L度差異與進化速率的考慮，mtDNA中COI基因更適于用來分析親緣關(guān)系較近的分類類群(焦明超等, 2011)。同時，熒光標記方法有擴增序列非特異和序列特異兩類檢測，其中，TaqMan探針法較染料法具有更強的特異性，能夠排除假陽性結(jié)果的產(chǎn)生?？紤]到渤海蝦類組成及周邊對蝦養(yǎng)殖業(yè)可能產(chǎn)生的影響，建議選擇COI基因作為擴增的目的基因，同時采用TaqMan探針法進行熒光定量PCR。

4 小結(jié)

本研究通過實時熒光定量 PCR進行檢測，確定采用 0.45 μm 的玻璃纖維濾膜過濾 2 L水樣結(jié)合DNeasy Blood and Tissue Kit試劑盒提取eDNA，能夠檢測到的DNA拷貝數(shù)最多，初步建立了一套針對中國對蝦eDNA技術(shù)的操作流程。

致謝：感謝中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所水產(chǎn)遺傳育種中心陳寶龍老師與課題組項目聘用人員王惠賓在取樣工作中給予的莫大幫助！