黃連素對(duì)海水病原菌的殺滅效果及藥效穩(wěn)定性

王 凱，于永翔,2，張 正,2,3，王印庚,2,3，廖梅杰,2,3

( 1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071； 2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室, 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071； 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071 )

大規(guī)模病害的頻繁發(fā)生，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]，成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要問(wèn)題之一。這其中，以細(xì)菌為病原的疾病更為常見(jiàn)。水產(chǎn)動(dòng)物的細(xì)菌性疾病普遍具有傳染快、死亡率高等顯著特點(diǎn)，往往成為決定養(yǎng)殖成活率的關(guān)鍵性因素之一。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性病害防治手段主要包括傳統(tǒng)化學(xué)藥物、漁用疫苗、微生態(tài)制劑和中草藥等。相比于疫苗和微生態(tài)制劑，藥物的使用在我國(guó)現(xiàn)階段的養(yǎng)殖生產(chǎn)中更為常見(jiàn)。傳統(tǒng)化學(xué)藥物包括抗生素和消毒劑，在疾病防控中起效快、效果直接，但也伴隨著環(huán)境污染[2]和耐藥基因遷移與整合等[3]諸多問(wèn)題，因此受到越來(lái)越嚴(yán)格的管控。在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，對(duì)于水產(chǎn)疾病的防控多以疫苗為主[4]。雖然我國(guó)漁用疫苗的研究起步于20世紀(jì)70年代，但迄今為止也僅有4個(gè)疫苗獲得國(guó)家新獸藥證書，其中只有草魚出血病滅活疫苗被列入國(guó)家獸藥標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)微生態(tài)制劑的研究始于1979年，迄今也只有蛭弧菌(Bdellovibrio)微生態(tài)制劑為國(guó)家級(jí)二類新獸用微生物生態(tài)制品，同時(shí)也是我國(guó)唯一獲得國(guó)家批準(zhǔn)的二類獸用微生物制劑。因此，我國(guó)水產(chǎn)疫苗和微生態(tài)制劑的應(yīng)用[5]在現(xiàn)階段依然受到各種因素的限制，面對(duì)種類多樣的細(xì)菌性病原，水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中對(duì)于疾病防控更多的還是依靠藥物。

與抗生素等化學(xué)藥物相比，中草藥具有產(chǎn)物天然、安全無(wú)污染、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)，特別是其中的某些成分還兼具免疫增強(qiáng)效果，可以提高動(dòng)物機(jī)體免疫能力[6-7]。但中草藥大多成分復(fù)雜，特別是在水環(huán)境條件下更難以進(jìn)行深入的藥理和藥效研究，因此中草藥單體成為水產(chǎn)動(dòng)物疾病防控研究的主要方向之一。

黃連素又稱小檗堿，屬異哇琳生物堿，天然品主要存在于小檗科、罌粟科、毛莨科、蕓香科等植物中[8]，具有抗炎、抗癌、抑菌、降脂、降糖等廣泛的藥理作用[9]。本研究以黃連素為主要研究對(duì)象，選取10種水產(chǎn)動(dòng)物常見(jiàn)的病原菌，進(jìn)行黃連素的體外抑菌和殺菌劑量測(cè)定。同時(shí)，以美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種(Photobacteriumdamselaessp.damselae)為指示菌，進(jìn)行黃連素的藥效穩(wěn)定性研究。美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種分離自山東省長(zhǎng)島縣大型深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的患病許氏平鲉(Sebastesschlegeli)病灶，該菌通過(guò)人工感染試驗(yàn)證實(shí)對(duì)許氏平鲉具有極強(qiáng)的致病性，且其分離環(huán)境無(wú)過(guò)往用藥史，適宜作為藥效研究的指示菌。研究結(jié)果旨在為黃連素乃至中草藥在水產(chǎn)疾病防控上的規(guī)范應(yīng)用提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用菌種中遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellatarda)[10]、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)[11]、鯊魚弧菌(V.carchariae)[12]分離自患出血病的褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)，溶藻弧菌(V.alginolyticus)和大菱鲆弧菌(V.scophthalmi)[13]分離自患病大菱鲆(Scophthalmusmaximus)，哈維氏弧菌(V.harveyi)[14]、假交替單胞菌(Pseudoalteromonasnigrifaciens)[15]分離自保苗期仿刺參(Apostichopusjaponicus)，美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種、輪蟲弧菌(V.rotiferianus)分離自患病許氏平鲉，副溶血弧菌(V.parahemolyticus)[16]分離自患化板癥的仿刺參。以上菌種均由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)室保存，并已驗(yàn)證其致病性。

試驗(yàn)用黃連素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)購(gòu)于索萊寶科技有限公司。

1.2 菌種培養(yǎng)與菌液制備

將超低溫保存的試驗(yàn)菌株于MH瓊脂培養(yǎng)基上28 ℃劃線培養(yǎng)24 h，挑選純菌落轉(zhuǎn)接3次后，再挑取單菌落接種到滅菌MH肉湯培養(yǎng)基中，制作菌懸液母液，分光光度法調(diào)節(jié)菌液密度至1.0×107cfu/mL。

1.3 最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17]中的二倍稀釋法做適當(dāng)改進(jìn)，用無(wú)菌生理鹽水將黃連素稀釋成質(zhì)量濃度為1600 mg /L 的母液。取10支滅菌試管，1號(hào)試管加入3.6 mL MH液體培養(yǎng)基和6.4 mL黃連素母液混勻，2～8號(hào)試管加入5 mL MH液體培養(yǎng)基，以二倍稀釋法進(jìn)行倍比稀釋，最終使各管黃連素質(zhì)量濃度為1024、512、256、128、64、32、16、8 mg/L，9號(hào)試管加5 mL黃連素母液做陰性對(duì)照，10號(hào)試管加5 mL MH液體培養(yǎng)基作陽(yáng)性對(duì)照。除9號(hào)試管外，其余每管加入0.1 mL 菌懸液，輕輕晃動(dòng)混勻。在28 ℃、180 r/min下培養(yǎng)16～18 h，觀察試管中培養(yǎng)結(jié)果。結(jié)果判定，試管內(nèi)液體呈現(xiàn)渾濁即為有菌生長(zhǎng)，清澈透明則為無(wú)菌生長(zhǎng)，以無(wú)菌生長(zhǎng)的最低稀釋度確定為最小抑菌質(zhì)量濃度值。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)平行。在最小抑菌質(zhì)量濃度測(cè)定的基礎(chǔ)上，從無(wú)混濁試管開(kāi)始向上2個(gè)稀釋度共3 個(gè)試管中各吸取0.1 mL 樣液，接種至MH瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)16～18 h后觀察，平板菌落不超過(guò)5個(gè)的相應(yīng)試管中的藥物質(zhì)量濃度即為該種藥物對(duì)供試菌株的最小殺菌質(zhì)量濃度。

1.4 黃連素穩(wěn)定性初步研究

1.4.1 不同溫度處理對(duì)黃連素殺菌效果的影響

選取美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種為指示菌，菌液密度調(diào)節(jié)至1.0×107cfu/mL。參考指示菌的最小殺菌質(zhì)量濃度，用無(wú)菌純水配制相同質(zhì)量濃度的黃連素溶液，分別置于4、20、40、60、80、100、121 ℃溫度下處理30 min，待恢復(fù)至室溫后，分別取試管按5 mL黃連素溶液+5 mL MH液體培養(yǎng)基+100 μL菌液配置體系(此時(shí)體系中黃連素質(zhì)量濃度為最小殺菌質(zhì)量濃度)，對(duì)照組體系為5 mL黃連素溶液+5 mL MH液體培養(yǎng)基+100 μL菌液(黃連素為室溫處理)，混勻后28 ℃、180 r/min培養(yǎng)，20 min后吸取0.1 mL涂布胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂平板，計(jì)算殘留的細(xì)菌數(shù)量，并按下式計(jì)算不同溫度處理下黃連素的殺菌率，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

100%

1.4.2 不同貯存時(shí)間對(duì)黃連素殺菌效果的影響

將上述20、60、100 ℃處理的黃連素溶液于室溫下避光存儲(chǔ)，于第1、7、14、28、35 d后計(jì)算殺菌率，比較不同溫度處理和不同時(shí)間存儲(chǔ)后黃連素的藥效穩(wěn)定性。

1.4.3 不同Na+、Ca2+、K+、Mg2+質(zhì)量濃度對(duì)黃連素殺菌效果的影響

根據(jù)海水的鹽度配比，分別設(shè)置NaCl的質(zhì)量濃度梯度為0、5、10、15、20、25 mg/L，CaCl2、KCl、MgCl2的質(zhì)量濃度梯度為0、1、2、3、4、5 mg/L。以對(duì)應(yīng)鹽溶液配置質(zhì)量濃度為2倍最小殺菌質(zhì)量濃度的黃連素溶液，對(duì)照組不加黃連素，計(jì)算殺菌率，分析不同金屬離子質(zhì)量濃度下黃連素的殺菌效果。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 2016和SPSS 19.0試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，殺菌率相關(guān)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.5 安全性試驗(yàn)

藥物安全性試驗(yàn)以人工繁育的許氏平鲉為參考物種，以藥浴方式進(jìn)行。試驗(yàn)魚購(gòu)自威海某育苗場(chǎng)，體質(zhì)量(37.1±5.0) g。取健康許氏平鲉40尾，禁食1 d后，分為3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組設(shè)置2個(gè)平行，即每個(gè)平行5尾魚。試驗(yàn)于50 L水槽中進(jìn)行，根據(jù)測(cè)定的黃連素對(duì)指示菌的最小殺菌質(zhì)量濃度，設(shè)定3個(gè)試驗(yàn)組黃連素質(zhì)量濃度分別為50%、1倍和2倍最小殺菌質(zhì)量濃度值，對(duì)照組不做處理。試驗(yàn)全程不換水，正常充氣，12 h后對(duì)照組和試驗(yàn)組各投喂10 g顆粒餌料，觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組的活力及攝食狀況，并于24 h后再次觀察魚的活力及死亡率。

2 結(jié) 果

2.1 黃連素對(duì)10種水產(chǎn)細(xì)菌性病原的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度

測(cè)定黃連素對(duì)10種水產(chǎn)病原菌的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。由表1、圖1可見(jiàn)，黃連素對(duì)10種病原菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為64～256 mg/L。其中，黃連素對(duì)大菱鲆弧菌和溶藻弧菌抑菌作用最明顯，最小抑菌質(zhì)量濃度為64 mg/L；對(duì)鰻弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌、美人魚發(fā)光桿菌、鯊魚弧菌、假交替單胞菌和輪蟲弧菌的抑菌作用次之，最小抑菌質(zhì)量濃度為128 mg/L；對(duì)哈維弧菌和副溶血弧菌抑菌作用較弱，最小抑菌質(zhì)量濃度為256 mg/L。黃連素對(duì)10種病原菌的最小殺菌質(zhì)量濃度為256～1024 mg/L。其中，對(duì)鰻弧菌、大菱鲆弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌、溶藻弧菌、鯊魚弧菌和輪蟲弧菌殺菌作用最強(qiáng)，最小殺菌質(zhì)量濃度為256 mg/L；對(duì)美人魚發(fā)光桿菌、副溶血弧菌和假交替單胞菌的殺菌作用次之，最小殺菌質(zhì)量濃度為512 mg/L；對(duì)哈維氏弧菌殺菌作用較弱，最小殺菌質(zhì)量濃度為1024 mg/L。

2.2 溫度和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)黃連素殺菌效果的影響

以美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種為指示菌，測(cè)定不同溫度及時(shí)間處理下黃連素對(duì)指示菌的殺菌對(duì)數(shù)值，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、表3。結(jié)果表明，512 mg/L的黃連素溶液在4～121 ℃條件下處理30 min，對(duì)指示菌的殺菌率均超過(guò)99%，且無(wú)明顯差異。試驗(yàn)結(jié)果表明，黃連素的抑菌效果不受溫度的影響；20、60 ℃及100 ℃處理的黃連素分別于室溫存放1、7、14、28、35 d后，對(duì)指示菌的殺菌率依然均超過(guò)99%，表明存放時(shí)間對(duì)黃連素的殺菌效果無(wú)明顯影響。

表1 黃連素對(duì)10種水產(chǎn)病原菌的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度 mg/L

圖1 黃連素對(duì)10種病原菌的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度1.鰻弧菌；2.哈維弧菌；3.大菱鲆弧菌；4.遲緩愛(ài)德華氏菌；5.美人魚發(fā)光桿菌；6.副溶血弧菌；7.溶藻弧菌； 8.鯊魚弧菌；9.假交替單胞菌；10.輪蟲弧菌.

溫度/℃420406080100121殺菌率99.21±0.0299.32±0.0499.34±0.199.57±0.0799.55±0.0599.53±0.1199.48±0.07

表3 存放時(shí)間對(duì)黃連素殺菌率的影響 %

2.4 不同Na+、Mg2+、Ca2+、K+質(zhì)量濃度對(duì)黃連素殺菌效果影響

分別用質(zhì)量濃度為0、5、10、15、20、25 mg/L的NaCl鹽溶液配置512 mg/L的黃連素溶液，作用30 min后，殺菌率均超過(guò)99%，質(zhì)量濃度為0、1、2、3、4、5 mg/L的MgCl2、CaCl2、KCl的鹽溶液配置同等質(zhì)量濃度的黃連素溶液，作用30 min后殺菌率也均超過(guò)99%(圖2)。結(jié)果表明，Na+、Mg2+、Ca2+、K+等離子對(duì)黃連素的殺菌效果無(wú)顯著影響。

圖2 不同金屬離子質(zhì)量濃度對(duì)黃連素殺菌效果的影響

2.5 黃連素安全性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組和對(duì)照組許氏平鲉12 h后均無(wú)死亡，投喂餌料后50%最小殺菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度試驗(yàn)組攝食情況與對(duì)照組無(wú)顯著差異，攝食完成后均無(wú)殘餌，而2 倍最小殺菌質(zhì)量濃度試驗(yàn)組則有少量殘餌。試驗(yàn)24 h后，各試驗(yàn)組與對(duì)照組均無(wú)死亡，試驗(yàn)魚活力正常(表4)。

表4 黃連素對(duì)許氏平鲉的安全性試驗(yàn)

3 討 論

3.1 中草藥殺菌效果研究

疾病的普遍發(fā)生給水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的壓力，抗生素和化學(xué)藥物的頻繁使用也不斷誘導(dǎo)水產(chǎn)病原菌耐藥性的產(chǎn)生，增加了對(duì)疾病的防治難度。而中草藥源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，并經(jīng)歷了數(shù)千年的篩選和應(yīng)用，長(zhǎng)時(shí)間的人類臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)和無(wú)數(shù)的動(dòng)物試驗(yàn)研究對(duì)中草藥的有效性均做出了肯定[18]，近年來(lái)中草藥在抑菌殺菌方面的效果也得到證實(shí)[19]。阿琪瑪?shù)萚20]研究了金銀花、黃連、何首烏、地榆、五味子、穿心蓮、虎杖等16種中草藥對(duì)牛源致病性大腸桿菌(Escherichiacoli)的體外抑菌效果，結(jié)果表明，金銀花和黃連對(duì)大腸桿菌O1體外抑菌效果最好，五味子對(duì)大腸桿菌O8體外抑菌效果最好，而虎杖的體外抑菌效果最差。梁利國(guó)等[21]采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定了五倍子等18種中草藥對(duì)鰻弧菌、副溶血弧菌、河口弧菌(V.aestuarianus)及霍亂弧菌(V.cholerae)等4種病原弧菌的抑制作用，五倍子、蘇木、地錦草、石榴皮、黃芩、虎杖和山楂7種中草藥對(duì)病原弧菌具有較好的抑菌效果，而金銀花等11種中草藥抑菌作用較弱。但這些研究多集中在對(duì)中草藥單方或復(fù)方研究，研究對(duì)象為多種藥物成份的復(fù)合物，并未對(duì)起效成份的藥效學(xué)和藥理學(xué)進(jìn)行深入細(xì)致的分析。

3.2 中藥單體殺菌效果研究

與復(fù)方中藥相比，中藥單體成份明確，易于進(jìn)行定性、定量[22]和開(kāi)展藥效學(xué)的研究。黃連素作為中藥提取物，為苯丙異喹啉類季銨型生物堿，具有廣譜抗菌作用，并已在動(dòng)物醫(yī)學(xué)和人類臨床上應(yīng)用多年[23-27]。謝麗鈴等[28]研究表明，黃連素對(duì)副溶血弧菌、溶藻弧菌和嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)3種水產(chǎn)病原菌的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度分別為0.391 mg/mL和0.391 mg/mL、0.391 mg/mL和 0.781 mg/mL、0.781 mg/mL和1.563 mg/mL，且黃連素會(huì)嚴(yán)重破壞病原菌的菌體形態(tài)，使病原菌的遲緩期延長(zhǎng)2～7 h。其中，對(duì)溶藻弧菌的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度均大于本試驗(yàn)研究結(jié)果(64 mg/L和256 mg/L)，這可能與試驗(yàn)所用黃連素藥物的來(lái)源有關(guān)。本試驗(yàn)以純品黃連素為對(duì)象，用最小二倍法對(duì)黃連素進(jìn)行抑菌作用的初步測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，黃連素對(duì)10種革蘭氏陰性水產(chǎn)病原菌均具有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用。經(jīng)不同溫度處理后的黃連素對(duì)目標(biāo)仍具較強(qiáng)的殺菌效力，說(shuō)明溫度變化并不會(huì)影響黃連素的殺菌藥效。而且經(jīng)121 ℃熱處理后的黃連素仍具有較好的殺菌效果。由此可知，黃連素適用于人工配合飼料的制配生產(chǎn)工藝，可以拌于餌料中進(jìn)行不高于121 ℃的高溫滅菌。藥效穩(wěn)定性的研究也表明，即使經(jīng)不同溫度處理后的黃連素溶液室溫存放35 d后殺菌效果依然無(wú)明顯變化，說(shuō)明其結(jié)構(gòu)性質(zhì)比較穩(wěn)定，可以耐受大多數(shù)儲(chǔ)存條件。用不同離子質(zhì)量濃度配制的黃連素溶液殺菌效果也無(wú)明顯變化，初步表明，黃連素的使用不受水中Na+、Mg2+、Ca2+、K+等金屬離子的影響，因此也適用于海水養(yǎng)殖環(huán)境。

試驗(yàn)結(jié)果表明，黃連素對(duì)主要海水養(yǎng)殖病原菌的殺菌效果較好，且藥物特性非常穩(wěn)定，適宜作為水產(chǎn)藥物進(jìn)行產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)。同時(shí)，在研究過(guò)程中以許氏平鲉為試驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行黃連素對(duì)海水魚類的初步安全性檢測(cè)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然各質(zhì)量濃度的黃連素長(zhǎng)時(shí)間藥浴并未造成許氏平鲉的死亡，但1024 mg/L的劑量已對(duì)許氏平鲉的攝食產(chǎn)生了相應(yīng)的影響。長(zhǎng)期以來(lái)，研究人員對(duì)黃連素及各種衍生物的安全性論證從未停止。趙錫艷等[29]詳盡地從動(dòng)物試驗(yàn)、臨床研究及個(gè)案報(bào)道等方面論述了黃連單方及其主要成分對(duì)人和小鼠的不良反應(yīng)，如便秘、腹瀉、過(guò)敏等；何蕾等[30]從DNA層面報(bào)道了鹽酸小檗堿對(duì)小鼠肝、脾、腎細(xì)胞DNA損傷的影響，鹽酸小檗堿可引起肝、脾、腎DNA損傷，并呈顯著的劑量—效應(yīng)關(guān)系。以上研究均表明，黃連素的臨床使用應(yīng)嚴(yán)格控制劑量。而在水產(chǎn)動(dòng)物的研究領(lǐng)域尚未見(jiàn)黃連素不良反應(yīng)的報(bào)道。通過(guò)本次試驗(yàn)，也初步證實(shí)了黃連素可能對(duì)魚類的攝食造成一些負(fù)面影響，而不同物種對(duì)黃連素的耐受情況必然會(huì)有差別，因此在考慮黃連素作為水產(chǎn)殺菌藥物的同時(shí)，更應(yīng)深入研究黃連素對(duì)不同水產(chǎn)動(dòng)物的安全質(zhì)量濃度范圍，以期為黃連素在水產(chǎn)病害方面的應(yīng)用提供更為精確的參考。