兩份玉米CMS-C恢復(fù)系的育性恢復(fù)力測(cè)定及恢復(fù)基因的分子標(biāo)記定位

牟碧濤 趙卓凡 岳 靈 李 川 張 鈞 李章波 申 漢曹墨菊,*

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兩份玉米CMS-C恢復(fù)系的育性恢復(fù)力測(cè)定及恢復(fù)基因的分子標(biāo)記定位

牟碧濤1,2趙卓凡1岳 靈1李 川1張 鈞3李章波3申 漢3曹墨菊1,*

1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所/ 農(nóng)業(yè)部西南玉米生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川成都 611130;2宜賓市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌蠶桑研究所, 四川宜賓 644000;3內(nèi)蒙古真金種業(yè)科技有限公司, 內(nèi)蒙古鄂爾多斯 014300

為了發(fā)掘更多玉米C型不育胞質(zhì)的強(qiáng)恢復(fù)系資源, 本研究對(duì)2份自交系Z16和7250-14-1進(jìn)行了恢復(fù)能力的測(cè)定、恢復(fù)基因的遺傳分析及恢復(fù)基因的分子標(biāo)記定位。結(jié)果表明, Z16和7250-14-1對(duì)C黃早四、C478、C698-3和CMo17均表現(xiàn)為育性恢復(fù), 而對(duì)C48-2則均表現(xiàn)為育性部分恢復(fù)。通過(guò)對(duì)玉米CMS-C不同亞組胞質(zhì)測(cè)交鑒定發(fā)現(xiàn), Z16對(duì)G48-2、EC48-2、ES48-2、RB48-2及類(lèi)48-2均表現(xiàn)為不育性保持, 而7250-14-1對(duì)G48-2、EC48-2、ES48-2表現(xiàn)為育性部分恢復(fù), 對(duì)RB48-2和類(lèi)48-2則表現(xiàn)為不育性保持。Z16和7250-14-1對(duì)CMS-T不育系均表現(xiàn)為不育性保持, 而對(duì)CMS-S不育系則均表現(xiàn)為育性部分恢復(fù)。遺傳分析顯示, Z16對(duì)C478和C黃早四的育性恢復(fù)均受1對(duì)基因控制; 而7250-14-1對(duì)C黃早四及C478的育性恢復(fù)分別受1對(duì)基因及2對(duì)基因控制。利用(C黃早四×Z16)F2、(C黃早四×7250-14-1)F2群體分別對(duì)恢復(fù)基因進(jìn)行分子標(biāo)記定位, 其中Z16的恢復(fù)基因被定位于標(biāo)記B-1至第8染色體短臂末端區(qū)域, 物理距離為494 kb; 7250-14-1的恢復(fù)基因被定位于第8染色體短臂的標(biāo)記B-1和Chr8-86080之間, 物理距離為249 kb。該研究不僅為玉米CMS-C“三系”配套的生產(chǎn)利用提供了恢復(fù)基因資源, 也為玉米CMS-C恢復(fù)基因的克隆及恢復(fù)機(jī)制的研究奠定了一定基礎(chǔ)。

玉米; 細(xì)胞質(zhì)雄性不育; 恢復(fù)基因; 分子標(biāo)記定位

細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)作為“三系”配套雜交制種的重要工具, 在雜交種子的生產(chǎn)以及雜種優(yōu)勢(shì)利用上具有重要應(yīng)用價(jià)值。根據(jù)恢復(fù)專(zhuān)效性, 可將玉米雄性不育胞質(zhì)分為C型(CMS-C)、T型(CMS-T)和S型(CMS-S) 3種類(lèi)型[1]。Pring等[2]根據(jù)線(xiàn)粒體基因組的酶切圖譜將C型胞質(zhì)分為CI (C)、CII (RB、BB及E)和CIII (ES) 3個(gè)亞組。而對(duì)于恢復(fù)基因(restorer gene,)及恢復(fù)系的研究既有助于CMS的不育化制種應(yīng)用, 也有助于對(duì)育性恢復(fù)機(jī)制的探究。迄今, 國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)玉米細(xì)胞質(zhì)雄性不育的育性恢復(fù)進(jìn)行了大量研究, CMS-T的育性恢復(fù)由基因和控制, Duvick等[3]將定位于玉米第3染色體短臂上, Snyder等[4]將定位于玉米第9染色體靠近基因座位的附近區(qū)域。Wise等[5]的進(jìn)一步研究將定位于第3染色體的umc97與umc92之間, 距離umc97為1.1 cM, 將定位在距離umc153為3.8 cM的位點(diǎn)上, Cui等[6]利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法成功克隆得到基因。CMS-S的恢復(fù)主基因?yàn)? Zhang等[7]利用AFLP、SCAR標(biāo)記將定位在第2染色體的長(zhǎng)臂上, 位于標(biāo)記E7P6與E12M7之間, 遺傳距離分別為0.9 cM和1.8 cM。李鵬等[8]利用BC1F1同質(zhì)群體將精細(xì)定位在第2染色體的長(zhǎng)臂上, 位于SSR標(biāo)記A165與CG2之間, 兩標(biāo)記的物理距離為1.4 Mb。此外, Feng等[9]通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn), 除主效恢復(fù)基因外, 在染色體的其他位置上還有近30個(gè)位點(diǎn)與CMS-S的育性恢復(fù)有關(guān)。CMS-C的育性恢復(fù)機(jī)制較為復(fù)雜, Kheyr-Pour等[10]研究表明, C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育的育性恢復(fù)受顯性基因控制; 陳偉程等[11]則認(rèn)為, C型不育系的育性恢復(fù)受2對(duì)具有重疊效應(yīng)的基因控制; Vidakovic等[12-14]提出, 玉米CMS-C的育性恢復(fù)可能受3對(duì)甚至更多的互補(bǔ)基因控制。Sisco等[15]利用RFLP標(biāo)記將玉米自交系A(chǔ)619中的恢復(fù)基因定位在玉米第8染色體的短臂上, 與RFLP標(biāo)記Npi114a連鎖; 湯繼華等[16]利用SSR標(biāo)記同樣將A619的恢復(fù)基因定位于玉米第8染色體的短臂, 與SSR標(biāo)記bnlg2307的遺傳距離為12.3 cM, 同時(shí)通過(guò)對(duì)玉米自交系鳳可1號(hào)的研究, 將恢復(fù)基因定位在玉米第5染色體上, 與SSR標(biāo)記bnlg1346、phi058、bnlg1711連鎖, 遺傳距離分別為1.68 cM、9.87 cM、7.51 cM。此外, Kohls等[17]通過(guò)對(duì)玉米C型不育系B37C與恢復(fù)系K55的研究, 分別在bin 2.09、bin 3.06和bin 7.03 3個(gè)染色體區(qū)段上檢測(cè)到控制CMS-C育性部分恢復(fù)基因的主效QTL。

S型不育系屬于配子體不育, 敗育時(shí)期晚, 育性不穩(wěn)定[18-19], 一定程度上阻礙其在生產(chǎn)上的利用; T型不育系屬于孢子體不育, 敗育時(shí)期早, 敗育徹底, 但由于玉米小斑病T小種的專(zhuān)化侵染, 致使T型不育系的利用被迫停止[20]; 作為孢子體不育的C型不育系不僅敗育早, 且敗育徹底[21], 長(zhǎng)期以來(lái)受到育種家的廣泛關(guān)注, 但目前生產(chǎn)上因缺乏對(duì)CMS-C具有強(qiáng)恢復(fù)力的恢復(fù)系, 致使CMS-C的生產(chǎn)利用受到限制, 因此發(fā)掘、鑒定玉米CMS-C新恢復(fù)源并對(duì)其進(jìn)行基因定位及克隆研究無(wú)疑具有十分重要的意義。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)玉米自交系Z16、7250-14-1對(duì)C黃早四和C478表現(xiàn)為育性完全恢復(fù), 因此本研究一方面通過(guò)廣泛測(cè)交鑒定2份自交系的恢復(fù)力; 另一方面通過(guò)雜交、自交結(jié)合回交進(jìn)行恢復(fù)基因的遺傳分析, 同時(shí)利用F2群體進(jìn)行恢復(fù)基因的分子標(biāo)記定位, 為2份自交系在不育化制種中的生產(chǎn)利用及恢復(fù)基因的克隆提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以同質(zhì)異核、同核異質(zhì)的CMS-C不育系以及CMS-T、CMS-S不育系為母本(表1), 分別與玉米自交系Z16、7250-14-1 (由內(nèi)蒙古真金種業(yè)科技有限公司提供)雜交得到F1, 用于恢保關(guān)系的測(cè)定。以不育系C黃早四、C478為母本, 自交系Z16、7250-14-1為父本, 構(gòu)建相應(yīng)的F2群體; 同時(shí)以黃早四、478作為輪回親本與F1回交, 得到相應(yīng)的回交群體BC1。所有F2和BC1群體用于遺傳分析, (C黃早四×Z16)F2和(C黃早四×7250-14-1)F2作為基因定位群體。

表1 玉米同核異質(zhì)、同質(zhì)異核不育系

1.2 育性鑒定

采用Duvick 5級(jí)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)鑒定育性[22]。對(duì)所有實(shí)驗(yàn)材料單株掛牌, 嚴(yán)格按照Duvick的方法逐株進(jìn)行育性調(diào)查, 調(diào)查時(shí)間為植株整個(gè)散粉期, 每隔1 d調(diào)查1次, 每株至少調(diào)查3次; 采用I2-IK染色法, 于植株散粉期, 在每株雄穗主穗的上、中、下3個(gè)部位分別取1對(duì)小穗, 用固定液FAA固定, 進(jìn)行花粉鏡檢。

1.3 恢復(fù)基因的遺傳分析

于不同年份不同地點(diǎn)種植F2、BC1群體, 統(tǒng)計(jì)各群體中可育株與不育株的分離比例, 并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

1.4 恢復(fù)基因的分子標(biāo)記定位

采用CTAB法[23]提取葉片總DNA, 從F2分離群體中隨機(jī)選取10株完全可育株和10株完全不育株, 等量混合其DNA, 分別構(gòu)建可育基因池和不育基因池, 參照網(wǎng)站https://www.maizegdb.org/上的引物序列信息以及Qu等[24]設(shè)計(jì)的InDel引物信息, 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。利用分布于玉米10條染色體上的1062對(duì)SSR引物及29對(duì)InDel引物在親本間進(jìn)行多態(tài)性引物篩選, 然后經(jīng)混合群體分離分析法(bulked segregant analysis, BSA)對(duì)篩選到的多態(tài)性引物進(jìn)一步篩選, 最后利用獲得的多態(tài)性引物對(duì)F2群體的完全不育單株進(jìn)行基因分型, 尋找與目的基因連鎖的分子標(biāo)記。

基于初步定位的結(jié)果, 從https://www.maizegdb. org/網(wǎng)站上下載定位區(qū)間內(nèi)DNA序列信息, 用SSRHUNTER搜索SSR位點(diǎn), 在https://www.ncbi.nlm. nih.gov/上設(shè)計(jì)SSR引物; 同時(shí), 根據(jù)親本間的DNA序列差異, 利用Oligo 7設(shè)計(jì)InDel引物, 并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴(kuò)大F2群體, 利用新開(kāi)發(fā)的多態(tài)性標(biāo)記及初定位的分子標(biāo)記對(duì)F2群體的所有完全不育單株進(jìn)行基因分型。PCR體系為15 μL, 包括7.5 μL2×PCR Master Mix (由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司提供)、1.5 μLDNA模板、5.0 μLddH2O、10 μmol L–1前后引物各0.5μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃5 min; 95℃50 s, 57℃ 30 s, 72℃40 s, 35個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳, 銀染后, 觀察記錄擴(kuò)增條帶并拍照。

1.5 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

選取F2群體中完全不育單株的分離單株為作圖群體, 將與母本帶型一致的單株記為A, 與父本帶型一致的單株記為B, 雜合帶型的單株記為H。利用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳距離[25], 利用MapMaker 3.0進(jìn)行連鎖數(shù)據(jù)分析, 繪制遺傳圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 恢保關(guān)系測(cè)定

以同質(zhì)異核、同核異質(zhì)的CMS-C不育系以及CMS-T、CMS-S不育系為母本, 自交系Z16、7250-14-1為父本, 分別測(cè)交, 2017年夏季, 將所有測(cè)交組合種植于四川溫江, 每個(gè)組合2行, 每行14株, 對(duì)所有測(cè)交F1進(jìn)行育性鑒定, 部分測(cè)交組合的雄穗育性表現(xiàn)及花粉染色情況如圖1。

2.1.1 自交系Z16的恢保關(guān)系測(cè)定 將同質(zhì)異核及同核異質(zhì)的CMS-C不育系與Z16測(cè)交后代的育性鑒定結(jié)果列入表2, 由表2可知, Z16對(duì)CMo17、C698-3、C黃早四、C478均表現(xiàn)為育性恢復(fù), 各測(cè)交組合的雄穗育性等級(jí)均為V級(jí), 且花粉可染率高達(dá)96.7%以上, 說(shuō)明育性恢復(fù)比較徹底。組合C48-2×Z16的雄穗育性等級(jí)除少數(shù)為II級(jí)外, 大多數(shù)為III級(jí), 同時(shí)花粉可染率也僅為39.0%, 說(shuō)明Z16對(duì)C48-2表現(xiàn)為育性部分恢復(fù)。此外, 所有CMS-C亞組胞質(zhì)測(cè)交組合的雄穗育性等級(jí)均為I級(jí), 其中組合G48-2×Z16、EC48-2×Z16能產(chǎn)生不可染的花粉, 而組合ES48-2×Z16、RB48-2×Z16以及類(lèi)48-2×Z16為無(wú)花粉型, 即不能產(chǎn)生花粉。說(shuō)明Z16對(duì)48-2核背景下的C胞質(zhì)其他亞組胞質(zhì)均不具有育性恢復(fù)能力。

由表3可知, Z16對(duì)TMo17、T698-3均表現(xiàn)為不育性保持, 測(cè)交組合均為無(wú)花粉型。測(cè)交組合SMo17×Z16的雄穗育性等級(jí)多為III級(jí), 花粉可染率僅為22.0%; 而組合S698-3×Z16的雄穗育性等級(jí)為I級(jí), 但花粉可染率達(dá)到29.2%, 表明Z16對(duì)CMS-S表現(xiàn)育性部分恢復(fù)。

圖1 部分測(cè)交組合的育性表現(xiàn)

I: 花藥不外露; II: 花藥外露比例為0~25%; III: 花藥外露比例為25%~50%; IV: 花藥外露比例為50%~75%; V: 花藥外露比例為75%~100%。

I: no emerged of anthers; II: from 0 to 25% anthers emerged; III: more than 25% to 50% anthers emerged; IV: more than 50% to 75% anthers emerged; V: more than 75% anthers emerged.

表2 CMS-C不育系與Z16測(cè)交后代的育性鑒定結(jié)果

I: 花藥不外露; II: 花藥外露比例為0~25%; III: 花藥外露比例為25%~50%; IV: 花藥外露比例為50%~75%; V: 花藥外露比例為75%~100%?！?”代表無(wú)花粉。

I: no emerged of anthers; II: from 0 to 25% anthers emerged; III: more than 25% to 50% anthers emerged; IV: more than 50% to 75% anthers emerged; V: more than 75% anthers emerged. “-” denotes no pollen formed.

表3 CMS-T、CMS-S不育系與Z16測(cè)交后代的育性鑒定結(jié)果

2.1.2 自交系7250-14-1的恢保關(guān)系測(cè)定 由表4可知, 7250-14-1對(duì)CMo17、C698-3、C黃早四以及C478均表現(xiàn)為育性恢復(fù), 各測(cè)交組合的雄穗育性等級(jí)均為V級(jí), 且花粉可染率均超過(guò)91%, 說(shuō)明恢復(fù)徹底; 而測(cè)交組合C48-2×7250-14-1的雄穗育性等級(jí)為III級(jí), 花粉可染率高達(dá)83.3%, 說(shuō)明7250-14-1對(duì)C48-2表現(xiàn)為育性部分恢復(fù)。同時(shí), 7250-14-1對(duì)G48-2、EC48-2及ES48-2均表現(xiàn)為育性部分恢復(fù), 雖然3個(gè)測(cè)交組合的雄穗育性等級(jí)均為III級(jí), 但組合G48-2×7250-14-1、ES48-2×7250- 14-1的花粉可染率超過(guò)94%遠(yuǎn)高于組合EC48-2× 7250-14-1(22.6%)。7250-14-1對(duì)RB48-2和類(lèi)48-2表現(xiàn)為不育性保持, 測(cè)交組合的雄穗育性等級(jí)均為I級(jí), 且花粉均完全不可染。表明7250-14-1對(duì)48-2背景下不同亞組胞質(zhì)的育性恢復(fù)能力不同。

由表5可知, 7250-14-1對(duì)TMo17、T698-3均表現(xiàn)為不育性保持, 且測(cè)交組合均為無(wú)花粉型。對(duì)SMo17、S698-3均表現(xiàn)為育性部分恢復(fù), 測(cè)交組合的雄穗育性等級(jí)均為IV級(jí), 其中組合S698-3× 7250-14-1的花粉可染率為43.9%, 而SMo17×7250- 14-1的花粉可染率僅為14.1%。

2.2 遺傳分析

將不育系C黃早四、C478與恢復(fù)系Z16、7250-14-1組配的F2及BC1群體于2016—2017年分別在云南西雙版納(景洪)、四川溫江及崇州進(jìn)行育性鑒定, 育性調(diào)查結(jié)果見(jiàn)表6和表7。

由表6可知, (C黃早四×Z16)F2及[(C黃早四×Z16)×黃早四]群體中可育單株與不育單株的比例分別符合3∶1和1∶1 (>0.05), (C478×Z16)F2及[(C478×Z16)×478]群體中可育單株與不育單株的比例也分別符合3∶1和1∶1 (>0.05), 說(shuō)明Z16對(duì)C黃早四和C478的育性恢復(fù)均受1對(duì)基因控制。

由表7可知, (C黃早四×7250-14-1)F2和[(C黃早四×7250-14-1)×黃早四]群體中可育單株與不育單株的比例分別符合3∶1和1∶1 (>0.05), 說(shuō)明7250-14-1對(duì)C黃早四的育性恢復(fù)受1對(duì)基因控制;與此同時(shí), (C478×7250-14-1)F2和[(C478×7250-14-1)×478]群體可育單株與不育單株的比例分別符合9∶7和1∶3 (>0.05), 說(shuō)明7250-14-1對(duì)C478的育性恢復(fù)受2對(duì)基因控制, 且呈顯性互補(bǔ)關(guān)系。

表4 CMS-C不育系與7250-14-1測(cè)交后代的育性鑒定結(jié)果

表5 CMS-T、CMS-S不育系與7250-14-1測(cè)交后代的育性鑒定結(jié)果

c2(0.05, 1)=3.84.

c2(0.05, 1)=3.84.

2.3 恢復(fù)基因的分子標(biāo)記定位

2.3.1 自交系Z16恢復(fù)基因的分子標(biāo)記定位 選用位于玉米10條染色體上的1062對(duì)SSR引物以及29對(duì)InDel引物, 對(duì)親本C黃早四與Z16進(jìn)行多態(tài)性分析, 共有404對(duì)引物在兩親本間呈現(xiàn)多態(tài)性。利用BSA法對(duì)篩選到的多態(tài)性引物進(jìn)一步篩選, 發(fā)現(xiàn)位于第8染色體短臂上的InDel引物IDP8573、Chr8-1330080、TIDP5557、Chr8-86080在可育基因池與不育基因池之間呈現(xiàn)多態(tài)性(引物信息見(jiàn)附表1)。利用這些多態(tài)性引物對(duì)(C黃早四×Z16)F2群體中的156株完全不育單株進(jìn)行基因分型發(fā)現(xiàn), TIDP5557檢測(cè)到4個(gè)交換單株, Chr8-86080未檢測(cè)到交換單株, 因此初步將Z16的恢復(fù)基因定位于標(biāo)記TIDP5557至第8染色體短臂末端的區(qū)域(圖2)。基于初定位結(jié)果, 在標(biāo)記TIDP5557至第8染色體短臂末端區(qū)域內(nèi)新開(kāi)發(fā)了4對(duì)分子標(biāo)記(附表1), 利用新開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記以及初定位的連鎖標(biāo)記對(duì)(C黃早四×Z16)F2群體中的798株完全不育單株進(jìn)行基因分型。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 標(biāo)記B-1檢測(cè)到2個(gè)交換單株, 而B(niǎo)-6-1、B-2以及Chr8-86080均未檢測(cè)到交換單株, 于是將Z16的恢復(fù)基因定位于分子標(biāo)記B-1至第8染色體短臂末端的區(qū)域, 該區(qū)域的物理范圍為494 kb (圖2)。

圖2 自交系Z16所含Rf基因在第8染色體上的連鎖圖譜

2.3.2 自交系7250-14-1恢復(fù)基因的分子標(biāo)記定位

選用位于玉米10條染色體上的1062對(duì)SSR引物和29對(duì)InDel引物在親本C黃早四與7250-14-1之間進(jìn)行多態(tài)性分析, 共有389對(duì)引物在兩者間存在多態(tài)性。利用BSA法對(duì)篩選到的多態(tài)性引物進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn), 位于第8染色體短臂上的InDel引物Chr8-1330080、IDP7866、IDP500、IDP8319、Chr8- 398180及Chr8-86080在可育基因池與不育基因池之間呈現(xiàn)多態(tài)性(引物信息見(jiàn)附表2)。利用這些多態(tài)性引物對(duì)(C黃早四×7250-14-1)F2群體中的143株完全不育單株進(jìn)行基因分型發(fā)現(xiàn), 引物IDP8319檢測(cè)到1個(gè)交換單株, 而Chr8-398180、Chr8-86080均未檢測(cè)到交換單株, 因此初步將7250-14-1的恢復(fù)基因定位于IDP8319至第8染色體短臂末端的區(qū)域(圖3)?；诔醵ㄎ唤Y(jié)果, 在標(biāo)記IDP8319至第8染色體短臂末端區(qū)域內(nèi)新開(kāi)發(fā)了4對(duì)分子標(biāo)記(附表2), 利用新開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記以及初定位的連鎖標(biāo)記對(duì)(C黃早四×7250-14-1)F2群體中的432株完全不育單株進(jìn)行基因分型。發(fā)現(xiàn)標(biāo)記B-1檢測(cè)到4個(gè)交換單株, Chr8-86080檢測(cè)到1個(gè)交換單株, 且利用B-1和Chr8-86080檢測(cè)到的交換單株不相同, 因此將7250-14-1的恢復(fù)基因定位于標(biāo)記B-1與Chr8-86080之間, 物理距離為249 kb (圖3)。

3 討論

“三系”配套是植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育應(yīng)用于不育化制種的前提。而其中恢復(fù)系的選育及恢復(fù)力的表現(xiàn)又直接關(guān)系到不育化制種的應(yīng)用成效。本研究發(fā)現(xiàn), Z16和7250-14-1除了對(duì)玉米CMS-C的CI亞組中的C48-2表現(xiàn)為部分恢復(fù)外, 對(duì)CI亞組的C478、C黃早四、C698-3等均表現(xiàn)為完全恢復(fù)。自交系A(chǔ)619是含有主效恢復(fù)基因的強(qiáng)恢復(fù)系, 它不僅對(duì)C478、C黃早四、C698-3表現(xiàn)為強(qiáng)恢復(fù), 對(duì)C48-2也同樣表現(xiàn)為強(qiáng)恢復(fù)[26]?？梢?jiàn), Z16和7250-14-1對(duì)CMS-C不育系的育性恢復(fù)能力不同于A619。通過(guò)對(duì)玉米CMS-C不同亞組胞質(zhì)的恢保關(guān)系測(cè)定發(fā)現(xiàn), Z16不能恢復(fù)RB48-2、ES48-2、G48-2、EC48-2、類(lèi)48-2的育性; 7250-14-1能夠部分恢復(fù)ES48-2、G48-2、EC48-2的育性, 但對(duì)RB48-2、類(lèi)48-2則表現(xiàn)為不育性保持。從這個(gè)意義上來(lái)說(shuō)Z16與7250-14-1對(duì)玉米CMS-C的育性恢復(fù)能力也存在差異。

圖3 自交系7250-14-1所含Rf基因在第8染色體上的連鎖圖譜

本研究基于2個(gè)不育系背景下的F2及BC1群體的遺傳分析發(fā)現(xiàn), Z16對(duì)C黃早四和C478的育性恢復(fù)均受1對(duì)基因控制, 而7250-14-1對(duì)C黃早四的育性恢復(fù)受1對(duì)基因控制, 但對(duì)C478則表現(xiàn)為受2對(duì)基因控制。于是我們選擇不育系C黃早四做母本, Z16及7250-14-1分別做父本, 配制F2作為基因定位群體, 分別對(duì)Z16及7250-14-1中的主效恢復(fù)基因進(jìn)行分子標(biāo)記定位。最終將Z16和7250-14-1的主效恢復(fù)基因均定位于第8染色體短臂末端, 且定位區(qū)間包含了候選基因[27]。2份自交系的定位區(qū)間存在較大的重疊區(qū)域, 參照B73序列(http://ensembl.gramene.org/Zea_mays/Info/Index), 發(fā)現(xiàn)重疊區(qū)間內(nèi)共有5個(gè)注釋基因, 其中編碼過(guò)氧化物酶1前體蛋白,編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子,編碼S-腺苷甲硫氨酸合酶1,編碼SBP結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白,編碼類(lèi)PTI1酪氨酸蛋白激酶3。而且,為已經(jīng)報(bào)道的玉米核雄性不育基因[28]。分子標(biāo)記定位結(jié)果顯示3個(gè)恢復(fù)材料Z16、7250-14-1及A619的恢復(fù)基因均被定位于第8染色體的短臂上, 但3個(gè)恢復(fù)材料對(duì)C型不育系的恢復(fù)能力存在差別?；谝陨辖Y(jié)果我們推測(cè), 3個(gè)自交系都含有基因, 但在不同核背景下其發(fā)揮作用的效應(yīng)不同; 或者它們分別含有不同的恢復(fù)基因, 但卻在第8染色體短臂上成簇存在。關(guān)于恢復(fù)基因在染色體上成簇存在的現(xiàn)象在其他作物上已有報(bào)道[29-30]。

本研究新鑒定出的玉米CMS-C強(qiáng)恢復(fù)系Z16和7250-14-1, 雖然對(duì)玉米CMS-C的CI亞組具有相同的恢復(fù)力, 但對(duì)CII和CIII亞組的恢復(fù)能力卻存在差異。Z16、7250-14-1對(duì)玉米CMS-C的恢復(fù)能力也有別于自交系A(chǔ)619?？梢?jiàn)玉米細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的育性恢復(fù)既受測(cè)驗(yàn)系的核基因影響, 也受不育系的核背景及不育細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型影響。因此在將不育化制種應(yīng)用于生產(chǎn)時(shí), 對(duì)恢復(fù)系的選育, 既要考慮到不育系的核背景, 也要考慮所用C型不育的亞組胞質(zhì)類(lèi)型。

4 結(jié)論

自交系Z16、7250-14-1均能恢復(fù)不同核背景下的CI胞質(zhì), 其中對(duì)大多數(shù)核背景下的CI胞質(zhì)表現(xiàn)為育性完全恢復(fù), 僅對(duì)48-2背景下的CI胞質(zhì)表現(xiàn)為育性部分恢復(fù)。Z16對(duì)C黃早四、C478的育性恢復(fù)受1對(duì)基因控制; 7250-14-1對(duì)C黃早四的育性恢復(fù)受1對(duì)基因控制, 而對(duì)C478的育性恢復(fù)則受2對(duì)基因控制, 且顯現(xiàn)互補(bǔ)關(guān)系。2份自交系的恢復(fù)基因均被定位于第8染色體短臂上, 其中Z16所含恢復(fù)基因被定位于分子標(biāo)記B-1至第8染色體短臂末端區(qū)域, 物理距離為494 kb; 7250-14-1所含恢復(fù)基因被定位于分子標(biāo)記B-1與Chr8-86080之間, 物理距離為249 kb。

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附表1 用于Z16恢復(fù)基因定位的多態(tài)性引物

Supplementary table 1 Polymorphic markers for restoring gene mapping in Z16

引物Primer引物類(lèi)型Primer type正向序列Forward sequence (5'–3')反向序列Reverse sequence (5'–3') Chr8-86080InDelCGTCGTTGAGGTGAGAAGAGCTCCGAACCTGATCCGAGTA B-2InDelACGAATACGATACGTAGCCAGTGAATCTGCGGTGAACAAA B-6-1InDelGGATGGAATATATAAAGTTTGCTGGCTCATTACCTTGGTGTCA B-1InDelGATCGTTCCGGCCCAAGAAGTAGCCGTGGAGTTGGTAGCC m-1SSRCATTGACCGGGGTAGGAAGTCATTGACCGGGGTAGGAAGT TIDP5557InDelCATGAGATCAACGGGATGCAGTAGAGATCCGGGAGGTGG Chr8-1330080InDelCCAAGTTGGATACAACGACAGAAGAAGCAACGTCTGCAGGAT IDP8573InDelCGAGTCAGTTGCTTACGGGAATTGCCGAGTGGATACAGG

附表2 用于7250-14-1恢復(fù)基因定位的多態(tài)性引物

Supplementary table 2 Polymorphic markers for restoring gene mapping in 7250-14-1

引物Primer引物類(lèi)型Primer type正向序列Forward sequence (5'–3')反向序列Reverse sequence (5'–3') m-10SSRAGCGCTCGATTCCTGTAGTGGGGTGTCGTTGGTTGGGATT Chr8-86080InDelCGTCGTTGAGGTGAGAAGAGCTCCGAACCTGATCCGAGTA B-2InDelACGAATACGATACGTAGCCAGTGAATCTGCGGTGAACAAA B-6-2InDelCCAATGTTTTGATGGAAGTCCTAATTGCCATGTTCTTACCTGT B-1InDelGATCGTTCCGGCCCAAGAAGTAGCCGTGGAGTTGGTAGCC Chr8-398180InDelGCCAGTTCGGAGACAGGATACCGCCATCCAATTAACAAG IDP8319InDelTTGACCCTCCTGTTACGTGCGAGCATGGACCACATGACC IDP500InDelCACTGCCGTAGAGTAGTGCGGGCTTCAAGATCAGTCCG IDP7866InDelGGACGAAGCGATCGAGTACCAGATGAGGGAAGTGAGCAGC Chr8-1330080InDelCCAAGTTGGATACAACGACAGAAGAAGCAACGTCTGCAGGAT

Identification of fertility restoration and molecular mapping of restorer genes in two maize restore lines of CMS-C

MOU Bi-Tao1,2, ZHAO Zhuo-Fan1, YUE Ling1, LI Chuan1, ZHANG Jun3, LI Zhang-Bo3, SHEN Han3, and CAO Mo-Ju1,*

1Maize Research Institute, Sichuan Agricultural University / Key Laboratory of Maize Biology and Genetics and Breeding of Southwest China, Ministry of Agriculture, Chengdu 611130, Sichuan, China;2Edible Fungus Sericulture Research Institute, Yibin Academy of Agricultural Sciences, Yibin 644000, Sichuan, China;3Inner Mongolia Zhenjin Seed S&T Co., Ltd, Ordos 014300, Inner Mongolia, China

The objective of the present study was to identify novel and powerful restorer lines for CMS-C. So maize inbred lines Z16 and 7250-14-1 were crossed with both isonuclear alloplasmic and isoplasmic allonuclear CMS-C, CMS-T, and CMS-S male sterile lines. Self-cross and back-cross were conducted for some of the fertility restored F1for genetic analysis and restorer gene mapping. Male fertility expression was investigated for all the F1, F2and backcross populations, showing that Z16 and 7250-14-1 could restore the fertility for C Huangzaosi, C478, C698-3, and CMo17 completely, and partly restore the fertility for C48-2. Z16 could not restore the fertility for G48-2, EC48-2, ES48-2, RB48-2, and Lei48-2, while 7250-14-1 could partly restore the fertility for G48-2, EC48-2, and ES48-2, and maintain the sterility for RB48-2 and Lei48-2. Both Z16 and 7250-14-1 couldn’t restore the fertility of CMS-T, and partly restore the fertility for CMS-S. Genetic analysis showed that the fertility restoration was controlled by a pair of dominant genes for Z16 when crossed with C478 or C Huangzaosi. But for 7250-14-1, the fertility restoration was controlled by a pair of dominant genes for C Huangzaosi, and two pairs of complementary dominant genes for C478. Both of the restorer genes for Z16 and 7250-14-1 were mapped on the short arm of chromosome 8 by molecular markers. For Z16, it was mapped within a physical distance of 494 kb from the marker B-1 to the end of the chromosome, and for 7250-14-1, it was located between B-1 and Chr8-86080, with physical distance of 249 kb. This study not only provides some information for the practical application of Z16 and 7250-14-1, but also lays a foundation for the cloning and functional analysis of restorer genes.

maize; cytoplasmic male sterility; restorer gene; molecular mapping

2018-04-16;

2018-10-08;

2018-11-05.

10.3724/SP.J.1006.2019.083033

曹墨菊, E-mail: caomj@sicau.edu.cn

E-mail: m602817828@163.com

本研究由“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0101206)資助。

This study was supported by the National Thirteenth Five-Year National Research and Development Program (2016YFD0101206).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20181101.1018.006.html