揮發(fā)性抑芽物質(zhì)對(duì)馬鈴薯塊莖萌芽的影響及其作用機(jī)制

鄒 雪 丁 凡 余金龍 彭 潔 鄧孟勝 王 宇 劉麗芳 余韓開宗 陳年偉 王西瑤,*

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揮發(fā)性抑芽物質(zhì)對(duì)馬鈴薯塊莖萌芽的影響及其作用機(jī)制

鄒 雪1,2丁 凡1余金龍1彭 潔2鄧孟勝2王 宇2劉麗芳1余韓開宗1陳年偉1王西瑤2,*

1綿陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 四川綿陽(yáng) 621023;2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 四川成都 611130

馬鈴薯塊莖過(guò)早萌芽會(huì)降低商品價(jià)值, 本試驗(yàn)比較揮發(fā)性物質(zhì)的抑芽效應(yīng), 并從轉(zhuǎn)錄和蛋白水平分析其作用機(jī)制。結(jié)果表明, 抑芽能力薄荷醇>樟腦>萘, 萌芽受抑降低代謝消耗, 薄荷醇處理180 d時(shí)的重量損失只有對(duì)照損失的36%。樟腦處理萌芽塊莖3 d引起表達(dá)顯著上調(diào)(或下調(diào))的基因和蛋白分別有1227 (299)和296 (204)個(gè), 主要參與響應(yīng)刺激、防御反應(yīng)。貯藏期間, 果膠代謝基因、、, 角質(zhì)合成基因、、, 乙烯合成基因以及轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的表達(dá)量隨時(shí)間升高。樟腦早期不同程度地刺激這些基因表達(dá), 中后期則抑制, 49 d時(shí)只有對(duì)照的0.68%~23.35%。薄荷醇使上述基因表達(dá)保持低水平, 但可提高細(xì)胞周期負(fù)控基因的表達(dá), 為對(duì)照的15.9倍。植物病原菌互作通路中的基因、-、表達(dá)受樟腦誘導(dǎo)并在后期高表達(dá)。樟腦和薄荷醇均能抑制生長(zhǎng)發(fā)育基因的表達(dá), 造成芽死亡, 降低貯藏?fù)p耗。前者早期能促進(jìn)合成保護(hù)性物質(zhì), 萌芽時(shí)有更強(qiáng)烈的抗菌反應(yīng); 后者則阻礙細(xì)胞分裂。

馬鈴薯; 貯藏; 抑芽物質(zhì); 轉(zhuǎn)錄組; 蛋白組

馬鈴薯(L.)適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量穩(wěn)定、營(yíng)養(yǎng)全面, 既可菜用又能加工成薯?xiàng)l、薯片、面食等。種植馬鈴薯是貧困地區(qū)脫貧增收的有效保證, 至2016年在中國(guó)的種植面積已達(dá)581.51萬(wàn)公頃, 總產(chǎn)9912.24萬(wàn)噸, 均列世界第一(FAO, 2016)。與水稻、小麥、玉米等籽粒型作物的種子相比, 塊莖水分含量高, 貯藏期相對(duì)較短。種薯過(guò)早萌芽會(huì)造成薯塊老化, 減產(chǎn)10%~30%[1]; 菜用或加工用, 薯塊過(guò)早萌芽則消耗水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 降低商品價(jià)值。調(diào)控塊莖萌芽, 減少貯藏?fù)p耗, 延長(zhǎng)貯藏期對(duì)產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展至關(guān)重要。

不同基因型的塊莖休眠期各異, 休眠過(guò)后則萌芽, 2~5℃冷藏在一定時(shí)間內(nèi)可延長(zhǎng)休眠期但不能阻止萌芽, 常需配合使用抑芽劑來(lái)最大限度地延長(zhǎng)貯藏期。目前用于加工、鮮食類塊莖貯藏的抑芽劑主要是化學(xué)試劑氯苯胺靈(3-氯氨基甲酸異丙基酯, CIPC)。雖然CIPC屬低毒類物質(zhì), 但隨著人們對(duì)食品安全的重視, 市場(chǎng)可接受度在下降, 并且從1962年商業(yè)化到現(xiàn)在已有50多年, 它的降解物以及對(duì)環(huán)境的交叉污染引起越來(lái)越多的擔(dān)憂[2-3]。從植物揮發(fā)性物質(zhì)中尋找使用方便、無(wú)毒的綠色新型抑芽物質(zhì)延長(zhǎng)塊莖貯藏, 是解決這一問(wèn)題的理想方式。研究表明, 從一些芳香植物中提取的精油對(duì)馬鈴薯塊莖萌芽具有不同程度的抑制作用。薄荷(L.)、芫荽(L.)和尤加利(L.)精油處理馬鈴薯塊莖10 d后均能不同程度地延緩發(fā)芽, 但后兩種精油中含有的檸檬烯會(huì)引起薯塊大量腐爛[4]。另有研究表明留蘭香(L.)精油及其主要成分R-香芹酮能抑制馬鈴薯塊莖發(fā)芽以及真菌和細(xì)菌活性[5-7]。1,4-二甲基萘是馬鈴薯休眠過(guò)程中自身產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì), 外源施用可抑制發(fā)芽, 但塊莖表面殘留量降低到1.4~2.7 mg kg–1時(shí)則會(huì)恢復(fù)發(fā)芽, 已證實(shí)該物質(zhì)是通過(guò)提高細(xì)胞周期負(fù)控基因和的表達(dá)量, 阻礙細(xì)胞分裂, 從而抑制塊莖發(fā)芽[8-10]。樟樹葉中的主要成分樟腦(1,7,7-三甲基二環(huán)[2.2.1]庚烷-2-酮)對(duì)馬鈴薯塊莖具有抑芽可逆效應(yīng), 分析塊莖在休眠、萌芽、樟腦處理50 d及恢復(fù)萌芽4種狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組差異, 發(fā)現(xiàn)它并沒(méi)有延長(zhǎng)休眠狀態(tài), 而是使芽組織產(chǎn)生類似抵抗病原菌侵染的致死過(guò)程, 直接對(duì)芽造成損傷[11], 因處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng), 并不清楚基因早期響應(yīng)情況。

高通量測(cè)序技術(shù)(high-throughput mRNA sequencing, RNA-seq)是全面解析特定條件下基因表達(dá)變化的有效工具, 利用該技術(shù)共測(cè)得馬鈴薯休眠解除過(guò)程中的5912個(gè)差異表達(dá)基因, 其中生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞分裂素和油菜素內(nèi)酯合成相關(guān)基因的過(guò)量表達(dá)占主導(dǎo), 且伴隨逆境響應(yīng)和氧化還原調(diào)節(jié)[12]。同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)是目前蛋白組學(xué)分析中應(yīng)用效果較好的標(biāo)記技術(shù)之一, 利用該方法從馬鈴薯塊莖中鑒定出4453個(gè)蛋白, 在低溫貯藏糖化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)46個(gè)差異表達(dá)蛋白[13]。

本試驗(yàn)選用萘(1,4-二甲基萘的相似物)、樟腦、薄荷醇(2-異丙基-5-甲基環(huán)己醇, 薄荷精油主要成分) 3種揮發(fā)性物質(zhì)處理馬鈴薯, 比較它們對(duì)塊莖的抑芽效應(yīng); 同時(shí), 用樟腦處理萌芽塊莖3 d, 測(cè)定轉(zhuǎn)錄組和蛋白組, 挖掘早期響應(yīng)的關(guān)鍵基因和蛋白; 根據(jù)組學(xué)分析, 結(jié)合基因表達(dá)量的變化幅度、基因的生物學(xué)意義和前人關(guān)于休眠和萌芽研究, 選擇涉及細(xì)胞壁和表皮物質(zhì)合成、植物病原菌互作等生理過(guò)程中的12個(gè)基因, 檢測(cè)貯藏期間樟腦、薄荷醇處理對(duì)這些基因表達(dá)的影響。試驗(yàn)旨在確認(rèn)具有潛在價(jià)值的抑芽物質(zhì), 初步認(rèn)識(shí)其作用機(jī)制, 為馬鈴薯的綠色安全貯藏提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

馬鈴薯短休眠品種‘費(fèi)烏瑞它’(Favorita)原原種, 由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院馬鈴薯研究開發(fā)中心提供。2月底移栽試管苗于網(wǎng)室, 基質(zhì)栽培, 于5月中下旬植株發(fā)黃時(shí)收獲。

萘購(gòu)自成都科龍化工試劑廠, 樟腦(純度96%)、薄荷醇(純度98%)購(gòu)自Sigma-Aldrich。TRIzol購(gòu)自Invitrogen, 反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis購(gòu)自Thermo。引物及熒光染料套裝SGExcel FastSYBR Mixture購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選新收原原種(約7~10 g 粒–1), 常溫下愈傷化14 d后以200 g L–1的量裝入8 L密封硬紙盒。根據(jù)初篩結(jié)果, 設(shè)萘(Naphthalene, NAP)、樟腦(Camphor, CAM)、薄荷醇(Menthol, MEN) 3種試劑的濃度為0.2 g L–1, 分別稱取固體顆粒用紗布包裹置盒中(不與薯塊直接接觸), 以不作任何處理為對(duì)照(CK)。每處理5盒, 于(23±2)℃室內(nèi)貯藏。從貯藏0 d起, 每隔15~20 d觀察統(tǒng)計(jì)其中3盒薯塊發(fā)芽情況并稱重, 芽長(zhǎng)超過(guò)2 mm即認(rèn)為該薯塊已解除休眠而萌芽。調(diào)查每盒20個(gè)薯塊的芽長(zhǎng), 統(tǒng)計(jì)時(shí)以1盒為整體計(jì)算平均芽長(zhǎng)和標(biāo)準(zhǔn)差(= 3)。貯藏0、7、21、35和49 d (此時(shí)CK的芽長(zhǎng)多在2 mm)時(shí), 從剩余2盒中分別取樣凍存于–80℃用于1.4熒光定量檢測(cè), 樟腦和薄荷醇處理繼續(xù)貯藏至70 d時(shí)取樣。取樣方式為, 以頂芽芽眼為中心, 用直徑3 mm硬質(zhì)塑料管打孔, 取從表皮起5 mm的圓柱體。

1.3 RNA-seq和iTRAQ測(cè)序及分析

如圖1所示, 貯藏到對(duì)照塊莖芽長(zhǎng)1~2 mm時(shí), 用0.2 g L–1樟腦處理3 d后取樣, 以頂芽芽眼為中心, 取直徑3 mm, 高5 mm的圓柱體, 以8個(gè)圓柱體提取1管RNA或蛋白, 為1個(gè)生物學(xué)重復(fù), 各3重復(fù), 送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司和杭州景杰生物科技有限公司完成RNA-seq和iTRAQ測(cè)序分析, 將3次重復(fù)的RNA或蛋白等量混合后建庫(kù)測(cè)序。

使用比對(duì)軟件SOAPaligner/soap2將clean reads分別比對(duì)到馬鈴薯參考基因組和參考基因序列(http://potato.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml)[14], 以RPKM (Reads Per kb per Million reads)代表基因表達(dá)量, RPKM = (1,000,000×C)/(N×L×1000), 其中C為唯一比對(duì)到基因A的reads數(shù), N為比對(duì)到所有參考基因的總reads數(shù), L為基因A的堿基數(shù)[15]。使用Blastx將序列比對(duì)到KEGG、GO和NR數(shù)據(jù)庫(kù), 進(jìn)行基因功能注釋。對(duì)差異檢驗(yàn)的-value作多重假設(shè)檢驗(yàn)校正, 通過(guò)控制 FDR (False Discovery Rate)來(lái)決定-value的域值, 規(guī)定差異表達(dá)基因?yàn)楸稊?shù)差異在2倍以上且FDR≤0.001。Gene Ontology功能顯著性富集分析(GO分析)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Pathway顯著性富集分析同常規(guī)方法。規(guī)定蛋白豐度水平差異倍數(shù)大于1.3, 且經(jīng)檢驗(yàn)其值<0.05的蛋白為差異蛋白。在Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)(http.//www.geneontology.org/)計(jì)算每個(gè)term的差異蛋白數(shù)目, 確定出差異蛋白顯著富集的GO條目, Pathway的顯著性分析同GO功能富集分析相似。將蛋白組和轉(zhuǎn)錄組作關(guān)聯(lián)分析, 找出蛋白所關(guān)聯(lián)到的基因, 即iTRAQ檢測(cè)到的蛋白所對(duì)應(yīng)的編碼基因在RNA-seq水平也同樣被檢測(cè)到。設(shè)置差異蛋白和差異表達(dá)基因的篩選條件與前述相同, 進(jìn)一步分析這些基因在iTRAQ和RNA-seq水平上的表達(dá)變化是否相同, 以及GO條目、代謝通路富集情況。

圖1 用作轉(zhuǎn)錄組和蛋白組測(cè)序的處理方式

利用熒光定量驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性, 選擇表1所示12個(gè)基因和、、等7個(gè)基因驗(yàn)證RNA-seq, 選擇Transport protein Sec61、Heat shock protein 90-6、Protochlorophyllide reductase-like、TSI-1 protein、Glutathione S-transfera等5個(gè)蛋白的編碼基因驗(yàn)證iTRAQ, 相關(guān)序列及引物參見文獻(xiàn)[11], 基因序列http://solanaceae.plantbiology. msu.edu/cgi-bin/annotation_report.cgi參考文獻(xiàn)[14]。RNA提取、熒光定量體系和計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[16]。

1.4 Real-time PCR檢測(cè)貯藏期間基因表達(dá)變化

根據(jù)組學(xué)分析獲得的差異基因和富集的代謝通路信息以及關(guān)于塊莖萌芽的文獻(xiàn)報(bào)道[10-11], 選擇12個(gè)基因利用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1), RNA提取、熒光定量體系和計(jì)算方法同上。以貯藏0 d時(shí)的ΔCt值為對(duì)照, 將3次試驗(yàn)重復(fù)所提的3管RNA混合后反轉(zhuǎn)錄所得cDNA作3次熒光定量重復(fù)。

表1 試驗(yàn)選擇基因的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 抑芽能力對(duì)比

貯藏50 d時(shí)各處理差異明顯, CK有70.90%長(zhǎng)出約2 mm完整小芽, 萘處理長(zhǎng)出分化不明顯的畸形芽, 樟腦處理的芽頂端發(fā)黑壞死, 薄荷醇處理僅能見到內(nèi)部死亡組織(圖2)。80 d時(shí)CK的芽長(zhǎng)已達(dá)14.29 mm, 而萘處理使芽生長(zhǎng)受抑保持在2 mm左右, 樟腦處理的芽已全部死亡, 薄荷醇處理的薯塊在整個(gè)貯藏期間均無(wú)芽生長(zhǎng)(表2)。據(jù)此得出抑芽能力為薄荷醇>樟腦>萘。

貯藏期間塊莖的重量損失包括呼吸消耗、水分利用和散失等。休眠期間塊莖重量損失小且各處理間差異不大, 隨著對(duì)照萌芽和芽生長(zhǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的消耗, 重量損失明顯, 180 d時(shí)已達(dá)22.78% (表2)。3種物質(zhì)對(duì)芽有不同程度的抑制作用, 減少了物質(zhì)消耗, 使重量損失變緩。180 d時(shí)抑芽能力最強(qiáng)的是薄荷醇, 其損失率約只有對(duì)照的1/3, 具有延長(zhǎng)塊莖貯藏期的潛力。

圖2 貯藏50 d時(shí)各處理的抑芽作用比較

CK: 對(duì)照; NAP: 萘處理; CAM: 樟腦處理; MEN: 薄荷醇處理。

CK: control; NAP: naphthalene treatment; CAM: camphor treatment; MEN: menthol treatment.

表2 貯藏期間各處理的平均芽長(zhǎng)及塊莖重量損失

表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差, 采用新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較, 同一列標(biāo)注不同大小寫字母的值分別在0.01和0.05水平上差異顯著, 縮寫同圖2。

Data in the table are mean ± SD, values followed by different capitals or lowercases within the same column are significantly different at the 0.01 or 0.05 probability levels according to Duncan’s multiple comparison; the abbreviations are the same as those given in Fig. 2.

2.2 差異表達(dá)基因和蛋白分析

由上述結(jié)果可知, 3種物質(zhì)均對(duì)芽的生長(zhǎng)具有直接抑制效應(yīng), 萘的作用較弱, 薄荷醇的致死效應(yīng)則太強(qiáng), 所以選擇樟腦作進(jìn)一步研究。芽長(zhǎng)1~2 mm是塊莖解除休眠萌芽的標(biāo)志, 前期體視鏡檢表明直接處理萌芽塊莖3 d造成頂端褐化, 說(shuō)明芽開始受抑制, 試驗(yàn)檢測(cè)此時(shí)的mRNA和蛋白變化, 以探尋樟腦抑芽效應(yīng)早期在分子層面的影響。通過(guò)RNA-seq檢測(cè)到23,553個(gè)基因, 其中有1227個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào), 299個(gè)顯著下調(diào); 用iTRAQ鑒定出2510個(gè)蛋白, 處理共造成296個(gè)蛋白顯著上調(diào), 204個(gè)顯著下調(diào)。

2.2.1 qRT-PCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果 為驗(yàn)證RNA-seq測(cè)序結(jié)果的可靠性, 選擇19個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR, 由圖3可知, 兩種方式檢測(cè)到基因表達(dá)變化趨勢(shì)相似, 相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9260**, 說(shuō)明RNA-seq獲得的基因表達(dá)信息具有較高的準(zhǔn)確性和可信度。但qRT-PCR驗(yàn)證iTRAQ的蛋白表達(dá)則不一致, 有2個(gè)基因的表達(dá)變化趨勢(shì)在轉(zhuǎn)錄和蛋白層面上出現(xiàn)相反情況(結(jié)果未列出)。推測(cè)蛋白合成、加工修飾滯后于mRNA轉(zhuǎn)錄, 兩者在時(shí)間和空間上的差異造成變化趨勢(shì)的不同步, qRT-PCR不適合用于驗(yàn)證iTRAQ。

圖3 熒光定量驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

2.2.2 差異表達(dá)基因和蛋白的GO、KEGG分析

Gene Ontology(GO)是一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系, 分為生物過(guò)程(biological process, BP)、細(xì)胞組成(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)。將差異基因和蛋白通過(guò)GO富集分析, 在1526個(gè)差異表達(dá)基因中, 分別有712、622和780個(gè)被注釋到BP、CC和MF條目中, 而差異蛋白則分別注釋到289、129和361個(gè)。通過(guò)RNA-seq技術(shù)找出的差異基因編碼蛋白顯著富集的GO條目(<0.05)表明, 差異蛋白主要在膜和細(xì)胞周圍, 具有氧化還原酶活性、糖基轉(zhuǎn)移酶活性、鐵離子結(jié)合等功能, 主要參與響應(yīng)刺激、脅迫、防御反應(yīng)等過(guò)程。與轉(zhuǎn)錄組信息相比, 蛋白組可提供更下游的信息, 即直接起作用或受影響的蛋白。差異蛋白在細(xì)胞器內(nèi)膜、線粒體內(nèi)膜、染色體等多個(gè)部位均有分布。與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果相似, 這些蛋白具有氧化還原酶活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性, 同樣參與響應(yīng)刺激、脅迫和防御反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄和蛋白水平都表明樟腦引起了芽響應(yīng)刺激、脅迫和防御反應(yīng), 從分子水平上證明僅處理3 d即對(duì)芽產(chǎn)生了不利影響(圖4)。

通過(guò)KEGG分析, 差異表達(dá)基因共富集到113個(gè)代謝通路, 其中18個(gè)達(dá)顯著水平(<0.05), 表3列出了前10個(gè)通路。除次生代謝物生物合成外, 植物病原菌互作通路富集的基因最多, 其中的病程相關(guān)蛋白STH-2、PR2和轉(zhuǎn)錄因子WRKY75在mRNA和蛋白水平都升高。谷胱甘肽代謝通路富集的24個(gè)基因中, 有 22個(gè)均編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶并上調(diào)表達(dá), 已知谷胱甘肽作為生物體內(nèi)的一種重要抗氧化劑, 其主要作用是清除自由基, 保護(hù)蛋白質(zhì)和酶等分子中的巰基, 相關(guān)酶的mRNA上調(diào)可以合成更多的抗氧化物質(zhì)。二苯乙烯、黃酮類化合物等植物次生代謝產(chǎn)物具有抗氧化、抑菌等多種生理活性[17]。本試驗(yàn)中, 樟腦處理使上調(diào)表達(dá)基因顯著富集到異黃酮、二苯乙烯類、黃酮和黃酮醇的生物合成通路, 相關(guān)基因如大豆異黃酮7-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因、類黃酮3’-單加氧酶基因、反式白藜蘆醇-di-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)均極顯著升高。由此推測(cè)塊莖首先通過(guò)促進(jìn)合成不同種類的保護(hù)性物質(zhì), 緩解處理引起的活性氧紊亂來(lái)應(yīng)對(duì)脅迫。

圖4 樟腦處理的差異表達(dá)基因和蛋白的顯著GO富集

iTRAQ測(cè)得的差異蛋白顯著富集到8個(gè)代謝通路, 核糖體(ko03010)、苯丙素生物合成(ko00940)、過(guò)氧化物酶體(ko04146)等與保護(hù)性次生物質(zhì)合成、抗氧化相關(guān)通路中的蛋白上升, 而參與正常生理功能的泛素介導(dǎo)蛋白水解(ko04120)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工(ko04141)等通路中的蛋白下降, 說(shuō)明處理3 d已影響到正常的蛋白代謝和生理功能。

2.2.3 差異蛋白和mRNA關(guān)聯(lián)分析 將iTRAQ檢測(cè)到的2510個(gè)蛋白在轉(zhuǎn)錄組中進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析, 其中458個(gè)差異蛋白對(duì)應(yīng)的mRNA沒(méi)有顯著變化, 32個(gè)變化一致, 10個(gè)變化相反, 還有78個(gè)僅在mRNA水平變化, 也說(shuō)明通過(guò)RNA-seq檢測(cè)到的1526個(gè)顯著表達(dá)變化的mRNA中, 僅有42個(gè)對(duì)應(yīng)的蛋白變化, 其余蛋白則沒(méi)有變化或沒(méi)有檢測(cè)到。

在兩水平變化趨勢(shì)相同的基因主要參與響應(yīng)逆境、刺激、氧化脅迫、過(guò)氧化氫分解代謝、防御反應(yīng)等生物過(guò)程, 發(fā)揮過(guò)氧化物酶活性、抗氧化活性、氧化還原活性等功能(圖5)。關(guān)聯(lián)基因的KEGG分析表明, 樟腦短期處理主要引起苯丙素生物合成(ko00940)通路中的多數(shù)基因表達(dá)上調(diào), 相關(guān)蛋白升高。已知苯丙素生物合成的代謝產(chǎn)物包括木質(zhì)素合成所需單體, 如香豆醇、松泊醇、5-羥基松柏醇、芥子醇, 而木質(zhì)素是保護(hù)植物體的第一道防線表皮和細(xì)胞壁的重要組成物質(zhì)。樟腦處理芽3 d使這些物質(zhì)合成的酶表達(dá)量升高, 有利于表皮的合成和修復(fù), 推測(cè)是前期抵抗外源侵害的重要響應(yīng)方式之一。

2.3 貯藏期間抑芽物質(zhì)對(duì)關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

根據(jù)差異基因的變化幅度和主要富集的代謝通路信息, 選擇參與保護(hù)性物質(zhì)合成、生長(zhǎng)發(fā)育、植物病原菌互作的基因12個(gè), 檢測(cè)它們?cè)谡聊X、薄荷醇處理下隨貯藏時(shí)間的變化模式, 進(jìn)一步明確兩種抑芽物質(zhì)的作用效應(yīng)。

2.3.1 參與細(xì)胞壁代謝、表皮物質(zhì)合成基因的表達(dá)

果膠是植物細(xì)胞壁的主要構(gòu)成物質(zhì), 果膠裂解酶(PEL)、果膠酯酶(PME)和多聚半乳糖醛酸酶(PG)參與果膠代謝, 從而導(dǎo)致胞壁降解, 細(xì)胞分離, 組織軟化。已知果實(shí)成熟過(guò)程中這些基因的表達(dá)量和酶活性顯著升高, 使果實(shí)軟化。塊莖貯藏過(guò)程中、表達(dá)量隨貯藏時(shí)間升高, 并在萌芽時(shí)達(dá)到最高值, 分別為0 d時(shí)的94、85、133倍(圖6), 說(shuō)明塊莖休眠解除過(guò)程伴隨薯肉貯藏細(xì)胞的胞壁軟化, 推測(cè)這更利于物質(zhì)運(yùn)輸和營(yíng)養(yǎng)供給。

樟腦處理下, 這3個(gè)基因的表達(dá)量在前期呈波動(dòng)變化, 隨著塊莖解除休眠萌芽, 樟腦處理抑芽的同時(shí)使得這些基因的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于同期對(duì)照, 49 d時(shí)只有同期對(duì)照的1.77%、18.19%和15.17%, 但都高于0 d的表達(dá)量。說(shuō)明樟腦處理使芽的生長(zhǎng)受抑, 對(duì)貯藏細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求減少, 因此參與胞壁軟化的基因表達(dá)量在貯藏中后期沒(méi)有急劇上升。薄荷醇處理下, 除在21 d時(shí)升至對(duì)照同等水平外, 其余時(shí)期各基因的表達(dá)量均保持極低水平, 49 d時(shí)與仍處于休眠期的4℃貯藏塊莖的表達(dá)量相似。

圖5 轉(zhuǎn)錄組和蛋白組表達(dá)模式相同的基因GO富集

圖6 抑芽物質(zhì)對(duì)果膠代謝、角質(zhì)、木栓和蠟質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

CK: 對(duì)照; CAM: 樟腦處理; MEN: 薄荷醇處理; CK-4℃: 對(duì)照4℃冷藏; 誤差線為3個(gè)重復(fù)值的標(biāo)準(zhǔn)差。

CK: control; CAM: camphor treatment; MEN: menthol treatment; CK-4℃: control tuber storage at 4℃; the error line was the standard deviation of three repeated values.

新生芽表皮角質(zhì)層的形成對(duì)于防止水分散失和抵御外界脅迫至關(guān)重要, 角質(zhì)層由角質(zhì)、木栓、蠟質(zhì)組成。、、基因參與形成角質(zhì)、木栓和蠟質(zhì)。由圖6可知, 這3個(gè)基因在貯藏期間的變化趨勢(shì)仍是升高, 特別在貯藏后期即休眠解除芽形成時(shí)。樟腦處理在早期引起這些基因表達(dá)量升高且高于同期對(duì)照, 7 d時(shí)和的表達(dá)量是同期對(duì)照的3.17倍和2.88倍, 但隨時(shí)間增加, 這些基因的表達(dá)量沒(méi)有繼續(xù)升高, 而是保持不變或下降, 在35 d之后均低于同期對(duì)照。薄荷醇處理下, 除在7 d外整個(gè)貯藏期間都與0 d時(shí)的表達(dá)量相似或更低。推測(cè)樟腦、薄荷醇處理在早期不同程度地刺激這些基因的表達(dá)上調(diào), 以促進(jìn)保護(hù)層物質(zhì)合成, 抵抗外界脅迫, 但隨時(shí)間增加, 細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞, 影響了這些物質(zhì)合成, 繼而加劇了芽死亡。

2.3.2 生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)模式分析 由圖7可知, 轉(zhuǎn)錄因子GATA4L的編碼基因表達(dá)量隨貯藏時(shí)間呈線性上升, 兩者的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9450, 說(shuō)明它與塊莖休眠解除和萌芽密切相關(guān)。樟腦處理除35 d外其余時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量與0 d的相似, 而薄荷醇處理則更強(qiáng)烈地抑制該基因表達(dá), 整個(gè)貯藏期間都只有0 d時(shí)的2%~8%。

1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶ACO是乙烯形成的關(guān)鍵酶, 隨塊莖休眠的解除表達(dá)量升高, 到萌芽時(shí)為0 d的114倍(圖7)。樟腦處理刺激該基因表達(dá)量提早升高, 7 d時(shí)達(dá)到同期對(duì)照的8.58倍, 但之后沒(méi)有進(jìn)一步上升, 隨著對(duì)照表達(dá)量上升而低于同期對(duì)照, 到49 d時(shí)只有對(duì)照的1.65%。而無(wú)發(fā)芽跡象的薄荷醇處理中,的表達(dá)量始終保持在低水平。

圖7 抑芽物質(zhì)對(duì)生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)的影響

各處理的縮寫同圖6; 誤差線為3個(gè)重復(fù)值的標(biāo)準(zhǔn)差。

The abbreviations of different treatments are the same as those given in Fig. 6; the error line was the standard deviation of three repeated values.

KRPs是細(xì)胞周期蛋白激酶抑制子, 負(fù)調(diào)控細(xì)胞分裂。盡管樟腦抑制萌芽, 但和對(duì)照相比,基因表達(dá)量在貯藏期間相近, 都呈下降趨勢(shì), 在49 d時(shí)的表達(dá)量均下降到0 d時(shí)的1/10。薄荷醇處理使該基因表達(dá)量顯著升高, 在各時(shí)間點(diǎn)均高于同期對(duì)照(1.6~15.9倍)。隨著細(xì)胞分裂負(fù)控基因的表達(dá)下降, 分生組織細(xì)胞分裂加快使休眠解除而萌芽, 推測(cè)薄荷醇通過(guò)提高的轉(zhuǎn)錄本, 起到阻礙細(xì)胞分裂抑制萌芽的作用。

2.3.3 植物病原菌互作相關(guān)基因表達(dá)模式分析

前述分析表明差異表達(dá)基因和蛋白參與防御反應(yīng), 選擇植物病原菌互作通路中的3個(gè)基因, 分析它們?cè)谫A藏期間的表達(dá)變化特點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄因子WRKY75傳遞MPK4信號(hào), 誘導(dǎo)防御相關(guān)基因表達(dá),75的表達(dá)在前期受樟腦和薄荷醇誘導(dǎo), 21 d時(shí)分別升高至0 d的22.53倍和12.23倍, 但在21 d后薄荷醇處理的75表達(dá)量下降并一直保持低水平, 而樟腦處理的75表達(dá)量則在49 d時(shí)升高到0 d的100.55倍。STH-2屬病程相關(guān)蛋白(PRP), 本試驗(yàn)中轉(zhuǎn)錄本在貯藏期間無(wú)明顯變化, 但樟腦處理刺激該基因上調(diào)表達(dá), 7 d 即達(dá)到0 d時(shí)的5.76倍, 在49 d塊莖萌芽時(shí)的表達(dá)量增到0 d的343倍, 薄荷醇處理對(duì)該基因也有一定誘導(dǎo)作用但不如樟腦的明顯。呼吸氧爆發(fā)氧化酶RBOH在互作通路中受鈣調(diào)蛋白激酶激活, 產(chǎn)生活性氧, 引起過(guò)敏反應(yīng), 應(yīng)答外界脅迫[18]。在貯藏中、后期表達(dá)量升高并伴隨塊莖休眠解除, 49 d萌芽時(shí)為0 d的6.87倍; 樟腦處理能刺激該基因上調(diào)表達(dá), 在各時(shí)間點(diǎn)均高于同期對(duì)照, 49 d時(shí)達(dá)到最高值; 薄荷醇處理的最高值出現(xiàn)在第7天, 為0 d的17.76倍之后下調(diào)并保持較低水平(圖8)?？梢钥闯鲞@3個(gè)基因在貯藏期間均受樟腦誘導(dǎo)表達(dá), 并且都在塊莖萌芽時(shí)達(dá)到最高值, 說(shuō)明相對(duì)于休眠塊莖, 這些基因更多地參與代謝更活躍的萌芽階段對(duì)脅迫的響應(yīng), 隨著芽死亡回到低水平。與樟腦不同的是, 薄荷醇能誘導(dǎo)基因在休眠期高表達(dá), 說(shuō)明休眠期的塊莖可能受到薄荷醇較大的刺激作用。

圖8 抑芽物質(zhì)對(duì)植物病原菌互作相關(guān)基因表達(dá)的影響

各處理的縮寫同圖6; 誤差線為3個(gè)重復(fù)值的標(biāo)準(zhǔn)差。

The abbreviations of different treatments are the same as those given in Fig. 6; the error line was the standard deviation of three repeated values.

3 討論

樟腦具有殺蟲、消腫、止痛等多種醫(yī)療作用, 目前尚無(wú)在植物抑芽方面的研究; 薄荷醇可用作飲料和糖果等的賦香劑, 2003年首次發(fā)現(xiàn)它對(duì)離體芽有抑制作用, 但沒(méi)有后續(xù)研究和應(yīng)用[19]。本試驗(yàn)表明, 這兩種物質(zhì)都能抑制塊莖萌芽, 而馬鈴薯自身的抑芽物質(zhì)1,4-二甲基萘的相似物萘的抑芽能力則相對(duì)較弱。樟腦對(duì)塊莖的抑芽效應(yīng)可逆, 具有應(yīng)用于種薯潛力; 薄荷醇的抑芽能力更強(qiáng), 它本身也用于食品, 相對(duì)更安全, 具有用于商品薯貯藏的潛力。本試驗(yàn)采用自然揮發(fā)的處理方式, 所需試劑濃度較高, 下一步可通過(guò)霧化、熏蒸等方法, 增強(qiáng)試劑本身的附著效率來(lái)降低使用濃度以減少成本。

樟腦長(zhǎng)期處理薯塊(50 d)主要引起與生長(zhǎng)發(fā)育組織構(gòu)成相關(guān)的基因下調(diào)表達(dá)[11]。本試驗(yàn)中, 樟腦處理芽3 d引起的上調(diào)基因居多, 它們具有合成保護(hù)性物質(zhì)和抗氧化功能, 主要參與防御反應(yīng)、響應(yīng)逆境脅迫。上述對(duì)比表明, 在與抑芽物質(zhì)接觸早期, 芽組織積極應(yīng)對(duì)脅迫, 而后期芽組織已受侵害甚至死亡, 生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)。無(wú)論是休眠還是萌芽階段, 植物病原菌互作通路中的病程相關(guān)蛋白STH2、PR2、轉(zhuǎn)錄因子WRKY75等的編碼基因表達(dá)量都受樟腦誘導(dǎo)表達(dá), 但萌芽階段的表達(dá)量最高, 說(shuō)明這些基因更多地參與代謝更活躍的萌芽階段對(duì)脅迫的響應(yīng)。關(guān)聯(lián)分析除了找到蛋白與mRNA變化相同的32個(gè)基因, 多數(shù)基因表現(xiàn)出變化不同步現(xiàn)象, 在以qRT-PCR驗(yàn)證蛋白測(cè)序結(jié)果時(shí)也發(fā)現(xiàn)兩者變化不同步, 這與馬進(jìn)等[20]以qRT-PCR驗(yàn)證iTRAQ不符的情況相同。擬南芥的天冬氨酸蛋白酶豬籠草蛋白酶基因在不同組織如葉片、莖、種子和豆莢均有表達(dá), 認(rèn)為這類蛋白涉及多種功能如細(xì)胞程序性死亡、蛋白前體加工、病害和逆境抗性、葉片衰老等[21]。本試驗(yàn)中天冬氨酸蛋白酶豬籠草蛋白酶1轉(zhuǎn)錄下調(diào)而蛋白升高, 推測(cè)上述現(xiàn)象是轉(zhuǎn)錄和翻譯在時(shí)間上不同步, 蛋白后期加工修飾造成了其變化滯后于轉(zhuǎn)錄應(yīng)答, 使得mRNA變化已趨于平穩(wěn)或下調(diào)后, 蛋白水平才上調(diào)以抵抗外界脅迫。

乙烯是植物的內(nèi)源激素之一, 在調(diào)節(jié)衰老、果實(shí)成熟以及器官脫落等過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用[22]。Coleman和Dioxide[23]研究表明外源乙烯能降低塊莖的脫落酸含量, 促進(jìn)休眠的解除, Hartmann等[24]研究證實(shí)休眠塊莖分生組織活化與生長(zhǎng)素及乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控等的轉(zhuǎn)錄變化密切相關(guān)。將乙烯和典型的催芽劑赤霉素共同處理馬鈴薯促進(jìn)長(zhǎng)休眠品種萌芽[25]。本試驗(yàn)證實(shí)塊莖貯藏過(guò)程伴隨乙烯合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的百倍增加, 從mRNA水平驗(yàn)證乙烯合成是塊莖解除休眠所經(jīng)生理過(guò)程。乙烯可啟動(dòng)果實(shí)代謝發(fā)生質(zhì)的變化, 如淀粉水解為糖、多聚半乳糖醛酸酶含量上升引起的組織軟化、香氣成分的合成等, 是果實(shí)成熟的重要啟動(dòng)因子。用乙烯處理芒果、玫瑰花等均觀察到基因轉(zhuǎn)錄本增加和酶活性升高及果膠增溶現(xiàn)象[26-27]。馬鈴薯塊莖休眠解除過(guò)程與果實(shí)成熟有相似之處, 兩者都涉及淀粉的降解, 貯藏細(xì)胞胞壁的軟化和分解等。本試驗(yàn)中乙烯合成關(guān)鍵酶和果膠降解酶表達(dá)量都隨著貯藏時(shí)間而升高, 推測(cè)塊莖休眠解除過(guò)程中合成乙烯并促進(jìn)胞壁降解相關(guān)酶的基因表達(dá), 加快營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸, 這可能也是貯藏后期薯肉軟化的原因之一。樟腦和薄荷醇處理抑制了這些基因的表達(dá)使塊莖細(xì)胞壁在貯藏期間保持更好地完整性, 有效降低水分散失和保持薯塊硬度。

屬GATA轉(zhuǎn)錄因子家族, 已知擬南芥GATA家族成員有29個(gè), 參與種子萌發(fā)、下胚軸伸長(zhǎng)、葉序和花器官起始、開花和衰老等生理功能[28]。基因與擬南芥GATA家族中的、相似性最高, 但它們編碼的氨基酸序列相似性也僅有50%。則能介導(dǎo)油菜素內(nèi)酯和光信號(hào)的相互交流, 參與形態(tài)建成[29]。通過(guò)融合抑制子基因沉默技術(shù)抑制下游靶基因轉(zhuǎn)錄, 轉(zhuǎn)基因擬南芥在缺氮脅迫下有更高的根毛密度和健壯的地上部, 認(rèn)為參與根系發(fā)育[30]。本試驗(yàn)中表達(dá)量與塊莖生理狀態(tài)的轉(zhuǎn)變密切相關(guān), 它在塊莖萌芽中的作用以及在功能上是否與擬南芥有相似性還需要進(jìn)一步研究。KRPs通過(guò)抑制活化的CYCD-CDKA復(fù)合物, 阻礙細(xì)胞分裂由G1期向S期的過(guò)渡[31]。提高KRPs表達(dá)會(huì)造成生長(zhǎng)緩慢、器官變小、結(jié)實(shí)下降; 反之則植株器官、種子變大[32-33]。Campbell等[10]利用芯片和定量RT-PCR證實(shí)馬鈴薯產(chǎn)生的揮發(fā)性抑芽物1,4-二甲基萘是通過(guò)增加和的轉(zhuǎn)錄本阻礙細(xì)胞分裂達(dá)到抑芽效果的。本試驗(yàn)中薄荷醇處理同樣提高了的轉(zhuǎn)錄本, 并表現(xiàn)出較強(qiáng)抑芽作用, 推測(cè)兩者有相似的作用機(jī)制。

低濃度晚疫病菌孢子侵染時(shí)馬鈴薯STH-2蛋白在抗病品種中的升高速度快于感病品種, 積累量也高于后者, 將其歸為病程相關(guān)蛋白PRP, 但通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)過(guò)量表達(dá)該基因并不能增強(qiáng)植株的晚疫病抗性, 但可提高馬鈴薯細(xì)胞對(duì)鹽和滲透脅迫的耐性[34-36]。最近的研究表明青枯病菌侵染時(shí), STH-2蛋白在抗病品種中大量積累[37]。上述研究說(shuō)明STH-2參與馬鈴薯生物和非生物脅迫反應(yīng), 但具體功能和作用方式仍不清楚。本試驗(yàn)中, 樟腦處理不僅引起萌芽塊莖STH-2轉(zhuǎn)錄本和蛋白水平極大的升高, 同時(shí)植物病原菌互作通路中的病程相關(guān)蛋白PR2、轉(zhuǎn)錄因子WRKY75等108個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平也升高, 推測(cè)該處理引起塊莖產(chǎn)生與抵抗病菌侵染相似的應(yīng)答。

通過(guò)上述分析, 認(rèn)為樟腦處理首先引起防御反應(yīng), 使角質(zhì)、蠟質(zhì)等表皮保護(hù)層物質(zhì)和黃酮、谷胱苷肽等抗菌、抗氧化物質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào), 抵抗逆境脅迫; 隨著樟腦處理傷害的加劇, 這些物質(zhì)合成基因的表達(dá)下降, 與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)受抑, 但植物病原菌互作通路中的各基因表達(dá)量進(jìn)一步升高, 引起與抵抗病原菌侵染相似的應(yīng)激反應(yīng), 芽逐漸壞死(圖9)。薄荷醇處理的變化模式較為單一, 在整個(gè)貯藏期間表達(dá)量都較低, 除了引起和基因的表達(dá)量呈現(xiàn)出不同于樟腦處理的升高, 說(shuō)明它和樟腦的抑芽機(jī)制不同。推測(cè)它對(duì)細(xì)胞周期蛋白的抑制作用是阻止塊莖萌芽的重要原因, 而涉及的其他響應(yīng)基因和生理過(guò)程, 還需進(jìn)一步研究。

圖9 樟腦作用于塊莖引起的響應(yīng)模式推測(cè)

實(shí)線箭頭: 處理與同期對(duì)照相比上調(diào); 虛線箭頭: 處理與同期對(duì)照相比下調(diào), 箭頭粗細(xì)代表變化程度。

Solid arrows: expression levels up-regulated compared with control; dotted arrows: expression levels down-regulated compared with control, the size of the arrow represented the degree of variability.

4 結(jié)論

樟腦和薄荷醇均能抑制生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá), 使萌發(fā)的芽死亡, 降低貯藏?fù)p耗。樟腦處理早期引發(fā)防御反應(yīng), 上調(diào)表達(dá)參與角質(zhì)、抗氧化、抗菌等保護(hù)性物質(zhì)合成的基因; 萌芽時(shí)造成與抵抗病原菌相似的強(qiáng)烈互作。薄荷醇提高表達(dá)阻礙細(xì)胞分裂是分生組織壞死的原因之一。

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Suppression mechanism of volatile sprout-inhibitors on potato tuber sprouting

ZOU Xue1,2, DING Fan1, YU Jin-Long1, PENG Jie2, DENG Meng-Sheng2, WANG Yu2, LIU Li-Fang1, YU-HAN Kai-Zong1, CHEN Nian-Wei1, and WANG Xi-Yao2,*

1Mianyang Academy of Agricultural Sciences, Mianyang 621023, Sichuan, China;2College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, Sichuan, China

Tuber sprouting losses commercial value. In this experiment, the sprout inhibition abilities of naphthalene, camphor, menthol were researched and the acting mechanism by RNA-seq, iTRAQ was explained. The inhibition abilities showed a trend of menthol > camphor > naphthalene. The metabolic consumption was reduced due to sprouting inhibition and the tuber weight loss of menthol treatment was only 36% of the control loss in 180 days storage. Compared with the control, about 1227 (299) and 296 (204) genes and proteins whose expression levels were significantly up-regulated (or down-regulated) were detected respectively in sprouting tuber with camphor treatment for three days. Those genes and proteins mainly involved in response to stimulus and defense response. Transcripts of,,related to pectin degradation,,,related to cutin synthesis,related to synthesis of ethylene, andcoding transcription factor were upward with dormancy release during storage. Relative expression of those genes was stimulated at different degrees in camphor treatment at the early stage, but significantly inhibited at the middle and late stages, showing 0.68%–23.35% of the control expression at 49 days. Menthol treatment maintained these genes with low level expression in tuber, but significantly increased the expression of cell cycle inhibitor geneto 15.9 times of control. Camphor treatment increased transcripts of genes,-,participating in plant-pathogen interaction pathway to the highest levels at sprouting stage. Therefore, we can conclude that camphor and menthol suppress the growth and development of sprouting tuber, eventually kill the bud and reduce the tuber weight loss during storage. Camphor treatment promotes the biosynthesis of protective substances to resist stress at the early stage and strengthen the resistance to pathogen infection at the sprouting stage; menthol treatment prevents bud sprouting by increasingexpression to inhibit cell division.

potato; storage; sprout-inhibitors; transcriptome; proteome

2018-04-29;

王西瑤, E-mail: wxyrtl@163.com

E-mail:zou_xue_2008@aliyun.com

2018-08-20;

2018-09-26.

10.3724/SP.J.1006.2019.84063

本研究由四川省科技廳公益性育種攻關(guān)項(xiàng)目(2016NYZ0032)和綿陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院創(chuàng)新基金項(xiàng)目(cxjj462016-2019)資助。

This study was supported by the Breeding Program for Public Welfare of Science & Technology Department of Sichuan Province (2016NYZ0032), and the Innovation Fund of Mianyang Academy of Agricultural Sciences (cxjj462016-2019).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180921.1036.002.html