山楂藥材黃酮類成分毛細(xì)管電泳指紋圖譜研究

陳寶龍，鄭朝華，陳玉英

（1．河南省正骨研究院，河南 洛陽 471002； 2．中國藥科大學(xué)分析化學(xué)教研室，江蘇 南京 210009）

中藥山楂有行氣散瘀功效[1]，臨床治療關(guān)節(jié)扭傷和紅腫熱痛效果良好[2-3]。山楂所含山楂總黃酮在體內(nèi)外均能抑制血小板聚集，山楂葉醇提物（主要為黃酮類成分）對(duì)模型小鼠有抗炎鎮(zhèn)痛作用，黃酮類代表成分金絲桃苷和蘆丁有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用[4-7]。山楂在我國分布廣泛，成分及含量不盡相同，藥效也有差異。為控制藥材和制劑質(zhì)量，保證藥效，需對(duì)山楂中的化學(xué)成分物質(zhì)群進(jìn)行控制[8]。本研究中依據(jù)《中藥注射劑色譜指紋圖譜實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)指南（試行）》的要求，利用毛細(xì)管電泳（CE）技術(shù)建立山楂藥材黃酮類成分的指紋圖譜，考察該圖譜用于控制山楂藥材質(zhì)量的可行性，并為其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立進(jìn)行有益探索。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：D／ACE5500型毛細(xì)管電泳儀[配有二極管陣列檢測(cè)器（DAD）](美國Beckman公司)；毛細(xì)管柱（河北永年光纖廠，總長 57 cm，有效長度 50cm，內(nèi)徑 50 μm，未涂漬）。

試藥：10批次山楂藥材來自山東濟(jì)南，經(jīng)藥物室李軍研究員鑒定為薔薇科植物山里紅 Crataegus pinnatifida Bge．var．major N．E．Br的干燥成熟果實(shí)；金絲桃苷對(duì)照品（≥95%）購于安徽DETLA天然有機(jī)化合物信息中心；十二烷基硫酸鈉（SDS，Sigma公司）；甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 檢測(cè)條件

電泳模式：膠束電泳毛細(xì)管色譜（MECC）模式；緩沖液：NaH2PO4-Na2B4O7-SDS（濃度分別為 20，40，40 mmol／L，pH＝4．50）；毛細(xì)管柱處理：依次用重蒸水、0．1 mol／L氫氧化鈉、重蒸水沖洗毛細(xì)管柱各10 min，緩沖液沖洗 5 min，平衡20 min，緩沖液沖洗5 min，高壓進(jìn)樣6 s，25 kV 電壓分析樣品 60 min；檢測(cè)波長：210 nm。

2．2 溶液制備

采用前期試驗(yàn)確定的黃酮類成分提取方法[9]，稱取山楂藥材樣品粉末1．25 g，加10倍量95%乙醇，60℃、250 W超聲提取 45 min，濾過，殘?jiān)?6倍量 95%乙醇，同法超聲提取，濾過，殘?jiān)?倍量95%乙醇，再次同法超聲提取，濾過，合并濾液，轉(zhuǎn)至25 mL容量瓶中，加95%乙醇定容，搖勻；移取3 mL提取液，加熱揮干溶劑，加 1 mL 緩沖液超聲溶解，放置 30 min，經(jīng) 0．45 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。取對(duì)照品金絲桃苷適量，用緩沖液超聲溶解，放置 30 min后，經(jīng) 0．45 μm微孔濾膜濾過，作為對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為25 μg／mL）。

2．3 方法學(xué)考察

空白及對(duì)照品試驗(yàn)：分別取緩沖液、金絲桃苷對(duì)照品溶液，壓力進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果見圖1。

參照物選擇：經(jīng)出峰時(shí)間和DAD比對(duì)，確認(rèn)8號(hào)峰為金絲桃苷峰，其峰面積較大、峰形好、峰純度高，故被選為參照物。

精密度試驗(yàn)：取供試品溶液（批次 5），連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果峰面積百分比≥10%的共有峰相對(duì)峰面積的RSD為2．30%（＜5%），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取供試品（批次 5）6份，照2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果峰面積百分比≥10%的共有峰相對(duì)峰面積的 RSD為2．42%（＜5%），表明方法重復(fù)性較好。

圖1 空白及對(duì)照品試驗(yàn)色譜圖

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液（批次5），分別在室溫下放置 0，4，8，12，16 h時(shí)進(jìn)樣。結(jié)果峰面積百分比≥10%的共有峰相對(duì)峰面積的 RSD為 2．32%（＜5%），表明供試品溶液在室溫下放置16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．4 毛細(xì)管柱處理

新毛細(xì)管柱用 1 mol／L鹽酸、重蒸水、1 mol／L氫氧化鈉、重蒸水交替沖洗處理，充滿氮?dú)獗４娲?；每天試?yàn)開始前用1 mol／L氫氧化鈉沖洗5 min，重蒸水沖洗10 min，緩沖液沖洗30 min；試驗(yàn)結(jié)束前用 1 mol／L氫氧化鈉沖洗 20 min，重蒸水沖 20 min，充滿氮?dú)?，保存待用?/p>

2．5 指紋圖譜的建立及分析

指紋圖譜的建立：根據(jù)10批次山楂藥材樣品的CE檢測(cè)結(jié)果所給出的相關(guān)參數(shù)，比較圖譜可知，有16個(gè)共有峰，其中，金絲桃苷峰（8號(hào)峰）峰面積較大，純度高，被選為參照峰。在共有峰中只有15號(hào)峰的峰面積大于總峰面積的10%，因此只考慮15號(hào)峰的峰面積比值，其余各共有峰均按其相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行定性。山楂藥材樣品的 CE指紋圖譜見圖2。10批次山楂藥材樣品中黃酮類成分CE指紋圖譜共有峰（1～16 號(hào)峰）的相對(duì)保留時(shí)間比分別為 0．566，0．585，0．637，0．674，0．742，0．769，0．861，1．000（s），1．079，1．177，1．248，1．500，1．532，1．605，1．683，2．317。 指紋圖譜峰面積百分比≥10%的共有峰(峰15)的相對(duì)峰面積見表1。

圖2 山楂藥材黃酮類成分的CE指紋圖譜

指紋圖譜全譜相似度比較與分析：根據(jù)《中藥注射劑色譜指紋圖譜實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)指南（試行）》的要求，采用計(jì)算機(jī)輔助相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng)，比較10批次山楂藥材樣品黃酮類成分CE指紋圖譜全譜相似度。技術(shù)參數(shù)見表2。

表1 10批次山楂藥材樣品中峰15的相對(duì)峰面積

表2 10批次山楂藥材樣品的相似度評(píng)價(jià)技術(shù)參數(shù)

3 討論

CE是利用不同物質(zhì)在處于高電場(chǎng)且充滿溶液的毛細(xì)管中遷移速率不同實(shí)現(xiàn)彼此分離，具有柱效高、分離快、適用樣品范圍廣、樣品使用量少的優(yōu)點(diǎn)，在許多領(lǐng)域已成為重要的分析手段。中藥有效成分多、含量低的特點(diǎn)適合采用CE方法進(jìn)行質(zhì)量控制。在本研究中，分析條件的選擇和優(yōu)化是關(guān)鍵。

介質(zhì)選擇：山楂藥材中要考察的有效部位為黃酮類成分，根據(jù)其結(jié)構(gòu)大多含有鄰位酚羥基的特點(diǎn)，并參考文獻(xiàn)[10-12]，選擇硼砂水溶液作為基本電解質(zhì)，以利用硼砂與鄰位酚羥基的絡(luò)合作用使不同成分淌度差異拉大，使分離度增加，提高CE的選擇性。

對(duì)照品選擇：在已知山楂黃酮類成分中，金絲桃苷含量高，故以金絲桃苷作為對(duì)照品。

分析樣品溶液制備：CE是一種高靈敏度的分析方法，為符合MECC的分析要求，使分析樣品在進(jìn)樣前與緩沖液中的組分形成穩(wěn)定的膠束包裹物，同時(shí)消除分析過程中分析樣品溶液時(shí)產(chǎn)生的擾動(dòng)，提高分離效率，分析樣品溶液采用緩沖液制備。

檢測(cè)波長選擇：對(duì)供試品溶液進(jìn)行190～800 nm紫外-可見吸收光譜掃描和DAD成分檢測(cè)，因210 nm波長處黃酮類成分有顯著吸收，且檢測(cè)到的峰多，分離度較好，故選定210 nm為CE測(cè)定波長。

CE分析模式選擇：為獲得最佳的山楂藥材CE指紋圖譜，先后考察了MECC相CZE（毛細(xì)管區(qū)帶電泳）和pH梯度法3種CE分析模式。結(jié)果顯示，采用緩沖液制備的供試品溶液在MECC模式得到的CE圖譜較另兩種模式圖譜出峰多，峰之間的分離度相對(duì)較好，基線相對(duì)較平穩(wěn)，故選用MECC分析模式。

參照物選擇：由加入一定量金絲桃苷對(duì)照品的供試品溶液的CE圖譜確定8號(hào)峰為金絲桃苷峰，其峰面積大、峰形好、峰純度高，故被選為參照物。

測(cè)定條件優(yōu)化：為獲得最佳的山楂藥材CE指紋圖譜，對(duì) CE 分析條件的電壓（10，15，20，25，30 kV）、進(jìn)樣方式（壓力進(jìn)樣、電壓進(jìn)樣）、緩沖液pH（通過加入 NaH2PO4調(diào)控 pH 為 4．0，4．5，5．0，6．0）、緩沖液濃度（10∶20∶20，10∶20∶40，20∶40∶40，20∶40∶30，mmol／L），有機(jī)添加劑（異丙醇、乙腈或不添加）進(jìn)行了優(yōu)化考察，通過比較圖譜，確定了本研究中采用的測(cè)定條件。

綜上所述，雖然山楂藥材黃酮類成分CE指紋圖譜研究未見報(bào)道，但本研究中成功建立的CE指紋圖譜技術(shù)為山楂質(zhì)量控制提供了參考。