線性探針技術(shù)檢測肺結(jié)核患者耐藥情況臨床評價(jià)

侯 婧，韓 ，張 艷，孟 婧

（安徽省胸科醫(yī)院，安徽 合肥 230022）

耐藥肺結(jié)核患者的治療周期長、治療成本高、治愈率低，該病患者的增多[1]，進(jìn)一步增大了傳播概率，也加重了社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。然而，傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)法培養(yǎng)結(jié)核分支桿菌需要8周[2]，進(jìn)一步進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱藥敏試驗(yàn))診斷約需3個(gè)月，無法滿足及時(shí)診斷和早期合理用藥的需要[3]。線性探針（HAIN）技術(shù)通過對耐藥相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增和反向雜交，對利福平的耐藥基因rpoB和異煙肼的耐藥基因KatG及inhA進(jìn)行檢測，從而可判斷結(jié)核分枝桿菌對利福平、異煙肼的耐藥性，并能在24 h內(nèi)上報(bào)結(jié)果，已被世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦為一線抗結(jié)核藥藥敏試驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[4]。本研究中以結(jié)核分枝桿菌的羅氏培養(yǎng)和絕對濃度藥敏法為“金標(biāo)準(zhǔn)”，對HAIN技術(shù)檢測利福平和異煙肼耐藥性的效果進(jìn)行評價(jià)，從而評估HAIN技術(shù)用于抗結(jié)核治療的臨床價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料

選取我院2016年1月至6月痰抗酸桿菌涂片陽性的住院患者 251例，年齡 15～85歲，平均（47．67±18．33）歲；男 187 例（74．50% ），平均年齡（50．17 ±17．32）歲 ；女 64 例 （25．50% ），平 均 年 齡 （40．39±19．40）歲。

1．2 試劑及儀器

羅氏培養(yǎng)與藥敏試驗(yàn)使用珠海貝索生物技術(shù)有限公司固體羅氏培養(yǎng)基，結(jié)核分枝桿菌抗原采用杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司試劑盒檢測，并應(yīng)用Haier公司HR50-ⅡA2生物安全柜試驗(yàn)。擴(kuò)增及雜交選用德國Hain Life Sciences公司的 GeneType MTBDR-Plus1．0 Kit試劑盒。DNA雜交儀選用梅里埃公司的GT-Blot 48全自動微生物檢測系統(tǒng)。嚴(yán)格按照試劑盒及相關(guān)儀器配套說明書進(jìn)行操作。

1．3 方法

患者晨起立即用清水漱口，采集其漱口后深咳出的膿樣、干酪樣或膿性黏液樣性質(zhì)的痰液標(biāo)本2份，一份采用羅氏培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)檢測，一份應(yīng)用HAIN技術(shù)檢測。

傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)：痰標(biāo)本經(jīng)2倍于標(biāo)本量的消化液（4%氫氧化鈉）進(jìn)行前處理，然后接種到酸性羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)。用接種環(huán)取一環(huán)培養(yǎng)基上的菌落，研磨后與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)瞎鼙葘?，制成質(zhì)量濃度為1 g／L的菌懸液，梯度稀釋為10-2g／L和10-4g／L，分別接種含異煙肼（0．1 μg ／mL）和利福平（0．2 μg ／mL）的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基，放入細(xì)菌培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)6～8周，觀察結(jié)果。

HAIN技術(shù)檢測：利用超聲波水浴破壞細(xì)菌，提取DNA；應(yīng)用熱啟動Taq酶擴(kuò)增目的DNA片段；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與試紙條上固定的探針進(jìn)行雜交顯色；利用酶顯色反應(yīng)對結(jié)果進(jìn)行判讀。以羅氏培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，檢測HAIN技術(shù)下藥物的耐藥程度、敏感程度分別計(jì)算其敏感度、特異度。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，耐藥率比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)果見表1至表2。以羅氏法為標(biāo)準(zhǔn)，HAIN技術(shù)對利福平及異煙肼耐藥檢測的靈敏度分別為87．69%和52．73%，特異度分別為 90．86%和 87．24%。

表1 HAIN法與羅氏法耐藥性檢測結(jié)果比較[例（%）]

表2 HAIN法與羅氏法藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較（例，n＝251）

3 討論

耐多藥（同時(shí)對利福平和異煙肼耐藥）結(jié)核病具有診斷難、治療難、傳播風(fēng)險(xiǎn)大的特點(diǎn)，是我國當(dāng)前結(jié)核病控制的重點(diǎn)和難點(diǎn)。早期診斷可盡早控制耐藥結(jié)核病的傳播，同時(shí)能及時(shí)給予合理、有效的抗結(jié)核治療。傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)法檢測結(jié)核分枝桿菌的藥物敏感性耗時(shí)長、工作量大，且在耐藥性檢測期間，只能根據(jù)經(jīng)驗(yàn)應(yīng)用抗結(jié)核藥物，可能導(dǎo)致實(shí)施不合理的抗結(jié)核治療方案。顯然，尋找快速檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法已成為耐藥結(jié)核病控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]?；蛐头椒ㄔ跈z測速度、操作標(biāo)準(zhǔn)化、潛在高通量及較低的生物安全條件等方面具有較大優(yōu)勢，更適于大規(guī)模檢測耐藥結(jié)核[6]。HAIN技術(shù)能通過進(jìn)行反向探針雜交技術(shù)快速檢測樣本中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTBC），并通過同時(shí)檢測rpoB，katG，inhA 3種基因，可在較短時(shí)間內(nèi)檢測利福平和異煙肼的耐藥性，近幾年已在全世界廣泛應(yīng)用[7-9]，該檢測整個(gè)周期僅為24 h，能快速得到耐藥性結(jié)果，確保更多結(jié)核病患者能得到快速、準(zhǔn)確的診斷和治療[10]。

本研究中采用HAIN技術(shù)對不同性別及全部痰抗酸桿菌涂片陽性肺結(jié)核患者利福平、異煙肼的耐藥性進(jìn)行檢測并與羅氏培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)“金標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），說明2種檢測方法具有較好的一致性。但本研究中HAIN技術(shù)檢測利福平、異煙肼耐藥的敏感度及特異度均低于屈亞虹等[11]、李強(qiáng)等[12]報(bào)道的結(jié)果。究其原因，一方面，本研究中采用的是痰標(biāo)本直接檢測，而其他研究多采用實(shí)驗(yàn)室分離菌株進(jìn)行檢測；另一方面，本研究中納入樣本數(shù)量較少，結(jié)果可能存在一定的選擇偏倚；此外，分子生物學(xué)技術(shù)對標(biāo)本質(zhì)量的要求較高，樣本中結(jié)核分枝桿菌數(shù)目較少或樣本中存在抑制DNA擴(kuò)增的物質(zhì)等，均可能影響檢測效果[13]。

本研究中，少數(shù)患者利福平耐藥檢測結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道不一致，考慮原因?yàn)榇嬖趓poB以外的基因突變[14]，呈假陰性；另外，部分結(jié)核菌株的rpoB基因突變位點(diǎn)為沉默或無效基因，此類基因不表達(dá)或低表達(dá)[15]，呈假陽性。

本研究中，HAIN技術(shù)對異煙肼耐藥性檢測的靈敏度及特異度均明顯低于利福平。考慮可能是由于結(jié)核菌對利福平耐藥僅由rpoB單基因突變引起，而katG，inhA，ahpC等多個(gè)基因突變均可導(dǎo)致異煙肼的耐藥，HAIN技術(shù)僅檢測katG和inhA 2個(gè)基因判斷異煙肼的耐藥性，對 ahpC等其他可能導(dǎo)致耐藥的基因未進(jìn)行檢測。有研究表明，ahpC突變可導(dǎo)致自身基因表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而補(bǔ)償KatG基因突變所導(dǎo)致的過氧化氫-過氧化物酶的缺乏，異煙肼活化不受影響，表型為敏感[16]。HAIN技術(shù)檢測的利福平耐藥率高于羅氏培養(yǎng)法，可能由于HAIN技術(shù)結(jié)果由肉眼直接讀出，會造成主觀偏倚[12]，同時(shí)操作過程中可能造成污染導(dǎo)致假陽性[17]。兩種檢測方法所得耐藥率均高于國內(nèi)全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查結(jié)果（8．32%）[18]，考慮可能是由于我院為安徽省的結(jié)核病診療中心，收住的復(fù)治及重癥肺結(jié)核患者較多，故耐藥率較高。

綜上所述，HAIN技術(shù)診斷的準(zhǔn)確性、敏感度和特異度均較高，且能用于快速判斷利福平、異煙肼的耐藥性，可為早期發(fā)現(xiàn)耐多藥肺結(jié)核提供診斷依據(jù)，具有較大的臨床意義。臨床工作中在等待羅氏培養(yǎng)結(jié)果期間，可以HAIN技術(shù)作為輔助檢測手段，從而讓患者盡早得到合理、有效的抗結(jié)核治療。