魚類Toll樣受體對病毒的識別、響應(yīng)及信號傳導(dǎo)

祝雅晨，張 杰，趙賢亮，孔祥會

( 河南師范大學 水產(chǎn)學院，河南 新鄉(xiāng) 453007 )

魚類生活在水環(huán)境中，隨時面臨著病毒、細菌、真菌、原生動物等各種病原微生物的侵襲，特別是在集約化養(yǎng)殖的模式下，養(yǎng)殖密度不斷增加，魚類免疫力下降，常暴發(fā)各種疾病。其中病毒性疾病由于潛伏期長短不一、癥狀復(fù)雜多變、傳染性強、傳播快、死亡率高、防治困難、無特效藥等特點，嚴重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1]。

魚類作為低等脊椎動物，其特異性免疫尚不完善，非特異性免疫一般先于特異性免疫在感染早期發(fā)揮重要作用，是抵御病毒感染的第一道防線，可協(xié)同維持機體穩(wěn)態(tài)[2]。模式識別受體(PRR)可識別病原具有保守分子基序的結(jié)構(gòu)成分即病原相關(guān)分子模式(PAMP)，誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答，在非特異性免疫中發(fā)揮重要作用[3]。

迄今為止，在硬骨魚類中共發(fā)現(xiàn)4種模式識別受體，包括Toll樣受體(TLRs)、NOD樣受體(NLRs)、RIG樣受體(RLRs)和C-型凝集素受體(CLRs)[3-4]。其中TLR是發(fā)現(xiàn)最早，研究最多也最為重要的一類模式識別受體[5]?？赏ㄟ^多種病原相關(guān)分子模式如單鏈RNA(ssRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)等廣泛識別各種病原微生物，激活胞內(nèi)信號通路，誘導(dǎo)促炎細胞因子及I型干擾素(IFN)等的釋放。干擾素可誘導(dǎo)宿主細胞內(nèi)抑制病毒mRNA翻譯的蛋白質(zhì)(蛋白激酶PKR、Mx蛋白等)的表達，進而抑制病毒的增殖[6]。因而TLRs對于病毒的識別和清除具有重要作用。筆者就魚類TLRs對于病毒的識別、響應(yīng)及啟動細胞內(nèi)信號通路等相關(guān)研究進行綜述，以期為深入研究TLRs對病毒識別和響應(yīng)的分子機制提供參考依據(jù)。

1 魚類TLRs的基本概況

Toll受體最初于1985年在果蠅(Drosophilamelanogaster)中被發(fā)現(xiàn)，其功能與果蠅早期胚胎背腹極性的形成有關(guān)[7]。1996年Lemaitre等[8]研究表明，此蛋白在果蠅抗真菌感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，由此開始了Toll受體免疫活性的相關(guān)研究。1997年在人類基因中鑒定到果蠅Toll受體的同源分子，命名為Toll樣受體[9](現(xiàn)已知為TLR4)。目前，哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)13種TLRs(TLR1～TLR13)，其中人類中發(fā)現(xiàn)10種(TLR1～TLR10)，鼠中13種(TLR1～TLR13，TLR10由于逆轉(zhuǎn)錄病毒的插入而喪失功能)[10]。

魚類TLRs發(fā)現(xiàn)較晚，但種類較多。2003年Stafford等[11]在金魚(Carassiusauratus)中克隆得到魚類第一個TLR成員。迄今為止，在魚類中至少發(fā)現(xiàn)22個TLRs成員。類似于哺乳動物，魚類TLRs也可歸為6個亞家族：TLR1亞家族(TLR1、TLR2、TLR14、TLR18、TLR24、TLR25、TLR27、TLR28)、TLR3亞家族(TLR3)、TLR4亞家族(TLR4)、TLR5亞家族(TLR5M、TLR5S)、TLR7亞家族(TLR7、TLR8、TLR9)和TLR11亞家族(TLR13、TLR19、TLR20、TLR21、TLR22、TLR23、TLR26)[12-13]。

TLRs家族成員在進化過程中比較保守，其典型結(jié)構(gòu)包含胞外的亮氨酸富集重復(fù)(LRR)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和胞內(nèi)的Toll/IL-1受體同源區(qū)(TIR)結(jié)構(gòu)域3部分，屬于I-型跨膜蛋白[5]；此外，魚類中也存在可溶性的TLR(TLR5和TLR4)，只保留了胞外的亮氨酸富集重復(fù)結(jié)構(gòu)域[10,14]。TLRs胞外區(qū)序列差異相對較大，主要參與配體的結(jié)合，由19～25個亮氨酸富集重復(fù)基序組成，每個亮氨酸富集重復(fù)基序包含20～30個氨基酸殘基，都含有保守序列LxxLxLxxN(Cx)xL[15]。胞外區(qū)氨基酸序列和亮氨酸富集重復(fù)數(shù)目的差異是區(qū)別不同TLR的主要標志[14]。胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域，是高度保守的蛋白質(zhì)相互作用區(qū)，主要負責信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，由約200個氨基酸殘基組成[10]。TIR是Toll樣受體和IL-1R向下游進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心元件，這一區(qū)域關(guān)鍵位點突變或序列缺失將阻斷信號向下傳遞。

2 魚類TLRs對病毒的識別與響應(yīng)

目前研究發(fā)現(xiàn)，魚類參與病毒識別的TLRs主要包括TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9和TLR22[16-17](表1)。其中TLR2、TLR4和TLR22位于細胞膜上，TLR22主要識別細胞外病毒的雙鏈RNA，TLR2和TLR4在哺乳動物中主要對細胞外囊膜病毒的蛋白成分進行識別[18-20]；TLR3、TLR7、TLR8和TLR9主要位于溶酶體樣囊泡膜或核內(nèi)體(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))等胞內(nèi)體膜上，參與細胞內(nèi)病毒核酸成分的識別，包括DNA、單鏈RNA及雙鏈RNA。

表1 魚類抗病毒相關(guān)TLRs

2.1 TLR2

TLR2主要以同源二聚體或與TLR1和TLR6分別形成異源二聚體的形式識別多種來自于細菌的配體，如肽聚糖(PGN)、脂磷壁酸(LTA)、脂肽(Lipopeptides)等[5]。此外，TLR2可與多種病毒相互作用。研究表明單純皰疹病毒(HSV-1、HSV-2)、巨細胞病毒(HCMV、MCMV、LCMV)等，均通過依賴TLR2的信號通路激活免疫系統(tǒng)，介導(dǎo)抗病毒免疫[18,20]。然而與TLR2結(jié)合的病毒蛋白尚不十分清楚，有待進一步研究。在魚類中，TLR2同樣可識別肽聚糖、脂磷壁酸和人工合成的三?；腜am3CSK4[16]，也可參與病毒的識別[17]。有研究通過鯉春病毒血癥病毒感染試驗發(fā)現(xiàn)鯉TLR2在鯉上皮瘤細胞內(nèi)過表達可上調(diào)IRF3、IRF7、ISG15、Mx1、PKR和Viperin 等干擾素刺激基因的表達及抑制鯉春病毒血癥病毒的增殖[21]。提示魚類 TLR2 可通過激活I(lǐng)RF3或IRF7信號通路誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，進而誘導(dǎo)一些干擾素刺激基因表達抗病毒蛋白發(fā)揮抗病毒免疫效應(yīng)。褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)中也有相似的研究，感染病毒性出血敗血癥病毒早期階段TLR2基因顯著上調(diào)表達，干擾素調(diào)節(jié)因子IRF3和IRF7也顯示高表達量[22]。利用多態(tài)性微衛(wèi)星標記技術(shù)，發(fā)現(xiàn)TLR2與褐牙鲆對淋巴囊腫病毒的抗性有關(guān)[23]。上述結(jié)果均表明魚類TLR2可參與病毒識別，在魚類抗病毒感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

2.2 TLR3

TLR3在小鼠中可識別雙鏈RNA和Poly (I:C)，誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生。Poly (I:C)刺激TLR3缺陷型小鼠，與野生型小鼠相比，促炎細胞因子及干擾素的表達量明顯降低，表明TLR3參與對Poly (I:C)的識別[24]。魚類中研究也表明，雙鏈RNA病毒和Poly (I:C)的刺激，能夠引起魚類TLR3明顯的上調(diào)表達，進而誘導(dǎo)干擾素的高水平表達。例如Poly (I:C)的刺激能夠引起大黃魚(Pseudosciaenacrocea)脾臟[25]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)頭腎白細胞[26]中TLR3的高水平表達。黑魚彈狀病毒人工感染斑馬魚(Daniorerio)后，傳染性造血壞死病病毒感染虹鱒[26]后，免疫相關(guān)組織及器官TLR3基因顯著性上調(diào)表達。上述結(jié)果均表明魚類TLR3與哺乳動物相同，在識別病毒的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

2.3 TLR4

TLR4在高等動物中能在輔助分子CD14、LBP和MD2參與下識別革蘭氏陰性細菌細胞壁特有成分脂多糖，進而啟動機體的免疫應(yīng)答。此外，TLR4是第一個被認為在宿主防御病毒方面發(fā)揮重要作用的Toll樣受體，其表達能有效控制小鼠體內(nèi)病毒的復(fù)制[30]。Kurt-Jones等[30]研究發(fā)現(xiàn)，TLR4缺陷型小鼠比正常小鼠體內(nèi)呼吸道合胞病毒(RSV)復(fù)制的密度更高，持續(xù)的時間更長。呼吸道合胞病毒感染后，其囊膜上F蛋白引起TLR4與CD14表達上調(diào)，進而誘導(dǎo)促炎細胞因子的大量表達。另有研究表明，相對于正常小鼠，TLR4缺陷型小鼠感染呼吸道合胞病毒后，其NK細胞和CD14+細胞在肺部的轉(zhuǎn)運及NK細胞的功能受損，影響對病毒的清除[19]。

2.4 TLR7和TLR8

TLR7和TLR8主要識別病毒的單鏈RNA，在抗病毒非特異性免疫中發(fā)揮重要作用。另外，TLR7和TLR8也能識別人工合成的具有抗病毒和抗腫瘤活性的低分子量化合物，如雷西莫特(R848和S28463)和咪喹莫特(R837, S26308)及其衍生物，其已被證明可通過誘導(dǎo)內(nèi)源性細胞因子而產(chǎn)生抗病毒活性，常作為TLR7和TLR8的激動劑而進行相關(guān)研究。咪唑并喹啉S-27609為哺乳動物TLR7的配體[42]，在魚類中同樣發(fā)現(xiàn)其具有很強的免疫刺激效應(yīng)。S-27609能夠誘導(dǎo)大西洋鮭(Salmosalar)頭腎與肝臟中TLR7、IFN-α1/α2、IFN-γ、Mx顯著性上調(diào)表達[43]。在鯉魚中也有相似的研究，咪喹莫特刺激后頭腎細胞過表達TLR7，誘導(dǎo)促炎細胞因子及I型干擾素高水平表達[44]。這些為魚類中TLR7介導(dǎo)抗病毒信號通路的存在提供了有力證據(jù)，但是魚類TLR7和TLR8的配體仍不明確。

TLR7與TLR8在配體識別方面可能不盡相同。R848及Poly (I:C)刺激均能誘導(dǎo)虹鱒腎臟白細胞中促炎細胞因子及I型干擾素的高水平表達，但是TLR7和TLR8a1的表達與對照組相比無明顯變化；而R848可引起TLR8a2適度的下調(diào)表達[45]。該研究結(jié)果一方面表明了同源基因功能性的差異，同時也提示魚類與哺乳動物中TLR7和TLR8在配體識別、定位及激活途徑方面均存在一定的差異。草魚呼腸孤病毒感染之后，草魚脾臟中TLR7和TLR8均上調(diào)表達；體外試驗中Poly (I:C)刺激CIK細胞系后，TLR7上調(diào)表達，然而，同樣條件下，TLR8表達量卻顯著性降低[46-47]。TLR8敲除后，機體顯示出對草魚呼腸孤病毒感染的抑制效應(yīng)；另外TLR8沉默的CIK細胞對病毒的抗性很強[47]。以上研究均表明TLR8在抗病毒非特異性免疫中可能發(fā)揮負調(diào)控作用，但目前其作用機制也尚不清楚。

2.5 TLR9

TLR9可識別來自細菌或病毒含有非甲基化CpG基序的DNA短序列(CpG DNA)。用CpG DNA分別刺激野生型小鼠和TLR9缺陷型小鼠，野生型小鼠中促炎細胞因子等顯著上調(diào)表達。而TLR9缺陷型小鼠中，CpG DNA的刺激并未引起其脾淋巴細胞的增殖、巨噬細胞中炎癥因子的產(chǎn)生及樹突狀細胞的成熟等，也未引起血清中任何促炎細胞因子表達水平的顯著升高，即CpG DNA不能引起TLR9缺陷型小鼠產(chǎn)生免疫響應(yīng)[48]。從而表明TLR9是CpG DNA的受體。CpG DNA主要存在于病毒和原核生物中，真核生物中多是甲基化的，因此，TLR9能夠介導(dǎo)機體對外源病原體的識別。外源性的CpG DNA激活細胞之后，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的TLR9通過高爾基體被招募到含這些外源性DNA的溶酶體表面[49-50]。研究發(fā)現(xiàn)人工合成的含非甲基化CpG基序的寡聚核苷酸(CpG ODN)(基于其結(jié)構(gòu)差異分為A、B、C三類)、硫代磷酸酯修飾的穩(wěn)定的寡聚核苷酸(PS-ODNs)或天然存在的磷酸二酯寡聚核苷酸(PD-ODNs)可與TLR9結(jié)合。人類TLR9胞外區(qū)所含的25個亮氨酸富集重重復(fù)基序中，發(fā)現(xiàn)LRR11與CpG寡聚核苷酸之間具有較高的親和力[51]，構(gòu)建的幾何模型顯示二者在交界面上為互補結(jié)構(gòu)[52]。然而，有研究顯示經(jīng)過硫代磷酸酯修飾的配體雖能大量誘導(dǎo)其與TLR9的聚集，但相對于這些非甲基化CpG寡聚核苷酸，TLR9更優(yōu)先識別一些自然彎曲的DNA骨架[53]。因此，TLR9對CpG DNA的特異性識別仍需進一步研究證實。

大量研究已表明，哺乳動物及魚類TLR9在抵御DNA病毒的免疫應(yīng)答中均發(fā)揮重要作用。小鼠基因敲除試驗表明，TLR9識別純化的單純皰疹病毒2型(HSV-2)DNA，引起MyD88的表達，進而誘導(dǎo)漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)中Ⅰ型干擾素及一些細胞因子的分泌。對于其他病毒的感染也有相似的報道，如鼠巨細胞病毒(MCMV)[54]及腺病毒(ADV)[55]等。病毒中非甲基化的CpG DNA序列作為TLR9的配體，激活TLR9介導(dǎo)的抗病毒免疫應(yīng)答，從而清除入侵的DNA病毒。在魚類中，CpG DNA可引起虹鱒[56]、褐牙鲆[57]、尖吻鱸(Latescalcarifer)[58]、太平洋紅笛鯛(Lutjanusperu)[59]等多種魚類的免疫效應(yīng)。其被TLR9識別后，進而激活TLR9介導(dǎo)的抗病毒免疫應(yīng)答。條石鯛虹彩病毒感染后，可引起虹鱒中TLR9表達量增加，魚體內(nèi)病毒拷貝數(shù)下降。研究表明，條石鯛虹彩病毒感染后其相關(guān)組分可引起TLR9的表達，進而通過魚體TLR9介導(dǎo)的信號通路誘導(dǎo)干擾素及促炎細胞因子表達，抑制體內(nèi)病毒的復(fù)制[60]。但是，截至目前，仍缺乏CpG DNA作為TLR9配體的直接證據(jù)。

魚類TLR9對不同CpG DNA的刺激顯示出免疫效應(yīng)差異?；诎唏R魚、褐牙鲆、河鲀等8種硬骨魚TLR9進行分析，發(fā)現(xiàn)有11個正選擇位點，其中有10個與亮氨酸富集重復(fù)結(jié)構(gòu)域相關(guān)，這10個正選擇位點中，有7個與亮氨酸富集重復(fù)結(jié)構(gòu)域所呈現(xiàn)的馬蹄形螺線管狀結(jié)構(gòu)域的凸面相關(guān)，有利于其與PAMPs接觸[61]。硬骨魚TLR9亮氨酸富集重復(fù)結(jié)構(gòu)域正選擇位點的存在，表明其可以感知來自不同細菌或病毒中CpG寡聚核苷酸基序的差異性。后續(xù)試驗也證實了不同硬骨魚類中不同CpG寡聚核苷酸基序顯示出免疫效應(yīng)差異，因而可將其作為一種功能性的免疫增強劑進行研究。繼CpG寡聚核苷酸1668之后，不斷有新型的CpG寡聚核苷酸被研究，比如一種源自黏孢子蟲模擬其SSU rRNA的CpG寡聚核苷酸1013，刺激尖吻鱸后，通過TLR9介導(dǎo)的信號通路，顯著增強鱸魚先天性免疫反應(yīng)，有助于尖吻鱸抵御海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)的感染。且與CpG寡聚核苷酸1668相比，ODN1013具有更強的免疫效應(yīng)[58]。與A類的CpG寡聚核苷酸1585和B類的CpG寡聚核苷酸1668相比，同屬于B類的CpG寡聚核苷酸2007對褐牙鲆具有更好的免疫保護作用[62]。迄今為止，TLR9識別不同類型CpG寡聚核苷酸產(chǎn)生不同免疫響應(yīng)的原因仍不清楚。

由于所用的CpG DNA均為硫代磷酸酯修飾產(chǎn)物，目前也尚未有直接證據(jù)顯示TLR9與CpG DNA直接發(fā)生結(jié)合，TLR9也被認為是修飾基團的受體[63]。

2.6 TLR22

魚類中TLRs種類更多，不僅存在哺乳動物的同源序列，還存在一些魚類特有的TLRs(TLR18-20和TLR23-28)及魚類和其他非哺乳動物共有的TLRs(TLR21和TLR22)。魚類TLR22作為一種非哺乳類的TLR，其作用類似于TLR3，能特異性識別病毒的雙鏈RNA，誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答。這可能是由于魚類生活在水體環(huán)境，常受到病毒的侵襲，在自然選擇作用下保留了雙鏈RNA病毒雙重識別系統(tǒng)[64]。無論在體內(nèi)還是體外試驗中，大菱鲆紅體病虹彩病毒和牙鲆彈狀病毒感染后，大菱鲆免疫器官頭腎和脾臟中TLR22的表達顯著上調(diào)，Poly (I:C)刺激后，TLR22同樣上調(diào)表達，相比之下，脂多糖、肽聚糖感染后TLR22表達則無顯著變化。該結(jié)果為TLR22對雙鏈RNA病毒配體的特異性識別提供了有力證據(jù)[65]。草魚呼腸孤病毒感染CIK細胞后引起TLR22和IFN-β明顯上調(diào)表達，且TLR22過表達的CIK細胞中草魚呼腸孤病毒滴度明顯降低，顯示赤眼鱒(Squaliobarbuscurriculur)TLR22的表達有效抑制了草魚呼腸孤病毒的復(fù)制，在抗草魚呼腸孤病毒感染中發(fā)揮重要作用[66]。源自感染性胰腺壞死病毒和輪狀病毒的雙鏈RNA及其類似物Poly (I:C)均能誘導(dǎo)表達TLR22的RTG-2細胞(虹鱒性腺細胞系)大量產(chǎn)生Ⅰ型干擾素，而對照組中Ⅰ型干擾素的表達量無顯著變化。另外，表達TLR22的RTG-2細胞中感染性胰腺壞死病毒滴度與對照組相比顯著降低[67]。以上研究表明，TLR22參與識別病毒雙鏈RNA，誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素，進而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)。因而，魚類TLR22也被認為是表達于人細胞表面的TLR3的替代者，監(jiān)控雙鏈RNA病毒感染，進而啟動魚類免疫系統(tǒng)抗病毒保護[67]。

最近研究發(fā)現(xiàn)，TLR22不僅參與魚類對病毒的識別和防御，可能在魚類抵御細菌感染的免疫應(yīng)答中也發(fā)揮重要作用。嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)感染南亞野鯪[68]和鯉魚[69]后，均引起TLR22表達響應(yīng)。從嗜水氣單胞菌中提取RNA靜脈注射南亞野鯪，4 h后檢測到TLR22在肝臟、脾臟和腎臟等組織器官中均顯著上調(diào)表達，并且其表達量遠高于脂多糖和Poly (I:C)處理組，甚至高于嗜水氣單胞菌處理組[68]。表明TLR22也能識別細菌胞內(nèi)的RNA。金頭鯛中，鰻弧菌(Vibrioanguillarum)以及源于細菌的病原相關(guān)分子模式(包括脂多糖、DNA和鞭毛蛋白)均能誘導(dǎo)嗜酸性粒細胞和巨噬細胞上調(diào)表達TLR22，而Poly (I:C)卻不能引起嗜酸性粒細胞中TLR22的表達變化[70]。因此，TLR22可識別的配體有待進一步研究證實。

3 病毒感染后啟動TLRs信號通路

病原相關(guān)分子模式與宿主細胞TLR胞外亮氨酸富集重復(fù)結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，TLR被激活，通過胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域招募下游接頭蛋白，以啟動信號通路(圖1)。哺乳動物中，主要有4類接頭蛋白：MyD88、TIRAP(Mal)、TICAM-1/TRIF和TICAM-2/TRAM[71]。硬骨魚中尚未發(fā)現(xiàn)TRAM信號分子[72]。根據(jù)接頭蛋白的不同，魚類TLRs信號通路主要分為2種類型：MyD88依賴型信號通路和MyD88非依賴型(TRIF依賴型)信號通路[73]。其中MyD88依賴型信號通路主要通過誘導(dǎo)促炎細胞因子的產(chǎn)生參與機體對細菌的免疫應(yīng)答，MyD88非依賴型信號通路主要通過誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生參與機體對病毒的免疫應(yīng)答。

3.1 MyD88依賴型信號通路

TLRs(TLR3除外)可通過MyD88依賴型信號通路激活機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。TLR胞外亮氨酸富集重復(fù)結(jié)構(gòu)域與病毒病原相關(guān)分子模式結(jié)合被激活后，通過TIR結(jié)構(gòu)域與MyD88分子C端相互作用，招募下游IRAK4，再激活I(lǐng)RAK1，活化的IRAK1從上游的復(fù)合物上脫落與TRAF6相互作用。TRAF6再與一個由TAK1和其結(jié)合蛋白TAB1和TAB2組成的復(fù)合物相互作用[74]。在此復(fù)合物中，TAB1負責激活TAK1，而TAB2則作為接頭分子連接TRAF6和TAK1從而有助于TAK1的激活[76]。活化的TAK1可激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB或AP-1，誘導(dǎo)促炎細胞因子(如IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α等)的表達[10]。然而點帶石斑魚(Epinepheluscoioides)中發(fā)現(xiàn)IRAK4能夠顯著抑制MyD88誘導(dǎo)的NF-κB的活性[77]，在魚類和哺乳類中功能可能有所不同，魚類IRAK4的功能仍需進一步證實。此外，TLR7、TLR8和TLR9還能以MyD88為接頭蛋白，通過另一條非NF-κB信號通路，即下游IRAK4與TRAF3相互作用，激活TRAK1，再與TRAF6相互作用，最終激活轉(zhuǎn)錄因子IRF7，誘導(dǎo)干擾素的表達，發(fā)揮抗病毒免疫效應(yīng)。TLR2和TLR4與MyD88的結(jié)合需要以TIRAP(Mal)為銜接蛋白[73]。

3.2 MyD88非依賴型信號通路

哺乳動物中TLR3和TLR4均能以TRIF為接頭蛋白，通過MyD88非依賴型信號通路發(fā)揮抗病毒作用。其中TLR4與TRIF的結(jié)合需要TRAM介導(dǎo)[71,78]，但是目前在魚類中尚未發(fā)現(xiàn)此分子，因此魚類TLR4的抗病毒免疫反應(yīng)機制尚需進一步研究。此外，已有研究證實，魚類TLR22也能與接頭蛋白TRIF結(jié)合，啟動MyD88非依賴型信號通路，誘導(dǎo)機體的抗病毒免疫應(yīng)答[67]。此通路中TLR被相應(yīng)的配體激活后，招募TRIF分子，再通過TRAF3激活TBK1，然后TRAF3、TBK1和IKKε復(fù)合體磷酸化轉(zhuǎn)錄因子IRF3，被激活的IRF3轉(zhuǎn)移到細胞核中，啟動I型干擾素的表達[79]。然而目前也有研究發(fā)現(xiàn)，點帶石斑魚白細胞中TLR22可通過接頭蛋白TRIF抑制IFN-β的表達，或以TRIF或MyD88為接頭蛋白負調(diào)控NF-κB、JNK和P38信號通路，僅ERK通路受其正調(diào)控進而誘導(dǎo)AP-1的表達[80]。因而魚類TLR信號通路的傳導(dǎo)及調(diào)控仍存在爭議。此外，哺乳動物中TRIF也能與TRAF6和RIP1相互作用，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB或AP-1，誘導(dǎo)促炎細胞因子的表達[24,81]。但在斑馬魚中TRIF不能與TRAF6相互結(jié)合[82]，魚類以什么機制完成TRIF和RIP1對NF-κB的激活也不清楚。

圖1 Toll樣受體信號通路(改自文獻[8,68])

4 結(jié) 語

隨著魚類基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和生物信息學研究的深入，從魚類中鑒定到的TLRs種類逐漸增多，對于這些TLRs的分子特征和生物學功能的研究，豐富了人們對于非特異免疫系統(tǒng)的認識，也為一些細菌或病毒性疾病的防治提供了理論基礎(chǔ)及新的思路。然而，目前魚類已發(fā)現(xiàn)的22種TLRs，僅TLR2、TLR3、TLR5M、TLR5S、TLR21、TLR22的配體初步得到證實，其他配體還需進一步研究。魚類TLRs配體特異性識別及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控機制尚不完全清楚，仍需深入研究。魚類相對于哺乳動物，參與病毒識別的TLRs數(shù)量更多，對于魚類中特有的TLR基因在魚類免疫應(yīng)答中的作用與功能研究需進一步開展。病毒一般在侵入細胞后，其核酸成分被胞內(nèi)相應(yīng)TLRs識別，入胞之前一些病毒的囊膜成分也是細胞表面TLRs的識別對象，而識別的具體成分仍缺少相關(guān)研究。對與TLRs作用的相關(guān)基因和蛋白進行解析，并利用蛋白質(zhì)互作技術(shù)和激光共聚焦顯微技術(shù)等，對TLRs的識別，信號通路上的蛋白相互作用進行研究，以此弄清TLRs及其信號通路調(diào)控的分子機制，有助于深入理解魚類抗病機制。同時，也為新型藥物、新型疫苗及免疫調(diào)節(jié)劑的研發(fā)提供理論依據(jù)和新的思路。