松藻主要生物活性物質研究進展

胡 月，彭雍博，張雪楠，王俊鑫，何云海，汪秋寬

( 大連海洋大學 食品科學與工程學院，國家海藻加工技術研發(fā)分中心，遼寧水產品加工及綜合利用重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

松藻是松藻屬(Codium)藻類的總稱，屬綠藻門、綠藻綱、管藻目、松藻科[1]，是一種世界性泛暖溫帶綠藻[2]，其藻體呈黑綠色，呈叉狀分支[3]。松藻屬藻類共計50余種，我國沿海則有刺松藻(C.fragile)、長松藻(C.cylinricum)、杰氏松藻(C.geppii)、平臥松藻(C.repens)等11種，主要分布于南海沿岸[4-5]。據《中國海藻志》記載，松藻具有清熱解毒、消腫利尿、驅蟲、清腸胃等功效[6]?；境煞盅芯勘砻鳎稍逶弩w中含有豐富的糖類、蛋白質、脂肪酸及微量元素等。松藻多糖主要有3種，分別為位于細胞間質中的水溶性硫酸多糖，由木聚糖或甘露聚糖構成的細胞壁微纖維和細胞質內少量的其他多糖。松藻蛋白氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，松藻蛋白主要由天冬氨酸、谷氨酸等18種氨基酸組成，其中蘇氨酸等8種必需氨基酸約占氨基酸總含量的45%。此外，松藻中不飽和脂肪酸含量較高，約占脂肪酸含量的50%。松藻還含有豐富的微量元素，尤以Cu、Fe、Zn為主[7-10]。松藻作為重要的海洋藥物資源，含有豐富的多糖、糖蛋白、甾醇類、萜類、管藻黃素、纖溶酶等活性物質，具有抗凝血、抗病毒、免疫調節(jié)、抗腫瘤等功效[11-19]，而對其生物活性物質的提取、結構解析和構效關系等研究鮮有報道。

松藻本源可能是日本，而現(xiàn)今已遍布世界多地，包括英國、美國、澳大利亞、智利、新西蘭等地[20-24]。其中，刺松藻繁殖力強，并具有寬泛的環(huán)境適應力和耐受力，可與其他物種競爭光照、營養(yǎng)以及空間資源，所以刺松藻被認為是松藻屬中威脅生態(tài)系統(tǒng)的主要物種之一[25-26]。Hanisak[27]對刺松藻生長的影響因素研究發(fā)現(xiàn)，刺松藻在6～33 ℃能夠正常生長，而環(huán)境鹽度要求主要依賴于溫度條件，即當溫度不利于其生長時，適應鹽度范圍變小，溫度利于其生長時，鹽度范圍適量變大。另外，光照和溫度對刺松藻的生長的影響則存在交互效應，即藻體在高溫度低光照下會出現(xiàn)光飽和現(xiàn)象，抑制藻體的生長。Gerard等[28]研究則證明，硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽或尿素等，均可以作為松藻的良好的氮源，因此近海水體富氮為松藻的生長提供了適宜的繁殖環(huán)境。筆者對松藻生物活性物質提取工藝、結構解析、生物活性、應用等方向進行概述，以期為松藻的綜合開發(fā)提供理論支持。

1 松藻多糖提取及其活性研究

1.1 松藻多糖提取工藝

目前，松藻多糖的提取方法主要有水提法、堿提法和酶提法。水提法主要分為冷水提法和熱水提法。其中熱水提法作為植物多糖提取的經典方法，常被應用于海藻粗多糖的提取。此法成本低，操作簡便，但提取率低、純度低、活性損失較大、提取時間長，難以應用于海藻多糖的規(guī)模化生產[29]。熊皓平等[30]通過單因素及正交試驗優(yōu)化了長松藻多糖水提法提取工藝，最佳提取條件為：提取溫度95 ℃、提取時間1.5 h、料水比1∶50(m∶m)，多糖得率為9.79%。此外，于廣利等[31]分別通過冷水和熱水提取刺松藻多糖，經分離純化后得到11種組分，測定結果證明熱水提取組分比冷水提取組分的分子量大，葡萄糖含量高，但硫酸基含量較低。

堿提法是通過堿液作用使藻類細胞吸水膨脹破裂，游離出多糖。此法能夠明顯提高多糖提取率，但多糖的結構和活性易遭受破壞，這限制了堿提法的推廣應用，但近年來也有相應的改進工藝應用[32]。李娜[33]依次采用冷水、熱水、和0.50 mol/L NaOH溶液提取叉開松藻(C.divaricatum)多糖，多糖得率可達20.67%，此法不僅可以提取細胞間質細胞內的多糖，還可以進一步提取酸性多糖，同時避免了堿提法對多糖結構的破壞。

酶提法以熱水浸提法為基礎，輔以酶制劑提取海藻多糖，此法綠色環(huán)保、簡易、快捷，已被運用于陸地及海洋中多種生物活性物質的提取[34]。Rodrigues等[35]發(fā)現(xiàn)，酶解法的軟毛松藻(C.tomentosum)多糖提取率高于水提法，纖維素酶和戊聚糖聚合酶的松藻多糖提取率可達60%和62%。Kulshreshtha等[36]分別比較了水提法和酶解法提取刺松藻多糖發(fā)現(xiàn)，酶解法能顯著提高多糖提取率，且酶提法相較于水提法，不僅提取率提高了20%～35%，且能夠促進蛋白質、中性糖、尿酸和硫酸鹽的恢復，對抗單純皰疹病毒的活性也顯著提高。但目前對松藻多糖的酶解法提取的研究較少，未來仍需加強松藻多糖酶解法的研究。

綜上所述，松藻多糖的提取技術相對單一，僅有水提法、堿提法以及酶提法被應用于松藻多糖的提取。對于現(xiàn)階段被廣泛利用的微波輔提法、超臨界流體萃取法以及多種簡單方法的聯(lián)用技術在松藻多糖中的應用尚未見報道，因此仍需要廣大科研工作者進一步探索[37]。

1.2 松藻多糖結構解析

松藻多糖主要分布在植物細胞壁中，另有少量分布于細胞質內。細胞壁中的松藻多糖主要由木聚糖或甘露聚糖組成，細胞質內的松藻多糖多為葡聚糖[38]。此外，松藻多糖的基本組分和單糖組成因藻種、提取方法的不同表現(xiàn)出顯著性差異(表1)。馮以明[39]對刺松藻等中提取的多糖研究發(fā)現(xiàn)，與其他藻類及陸生植物的細胞壁組分不同，β-D-1,4-甘露聚糖是松藻細胞壁微纖維的主要成分。此外，水溶性硫酸化多糖作為松藻多糖的主要活性成分分為兩種：一種是硫酸阿拉伯聚糖，另一種是硫酸阿拉伯半乳聚糖[40]。早期，Love等[41]指出，松藻多糖主要由硫酸化的阿拉伯半乳聚糖、甘露聚糖以及淀粉組成。隨著松藻多糖結構研究的不斷深入，邱玉明[42]通過氣相色譜法發(fā)現(xiàn)，長松藻的主要單糖組成依次為半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖及葡萄糖，同時還含有少量的鼠李糖；PMP柱前衍生高效液相色譜研究結果同樣表明，叉開松藻多糖的單糖組成為半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖，研究結果還發(fā)現(xiàn)叉開松藻多糖的主要單糖阿拉伯糖和半乳糖的構型分別為L和D[33]。Konstantina等[13]采用氣質聯(lián)用技術分析刺松藻多糖也證明，松藻多糖主要是由半乳糖和阿拉伯糖組成，同時還含有少量的葡萄糖、阿洛糖(葡萄糖的C-3差向異構體)、阿卓糖(甘露糖的C-3差向異構體)、甘露糖、木糖和鼠李糖。

傅里葉紅外光譜技術對長松藻多糖的結構研究則發(fā)現(xiàn)，長松藻多糖不僅具有一般多糖的紅外吸收峰，在845 cm-1和820 cm-1處還有C4和C2位置的硫酸根特征吸收峰，結果證明松藻多糖是一種硫酸化多糖[42]。Ciancia等[43]的核磁氫譜及碳譜研究表明，刺松藻多糖同時含有α和β半乳吡喃糖環(huán)。Fernández等[44]則指出，松藻多糖空間結構復雜，至少含有3種類型，即高度硫酸化和丙酮酸化的β(1→3)-D半乳聚糖、硫酸化的β(1→3)-L阿拉伯聚糖和β(1→4)-D甘露聚糖。Farias等[45]對腰肢松藻(C.isthmocladum)的研究發(fā)現(xiàn)，腰肢松藻中硫酸化半乳糖主要由C4位置連接硫酸根基團的3-β-D-吡喃半乳糖組成。Fernández等[46]對蟲狀松藻(C.vermilara)細胞壁多糖分析結果則表明，蟲狀松藻多糖23%的甘露糖的C2位置鏈接硫酸根基團。

1.3 松藻多糖的活性

松藻多糖具有較強的抗凝血作用，早期研究表明，硫酸化的海藻多糖一般具有較強的心血管疾病治療效果，同樣松藻多糖作為一種硫酸化的多糖，其抗凝血活性已被大量文獻報道。Hiral等[11]發(fā)現(xiàn)，松藻多糖可以顯著延長活化部分凝血活酶時間、血漿凝血酶原時間，分別延長18.6%、10.3%，同時對血小板聚集抑制率可達35.7%。Jurd等[47]也將活化部分凝血活酶時間、血漿凝血酶原時間、凝血酶時間作為評價指標，對刺松藻多糖體外抗凝血活性做出評價。結果表明，刺松藻多糖的抗凝血效果與其含量和硫酸根含量有關，且抗凝機制主要是通過增強肝素輔酶Ⅱ和抗凝血酶Ⅲ的活性。Matsubara等[48]則發(fā)現(xiàn)，長松藻中提取的硫酸化半乳聚糖能夠延長活化部分凝血活酶時間、凝血酶時間，而血漿凝血酶原時間不受影響，同時研究也指出，長松藻多糖的抗凝血活性類似于肝素，但弱于肝素，且這種作用機制主要是通過抑制纖維蛋白聚合物或內源性凝血。而Siddhanta等[40]比較來源自松藻(C.dwarkense)的硫酸化阿拉伯聚糖和硫酸化阿拉伯半乳聚糖的抗凝血活性發(fā)現(xiàn)，同質量濃度下松藻硫酸化阿拉伯聚糖的抗凝血效果優(yōu)于硫酸化阿拉伯半乳聚糖。

研究發(fā)現(xiàn)，松藻多糖具有廣泛的病毒抑制作用[49]。邱玉明[42]對長松藻多糖的體外抗病毒活性進行研究發(fā)現(xiàn)，長松藻多糖對單純皰疹病毒Ⅰ型、柯薩奇病毒B3型均有一定抵抗作用，其半抑制質量濃度分別為7.81、3.91 μg/mL。Lee等[50]的體外抗病毒活性試驗表明，扁平松藻(C.adhaerens)中的硫酸化阿拉伯糖同樣具有抗病毒活性，對單純皰疹病毒Ⅰ型的半抑制質量濃度值為6.90 μg/mL，且藥敏試驗表明，扁平松藻多糖對侵入宿主細胞的單純皰疹病毒Ⅰ型也具有抑制作用；后續(xù)研究指出，扁平松藻硫酸化阿拉伯糖的抗病毒活性主要與硫酸根含量有關。Ohta等[12]對刺松藻硫酸化半乳糖的抗病毒研究結果證明，該糖不僅可以抑制單純皰疹病毒Ⅱ型的復制，也可直接減少單純皰疹病毒Ⅱ型的感染率。

刺松藻多糖具有顯著的免疫調節(jié)活性，不僅可以激活非特異性免疫系統(tǒng)(促進巨噬細胞、自然殺傷細胞增殖)、還可以誘導特異性免疫系統(tǒng)(促進B細胞、T細胞增殖分化，及效應B細胞、效應T細胞活力)[51]。Konstantina等[13]通過Westblot試驗比較了刺松藻多糖和肝素對細胞因子IL-2、IL-7和INF-γ的作用效果發(fā)現(xiàn)，刺松藻多糖可抑制IL-2、IL-7和INF-γ的產生，抑制率分別為59%、58%和40%。Lee等[52]指出，松藻中的丙酮酸化硫酸半乳糖能夠刺激NO的產生，同時還能促進促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α和抗炎因子IL-10產生，說明該多糖可以激活巨噬細胞產生體外免疫。

作為純天然多糖，刺松藻多糖具有抗腫瘤作用。吳榮杰等[4]在研究刺松藻多糖對肺癌A549細胞體內和體外的抑制效果時發(fā)現(xiàn)，1000 μg/mL的刺松藻多糖對A549細胞生長體外抑制率為21%，同時能顯著增強淋巴細胞增殖和巨噬細胞吞噬活性；動物試驗結果則證明，刺松藻多糖對荷瘤小鼠的抑瘤率最高為43%。王培勝等[14]研究刺松藻多糖對小鼠肝癌細胞Hca-F的生長抑制作用機制研究結果表明，200 mg/kg的刺松藻多糖對小鼠Hca-F細胞的抑制率可達31.93%，分析認為可能與該多糖提高了荷瘤小鼠機體的免疫活性有關。

松藻多糖還具有抗血管生成、吸濕保濕以及抗氧化等生物活性。Matsubara等[53]證實，長松藻多糖能夠在無血清基質培養(yǎng)模型中抑制大鼠主動脈微血管的生成，而5 μg/mL時能顯著抑制人臍靜脈內皮細胞在重組基底膜凝膠上的形成。宋厚芳[9]則指出，刺松藻多糖具有吸濕保濕作用，且保濕效果與多糖硫酸根含量呈正相關；同時也發(fā)現(xiàn)，刺松藻多糖還具有較高的抗氧化活性，對超氧自由基、羥基自由基的清除能力均高于同劑量水平下的維生素C。

2 其他生物活性物質研究

除多糖以外，松藻中的糖蛋白也具有抗氧化、抗凝血等功效。Senthilkumar等[54]的抗氧化研究表明，刺松藻糖蛋白對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、羥基自由基、超氧自由基、NO均具有較強的清除能力，清除率分別為33.94%、31.80%、18.10%和27.43%，且清除效果隨著質量濃度的增大而增強。Jurd等[15]從刺松藻中分離出一種高分子量的硫酸化糖蛋白，抗凝研究發(fā)現(xiàn)，松藻糖蛋白能夠通過增強肝素輔因子Ⅱ和抗凝血素Ⅲ活性呈現(xiàn)抗凝功效，且這種抗凝血作用與藥物含量及硫酸根含量成正比。Thangam等[16]研究了脫皮松藻(C.decorticatum)糖蛋白的抗腫瘤作用，結果表明，脫皮松藻糖蛋白可以通過誘導人乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡降低腫瘤細胞活力，其半抑制質量濃度為55 μg/mL。Tabarsa等[17]則探索了刺松藻糖蛋白與免疫調節(jié)活性間的關系，結果表明，糖蛋白缺少蛋白部分則不能刺激RAW264.7細胞釋放NO，同樣單一的蛋白組分也不能對RAW264.7細胞產生顯著的刺激作用，這證明松藻硫酸化蛋白質的這種特殊空間構型能對其免疫調節(jié)活性產生決定性作用。

松藻中存在的甾醇類物質也是一種具有良好生物功能的物質。Kim等[18]研究發(fā)現(xiàn)，刺松藻中的赤桐甾醇可以通過誘導黑色素瘤A2058的凋亡發(fā)揮抗腫瘤功效，其半抑制濃度僅為150 μmol/L。Ali等[55]在對松藻中具有抗菌活性物質篩選時發(fā)現(xiàn)，松藻(C.iyengarii)中的類固醇類物質以及兩種甾體苷均具有一定的抗菌活性，特別是甾體苷iyengaroside-A和甾醇半乳糖苷的抗菌效果最佳，對大腸桿菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)、白喉桿菌(Corynebacteriumdiptheriae)、痢疾志賀菌(Snigelladysentri)等均有抑制作用，且效果優(yōu)于抗菌藥物四環(huán)素。Lee等[56]的體內和體外試驗表明，刺松藻中提取的甾醇類物質對紫外線誘導的促炎反應和氧化反應均具有抑制作用，能夠減少促炎蛋白如COX-2、iNOS、TNF-α等的表達，有效抑制促炎中介物PGE2、NO的產生，同時還可以抑制脂質過氧化、蛋白質羰基化。

另外，對松藻藻管黃素、纖溶酶的生物活性也有報道。Ganesan等[57]對刺松藻管藻黃素抗血管生成的研究中發(fā)現(xiàn)，其能顯著抑制人臍靜脈細胞增殖，在10 μmol/L時對人臍靜脈細胞抑制率高達44%，濃度為25 μmol/L時無血管生成。此外，Choi等[19]指出，刺松藻中的纖溶酶能夠延長活化部分凝血活酶時間和血漿凝血酶原時間，并且血小板功能分析結果表明，纖溶酶還可以延長凝血時間，具有很好的溶栓、抗凝血、抗血小板生成活性。殷帥文等[58]對刺松藻提取物的抑菌活性研究發(fā)現(xiàn)，刺松藻提取物對枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)有一定的抑制活性(質量濃度6 mg/mL時，抑菌圈直徑為11 mm)，經鑒定這種抑菌活性物質為植醇乙酸酯。

綜上可知，松藻多糖的生物活性研究雖然是現(xiàn)階段的主要研究方向，但對其活性的探索尚不夠深入，對其抗氧化、抗炎癥、免疫調節(jié)等生物活性的探索仍處于初級階段。同時，對松藻中其他活性成分(蛋白、甾醇、管藻黃素等)提取工藝、結構解析、生物活性研究鮮有報道，這將成為未來松藻生物活性物質研究的重點方向之一。

3 松藻的應用潛力

作為富含多種生物活性物質的綠藻，松藻具有較大的生物醫(yī)學和日用化工應用潛力。Griffin等[59]將刺松藻凝集素與膠體金耦合成凝集素—金結合物，綁定到人A1型血紅細胞膜后，該復合物可以增強細胞在透射電子顯微鏡下觀察效果，因此可應用于動物細胞組織的表面形態(tài)研究。另外，松藻還具有很強的金屬吸附能力，Kannan等[60]利用這一特點開發(fā)出松藻(C.capitatum)水提物合成銀納米顆粒，合成物中銀的含量可達63.7%，該銀納米顆粒具有抗菌、抗病毒活性，可用于非標記比色法檢測酶促反應、抗菌水過濾器、金屬催化、生物感應器等，具有安全、無毒、綠色環(huán)保等特點。張全斌等[61]根據松藻多糖對經典途徑和旁路途徑補體活性均具有顯著的抑制作用，能夠抑制補體系統(tǒng)的過度激活的特點，制備了一種松藻多糖抗補體藥物，該藥物對于由補體系統(tǒng)過度激活而導致的統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、急性呼吸窘迫綜合征等多種疾病具有較好的預防和治療效果。France[62]則研發(fā)出一種治療女性停經前以及更年期的皮膚潮熱或熱閃光病癥的外敷藥物，該藥物主要成分為刺松藻提取物，可應用于易受刺激的臉部和人體上部。Morishima等[63]根據海藻多糖的抗炎作用，將海藻多糖裂解產物(含刺松藻多糖)添加至牙膏中，制備出用于治療牙周疾病的牙膏，并已投向市場。此外，劉德海等[64]公布了一種含有軟毛松藻提取物的防曬化妝品，該化妝品不僅能有效降低有機防曬劑給人體帶來的刺激和過敏反應，還能在防曬同時修復損傷皮膚，為皮膚補充水分。

松藻也可應用于農業(yè)、水產、食品工業(yè)。據聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織統(tǒng)計，每年全球海藻產量數(shù)千萬噸，其中有很大一部分用于農業(yè)及園藝的生物肥料[65]。由于海藻提取物富含氮、鎂、鉀等植物生長所必需的微量元素以及植物生長激素、細胞分裂素、脫落酸、乙烯、多胺和甜菜堿等成分[66-67]，可促進種子發(fā)芽、幼苗生長，提高植物的環(huán)境耐受力[68]。因此，海藻提取物具有應用于生物肥料的潛力。Eldin等[69]將軟毛松藻和馬尾藻水提物混合液作用于小麥種子，研究證明，小麥種子經含量為20%的水提物混合液作用后，其發(fā)芽率高達98%，并且與空白對照組相比，麥芽長度、根部長度及種子的濕質量和干質量均顯著增加。此外，松藻還可用于赤潮的預防、控制和減緩，赤潮對近海水域生態(tài)環(huán)境和沿海水產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展造成了極大的威脅，傳統(tǒng)上利用化學藥物殺滅赤潮生物，不利于經濟效益和環(huán)境保護[70]，浦寅芳等[71]對刺松藻甲醇提取物的抑藻活性檢測結果表明，當質量濃度為4.0 mg/mL時，刺松藻甲醇提取物可以明顯抑制有毒赤潮藻類米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)的生長，抑制率可達76.5%。在水產養(yǎng)殖領域，松藻則可作為重要的天然餌料，潘忠正等[72]指出，刺松藻作為鮑的天然餌料，鮑殼日增長97 μm，高于裙帶菜和皺海帶為餌料的鮑，因此以刺松藻為餌料不僅解決了水產品養(yǎng)殖業(yè)在夏、秋季缺少優(yōu)質餌料的困難，也縮短了鮑的養(yǎng)殖周期，同時這也為解決松藻藻華提供新的思路。隨著對松藻研究的不斷深入，松藻還可應用于食品工業(yè)，Ana等[73]將軟毛松藻和蟲狀松藻提取物作為可食用膜的成分用于微加工食品的保鮮，發(fā)現(xiàn)涂膜后的微加工食品可在(4±2) ℃條件貯存20 d，有效維持食品的品質，無酶促褐變引起的組織變軟或表面褐變。

4 松藻屬藻類開發(fā)利用價值展望

松藻繁殖力強、營養(yǎng)豐富，是具有開發(fā)潛力的綠藻，然而我國對松藻資源及其生物活性物質開發(fā)利用程度尚處于初級階段。目前，日本、韓國等國家已將松藻作為食品、化妝品的重要原料開發(fā)出多種上市產品，我國對松藻產品的開發(fā)利用卻鮮有報道。另外，松藻因其廣泛的環(huán)境適應力和快速的繁殖力，已成為威脅各國近海生態(tài)系統(tǒng)平衡的關鍵因素之一。面對日趨嚴重的能源及糧食危機，將松藻應用于農業(yè)、水產養(yǎng)殖業(yè)及食品加工業(yè)，是松藻資源綜合利用的最佳選擇。同時，應進一步加強對松藻多糖、蛋白質、甾醇等生物活性探索，特別是分離純化后單一組分功能性結構解析、構效關系及活性作用機制研究，以期開發(fā)出治療效果好、副作用低的天然活性物質醫(yī)藥保健產品。

表1 松藻多糖基本組分及其單糖組成分析

注：Gal：半乳糖，Ara：阿拉伯糖，Man：甘露糖，Glc：葡萄糖，Xyl：木糖，Rha：鼠李糖，F(xiàn)uc巖藻糖，AnGal：脫水半乳糖.