一株異養(yǎng)硝化菌AD-28氨氮去除特性研究

張峰峰，周 可，謝鳳行，趙 瓊，孫海波，趙玉潔

( 天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，天津 300192 )

近年來，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，集約化高密度養(yǎng)殖帶來的養(yǎng)殖水體污染問題逐漸增多，不僅影響水產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)，還會影響水體生態(tài)環(huán)境。其中氨氮污染已成為主要的污染源，通過具有硝化作用的微生物——硝化細菌去除氨氮污染成為最便捷高效的脫氮途徑[1-3]。硝化細菌分為自養(yǎng)硝化菌和異養(yǎng)硝化菌，其中自養(yǎng)硝化菌因其自身不易繁殖、生物密度低、難以形成優(yōu)勢菌、脫氮效果較差等特點難以推廣使用[4-5]。自Quastel等[6]首次分離出異養(yǎng)硝化菌株以來，越來越多的異養(yǎng)硝化細菌因其易于繁殖、適應(yīng)性強、脫氮效率高等優(yōu)點被廣泛關(guān)注[7-11]。異養(yǎng)硝化菌應(yīng)用的關(guān)鍵是其硝化能力，劉天琪等[12]發(fā)現(xiàn)一株具異養(yǎng)硝化功能的假單胞菌(Pseudomonassp.)，在氨氮初始質(zhì)量濃度為300 mg/L時，其84 h對氨氮的去除率超過75%；鄒艷艷等[13]發(fā)現(xiàn)一株根瘤菌(Rhizobiumsp.)，在氨氮初始質(zhì)量濃度100 mg/L的條件下，其48 h對氨氮的去除率超過90%；孫慶花等[14]自海洋中篩得一株假單胞菌，對氨氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮等混合氮源的去除率超過90%。

綜合目前的研究成果，大多數(shù)異養(yǎng)硝化菌在處理高含量氨氮廢水(氨氮質(zhì)量濃度>100 mg/L)時，脫氮不徹底，有大量氨氮殘留。筆者自天津市西青區(qū)養(yǎng)殖池活性污泥中分離篩選出一株去除氨氮能力較強的菌株AD-28，對其進行了生理生化鑒定和16S rDNA同源性分析，鑒定其為嗜堿假單胞菌(P.alcaliphila)，并在實驗室條件下分析不同環(huán)境因子和條件對該菌生長和氨氮去除特性的影響，以期為該菌株在養(yǎng)殖水體中的生物脫氮應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

取天津市各個郊區(qū)縣養(yǎng)殖池中的水樣和活性污泥，經(jīng)過分離、篩選、鑒定后，確定一株去除氨氮能力較強的菌株——嗜堿假單胞菌AD-28，由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC No.8991。

1.1.2 培養(yǎng)基

DM液體培養(yǎng)基：檸檬酸鈉5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，(NH4)2SO41 g，蒸餾水1 L，pH 7.2。

1.2 方法

以DM液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，試驗容器為250 mL錐形瓶，每瓶裝培養(yǎng)基100 mL，于高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min，接種量為1%。培養(yǎng)24 h后測定吸光度(OD600 nm)和氨氮含量。

基礎(chǔ)培養(yǎng)條件：碳源為檸檬酸鈉，碳氮比為20，溫度30 ℃，pH 7.0，轉(zhuǎn)速150 r/min，鹽度為0，初始氨氮質(zhì)量濃度為20 mg/L(硫酸銨為氮源)。

單因素試驗測定的影響因子包括碳源、碳氮比、溫度、pH、轉(zhuǎn)速、鹽度、初始氨氮質(zhì)量濃度7項，分別替換基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下對應(yīng)的影響因子，試驗設(shè)計如下：

碳源：以丁二酸鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、葡萄糖、酒石酸鉀鈉、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉為碳源，對照組不加碳源，共9個處理。

碳氮比：通過調(diào)節(jié)檸檬酸鈉含量來改變液體培養(yǎng)基碳氮比，共設(shè)置10、15、20、30、40共5個處理；

溫度：10、15、20、25、30、35 ℃，共設(shè)置6個處理，接種培養(yǎng)后24、48 h測定OD600 nm和氨氮含量。

pH：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，共設(shè)置7個處理。

轉(zhuǎn)速：設(shè)定0、60、90、120、150、180 r/min，共設(shè)置6個處理。

鹽度：NaCl按0、10、20、30、40、50 g/L，共設(shè)置6個處理。

初始氨氮質(zhì)量濃度：設(shè)置20、40、80、120、160、200、400、800、1600、2000、3000 mg/L，共11個處理。

1.3 測定方法

菌體生長吸光度(OD600 nm)采用島津UV-2550型紫外可見分光光度計在光波長為600 nm處測定。氨氮質(zhì)量濃度的測定采用納氏試劑法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

氨氮去除率(η1)計算公式為：

η1=(A0-At)/A0×100%

式中，A0、At分別為處理前、后的氨氮質(zhì)量濃度(mg/L)。

試驗結(jié)果用平均值±標準差表示，運用軟件SPSS 15.0，經(jīng)單因素方差分析及Duncan′s多重比較檢驗試驗結(jié)果的差異顯著性，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對嗜堿假單胞菌AD-28氨氮去除能力的影響

將嗜堿假單胞菌AD-28接入不同碳源的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基，24 h后測定OD600 nm和氨氮去除率。以硫酸銨為底物氮源，嗜堿假單胞菌AD-28對8種不同碳源的利用程度有較大差異。嗜堿假單胞菌AD-28以檸檬酸鈉、丁二酸鈉、乙酸鈉作為碳源時，OD600 nm值較高，生物量較高，24 h氨氮去除率均超過90%，為最佳碳源；而以葡萄糖為碳源時，由于受到培養(yǎng)基自身顏色的影響，雖然菌液OD600 nm值較高，但菌株數(shù)量并不多，因此其氨氮去除率也較低，僅為13.35%；嗜堿假單胞菌AD-28對其他碳源利用效果一般，其OD600 nm值和氨氮去除率均顯著低于最佳的3種碳源(P<0.05)(圖1)。

圖1 碳源對嗜堿假單胞菌AD-28生長及氨氮去除率的影響

2.2 碳氮比對嗜堿假單胞菌AD-28氨氮去除能力的影響

24 h測定不同碳氮比對嗜堿假單胞菌AD-28的影響，發(fā)現(xiàn)在碳氮比為10、15、20、30、40 5個水平上，其OD600 nm值先升后降，且不同處理之間差異顯著，碳氮比為20時，OD600 nm值顯著高于其他處理(P<0.05)，說明碳氮比對菌株生物量影響較大。其氨氮去除率在碳氮比為15～40的條件下去除率較高，達到93%以上，且各處理間無顯著差異(P>0.05)，而在碳氮比為10的條件下，其氨氮去除率僅為87.47%(圖2)。可能是碳氮比較低時，抑制了菌株對氨氮的去除，而碳源增加到一定程度，又對氨氮的去除影響較小。最后確定碳氮比為20是嗜堿假單胞菌AD-28生長和脫氮的最佳碳氮比。

圖2 碳氮比對嗜堿假單胞菌AD-28生長及氨氮去除的影響

2.3 溫度對嗜堿假單胞菌AD-28氨氮去除能力的影響

溫度是影響微生物生長和生存的重要因素之一。當溫度適宜時，微生物生長快，相關(guān)活性和代謝產(chǎn)物達到較高水平。培養(yǎng)溫度在25～35 ℃時，接種后24 h菌株生長量即達到最高，顯著優(yōu)于其他低溫處理(P<0.05)(圖3a)，其氨氮去除率也超過90%(圖3b)，說明有利于該菌株生長和去除氨氮的最適溫度為25～35 ℃。而溫度為20 ℃時，接種后24 h菌株生長量顯著低于最適溫度(P<0.05)，但是其氨氮去除率仍超過88%，至48 h其生物量和氨氮去除率與最適溫度處理無顯著差異(P>0.05)。而在溫度為15 ℃時，接種后24 h菌株生長量和氨氮去除率均較低，但在48 h其生物量和氨氮去除率與最適溫度處理無顯著差異(P>0.05)。10 ℃時，嗜堿假單胞菌AD-28幾乎不生長，氨氮也未去除。綜上，嗜堿假單胞菌AD-28生長和去除氨氮的最適溫度為25～35 ℃，而15～20 ℃會延遲菌株的生長，降低其對氨氮的去除效率，但不會影響其最終的去除效果，由此可知，嗜堿假單胞菌AD-28可以作為低溫脫氮的備選菌株，10 ℃則嚴重抑制菌株的生長和脫氮。

圖3 溫度對嗜堿假單胞菌AD-28生長及氨氮去除率的影響

2.4 pH對嗜堿假單胞菌AD-28氨氮去除能力的影響

接種24 h后發(fā)現(xiàn)，不同pH對嗜堿假單胞菌AD-28菌株的去除氨氮能力影響顯著(圖4)。當pH為4.0～5.0時，嗜堿假單胞菌AD-28并未明顯生長，其氨氮也未明顯降解，說明較低的pH對其生長具有較大的抑制作用。pH為6.0時，嗜堿假單胞菌AD-28的OD600 nm值較高，說明其生物量較大，氨氮去除率達96.26%以上，pH為7.0～10.0時，菌液的OD600 nm值低于pH為6.0的OD600 nm值，但對氨氮的去除率仍能達96%以上。說明嗜堿假單胞菌AD-28適宜在中性偏堿的條件下生長，在偏堿性的環(huán)境下硝化活性優(yōu)于酸性環(huán)境。其主要原因為，pH直接影響酶的活性，環(huán)境中的氫離子濃度如果超過了微生物酶的適應(yīng)范圍，微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和酶的活力均會相應(yīng)受到影響。

圖4 pH對嗜堿假單胞菌AD-28生長及氨氮去除率的影響

2.5 轉(zhuǎn)速對嗜堿假單胞菌AD-28氨氮去除能力的影響

溶解氧是細菌生長的關(guān)鍵因素，在不同轉(zhuǎn)速下，培養(yǎng)液含有不同的溶解氧，對嗜堿假單胞菌AD-28的生長和代謝產(chǎn)生影響，從而影響其硝化效率。隨著轉(zhuǎn)速的增大，OD600 nm值出現(xiàn)先增后減的趨勢，在轉(zhuǎn)速為120 r/min時OD600 nm值達到最高，說明此轉(zhuǎn)速最利于菌株的生長；在轉(zhuǎn)速為60～180 r/min 時，菌株的氨氮去除率也較高，24 h基本被完全去除；在0 r/min時，24 h其OD600 nm值雖低于其他轉(zhuǎn)速的OD600 nm值，但差異不顯著(P>0.05)，其氨氮去除率也較高，但顯著低于其他轉(zhuǎn)速的OD600 nm值(P<0.05)(圖5)。曾慶梅等[15]研究發(fā)現(xiàn)，搖床轉(zhuǎn)速越高，培養(yǎng)基中溶解氧含量越高，其值可由靜止時的0.2 mg/L升至250 r/min時的4.2 mg/L，溶解氧含量越高越利于菌株HN-S的硝化脫氮。但肖繼波等[9]研究卻發(fā)現(xiàn)，菌株DN7對溶解氧含量并不敏感，反應(yīng)3 d后，脫氮率變化較小，但超過90%。

2.6 鹽度對嗜堿假單胞菌AD-28氨氮去除能力的影響

隨著NaCl質(zhì)量濃度的增加，嗜堿假單胞菌AD-28的OD600 nm值先升后降，NaCl質(zhì)量濃度為30 g/L時OD600 nm值最高，說明此NaCl有利于菌株的生長；NaCl質(zhì)量濃度為10～40 g/L時，其氨氮去除率較高，24 h的氨氮去除率超過99%；NaCl質(zhì)量濃度為50 g/L時，其氨氮去除率也達到了84.16%(圖6)。嗜堿假單胞菌AD-28具有較好的耐鹽性，在NaCl質(zhì)量濃度下也可以正常生長，且具有相對較高的氨氮去除能力，在以后的實際應(yīng)用中可用于海水養(yǎng)殖池中。

圖5 轉(zhuǎn)速對嗜堿假單胞菌AD-28生長及氨氮去除率的影響

圖6 鹽度對嗜堿假單胞菌AD-28生長及氨氮去除率的影響

2.7 氨氮質(zhì)量濃度對嗜堿假單胞菌AD-28脫氮能力的影響

在前期篩選出的適宜菌株生長和去除氨氮的最佳條件下，測定嗜堿假單胞菌AD-28對不同質(zhì)量濃度氨氮的去除能力。氨氮初始質(zhì)量濃度為20～160 mg/L時，隨著質(zhì)量濃度的增加，菌株的OD600 nm值逐漸增加，說明低質(zhì)量濃度的氨氮為菌株的生長提供了氮源，促進了菌株生物量的增加，且培養(yǎng)24 h后各處理的氨氮去除率均超過95%，說明在氨氮初始質(zhì)量濃度為20～160 mg/L時，嗜堿假單胞菌AD-28對氨氮的去除率不受初始氨氮質(zhì)量濃度的影響，24 h對氨氮的去除率均較高；當氨氮初始質(zhì)量濃度為200 mg/L時，嗜堿假單胞菌AD-28 24 h的氨氮去除率達86.6%；氨氮初始質(zhì)量濃度為400～3000 mg/L時，嗜堿假單胞菌AD-28的OD600 nm值無顯著差異(P>0.05)，但其氨氮的去除率逐漸降低，說明初始氨氮質(zhì)量濃度過高，嗜堿假單胞菌AD-28生物量達到最大時就不再利用氨氮，所以對高質(zhì)量濃度氨氮的去除率也較低。

3 討 論

3.1 異養(yǎng)硝化菌的種類和脫氮能力分析

異養(yǎng)硝化菌主要分為：氣單胞菌屬(Aeromonas)[7]、芽孢桿菌屬(Bacillus)[13]、脫氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)[16]、糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)[17-19]、假單胞菌屬[12,14,20]、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)[21]、紅球菌(Rhodococcussp.)[22]、

圖7 氨氮質(zhì)量濃度對嗜堿假單胞菌AD-28生長及氨氮去除率的影響

不動桿菌屬(Acinetobacter)[23]等,Anoxybacilluscontaminans[24]、Zobellellataiwanensis[25]等新的脫氮菌株也被發(fā)現(xiàn)。而嗜堿假單胞菌僅曾被應(yīng)用于重金屬廢水處理[26]，未見其脫氮應(yīng)用的研究報道。

硝化細菌在生態(tài)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)化氨氮的獨特功能使其難以為其他生物所替代。本試驗中嗜堿假單胞菌AD-28具有較強的硝化作用，在氨氮初始質(zhì)量濃度為160 mg/L的條件下，24 h的氨氮去除率超過98%，高于相似條件下氣單胞菌的氨氮去除率(77.71%)[7]。曾慶梅等[15]篩選出的產(chǎn)堿桿菌屬菌株ES-SDK-3，處理氨氮初始質(zhì)量濃度為182.30 mg/L的廢水，30 h后氨氮去除率為99.8%，與本試驗中菌株的硝化性能相似。說明該菌株具有高效的去除氨氮效果，有較大的應(yīng)用價值。

3.2 不同環(huán)境因子對異養(yǎng)硝化菌脫氮能力的影響

異養(yǎng)硝化菌在代謝底物時，以NH4+作電子供體，利用外加碳源提供的化學(xué)能，通過氨氮加氧酶將氨轉(zhuǎn)化為羥胺，再經(jīng)羥胺氧化酶轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽或一氧化二氮[27]。碳源不僅影響異養(yǎng)硝化菌的生長，也影響其硝化活性[28]。鄒艷艷等[13]分離的異養(yǎng)硝化—好氧反硝化菌株ZB612最適碳源為葡萄糖；孫慶花[14]等分離的海洋菌株y3的最適碳源為檸檬酸鈉；王田野[29]等分離的一株異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌SQ2最適碳源為琥珀酸鈉。菌株的種類不同，適于菌株生長的最適碳源也不同，而嗜堿假單胞菌AD-28最適碳源種類較多，對檸檬酸鈉、丁二酸鈉、乙酸鈉的吸收利用均最好，決定其在以后的實際應(yīng)用中使用范圍更廣。碳源量對菌體生長和硝化效率起著重要的作用，若碳源不足，則無足夠的電子流來提供足夠的能源以供菌體生長，硝化效率也會變低；但當提供的碳源遠高于菌體的需求，此時碳源已非限制性因素，菌體的生長和代謝活性處于穩(wěn)定階段，脫氮效率也增加較少，本研究發(fā)現(xiàn)，碳氮比為20時最易于嗜堿假單胞菌AD-28的生長和脫氮。

溫度能改變酶的活性。溫度過低，酶的活性受到抑制；溫度過高則會導(dǎo)致酶失活。耐低溫異養(yǎng)硝化菌A.arilaitensis[21]和假單胞菌GL19[30]最低耐受溫度均為15 ℃。本研究中，嗜堿假單胞菌AD-28生長和去除氨氮的最適溫度為25～35 ℃，10 ℃時嚴重抑制菌株的生長和脫氮，15～20 ℃會延遲菌株的生長，降低其對氨氮的去除效率，但不會影響其最終的去除效果，因此，嗜堿假單胞菌AD-28可以為低溫脫氮的備選菌株。相對于自養(yǎng)硝化菌，異養(yǎng)硝化菌所能耐受的pH范圍更寬。嗜堿假單胞菌AD-28在pH為6.0～10.0均能生長和進行硝化反應(yīng)，對氨氮的24 h去除率均超過96%，在pH為6.0時其生物量最大。搖床轉(zhuǎn)速影響了菌株生長培養(yǎng)液的溶解氧含量，隨著搖床轉(zhuǎn)速的升高，溶解氧含量不斷增加，在轉(zhuǎn)速為120 r/min時生物量達到最高，轉(zhuǎn)速為60～180 r/min時，其24 h氨氮去除率均能超過90%，優(yōu)于0 r/min，說明較高的溶解氧含量有利于硝化反應(yīng)的進行，低溶解氧條件抑制了菌株的硝化反應(yīng)。

由于天津水體高鹽度以及海水養(yǎng)殖的特殊性，對嗜堿假單胞菌AD-28的耐鹽性進行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NaCl質(zhì)量濃度為10～40 g/L時，其氨氮去除率較高，24 h均能超過99%，而NaCl質(zhì)量濃度為50 g/L時，其氨氮去除率也達到84.16%。說明嗜堿假單胞菌AD-28具有較強的耐鹽性，在高鹽脅迫下，其硝化反應(yīng)也較強。

3.3 底物質(zhì)量濃度對異養(yǎng)硝化菌脫氮能力的影響

一定數(shù)量的微生物對氨氮的脫除量是有限的，當氨氮質(zhì)量濃度超出其所能脫除的最大范圍時，微生物就不能再脫除多余的氨氮，同時氨氮質(zhì)量濃度過高，菌株的活性會受到高質(zhì)量濃度氨氮的抑制，影響其正常的生長繁殖，進而影響其脫氨能力。本研究中設(shè)計不同的初始氨氮質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)初始氨氮質(zhì)量濃度為20～160 mg/L時，隨質(zhì)量濃度的增加生物量逐漸增多，且培養(yǎng)24 h后氨氮的去除率均超過95%，而氨氮初始質(zhì)量濃度為200 mg/L時，其24 h氨氮去除率也達到86.6%，氨氮初始質(zhì)量濃度為400～3000 mg/L時，生物量無顯著差異，但氨氮的去除率逐漸降低，且顯著低于其他低質(zhì)量濃度的處理結(jié)果。

4 結(jié) 論

本試驗中對影響嗜堿假單胞菌AD-28生長和氨氮去除效果的因素，包括碳源、碳氮比、溫度、pH、轉(zhuǎn)速、初始氮質(zhì)量濃度及鹽度進行了考察。發(fā)現(xiàn)適于嗜堿假單胞菌AD-28生長和氨氮去除的最佳條件為：碳源為檸檬酸鈉、丁二酸鈉、乙酸鈉，碳氮比為20，溫度為25～35 ℃，pH為6.0，轉(zhuǎn)速為120 r/min，對初始質(zhì)量濃度為20～160 mg/L的氨氮去除率超過95%。嗜堿假單胞菌AD-28具有一定的耐低溫性能，在15 ℃可以生長，且氨氮去除率在48 h達到91%；具有較強的耐鹽性，可以在NaCl質(zhì)量濃度為50 g/L的條件下生長，且24 h氨氮去除率可達84.16%；嗜堿假單胞菌AD-28耐低溫和耐鹽的特性為以后在低溫或海水中的應(yīng)用提供了可能。